小儿急性白血病IgH基因重排
作者：李戈 符仁义 廖清奎 李兰 郭俊可
单位：610072 四川省人民医院(李戈、李兰)；华西医科大学附属第二医院(符仁义、廖清奎)；唐山市中医院(郭俊可
关键词：
中华儿科杂志/980326 微量残留病(MRD)是导致急性淋巴细胞白血病(ALL)复发的根本原因，但临床难以检测<1%的残留白血病细胞。我们采用基因重排原理，利用聚合酶链反应(PCR)技术检测25例B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿免疫球蛋白重链(IgH)基因，以探讨其临床应用价值。
材料和方法：25例B-ALL患儿骨髓标本取自1994～1996年四川省人民医院和华西医科大学附属第二医院。全部经形态学和免疫分型确诊。标本经预处理提取DNA后进行PCR检测，3对引物VH1、VH3、VH4/JH均由芬兰赫尔辛基大学中心医院分子基因研究室Stenman赠送，反应条件参照Syvnen等[1]报道方法加以改良，反应总体积为100 μl，含模板DNA 100 ng。96℃预变性5 min后进入以下循环：94℃ 1 min，66℃ 1 min，72℃ 1 min，共30周期。取15 μl PCR产物在含溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶中电泳，80 V 2小时，紫外分析仪观察照相和分析结果。DNA印迹法采用7 μg DNA由Bgl Ⅱ限制性内切酶消化18小时，Southern blot按标准方法进行[2]，探针HUJH-Bam-Hd3亦由Stenman赠送。
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结果：1.ALL的IgH基因克隆检测：25例小儿B-ALL(初诊或复发)骨髓细胞DNA作IgH-PCR检测，19例(76%)可见一条或两条特异性扩增带。其中引物VH1/JH扩增的阳性率占绝大多数(18例，95%)。1例VH1阴性，用引物VH3/JH扩增出重排克隆。VH1阴性标本用引物VH4/JH扩增均未见重排克隆。1例慢性淋巴细胞白血病DNA(阳性对照)用引物VH1/JH扩增出一条110 bp特异条带。2例正常人DNA未见扩增条带。Southern blot检测重排克隆19/20(95%)，其中阳性的19例做IgH-PCR，阳性率为79%，表明两种方法有相关性。
2.IgH-PCR的敏感性：为确定IgH-PCR技术对ALL随访的价值，我们测定了B系克隆的敏感性。在正常人模板DNA中掺入已稀释的不同浓度的B-ALL(病例10，初诊时)的DNA(按100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.2%比例掺入)。用引物VH1/JH扩增后，琼脂糖电泳可见克隆性条带的梯度变化。在含0.5%的白血病细胞DNA时，仍可见较强的阳性带。
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3.IgH-PCR检测残留白血病细胞：我们对25例患儿均进行了完全缓解(CR)后的随访观察，特别是对复发病例的随访观察。19例PCR阳性的平均随访时间为11个月(2～25个月)，在11例17次复发中有8例10次复发，IgH阳性克隆检出先于形态学复发。提示IgH-PCR预测复发的阳性率为80%。11例17次复发的阳性检出率为59%。IgH-PCR克隆检出先于形态学复发的平均时间为10周(1～28周)。随访中未复发的病例作PCR扩增无重排克隆。
讨论：ALL是儿童最常见的白血病，其中B-ALL又占了绝大多数。分子生物学技术证明，当多能干细胞向B细胞分化时，最早出现的可被检测出的变化是IgH基因的重排。IgH基因V-D-J片段的重排是产生抗体多样性和特异性的主要机理。不同的B细胞克隆发生不同类型的重链基因重排。由于恶变B细胞通常是一个细胞恶性增生的结果，IgH基因重排呈单克隆，可以作为淋巴系统肿瘤克隆的特异性基因标志。我们应用B-ALL中常见类型的引物，对25例B-ALL患儿IgH重排的PCR检测，表明IgH-PCR技术简便、特异，可用于ALL的随访和复发的监测，特别对于细胞形态学完全缓解(CR)或临界CR，但IgH-PCR为阳性的病例的监测具有重要临床价值。
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参考文献
1 Syv
nen AC, Aalto-Setala K, Kontula K, et al. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E. Genomics, 1990; 8:684-692.
2 Vandenplas S, Wild I, Grobler-Rabie A, et al. Blot hybridisation analysis of genomic DNA. J Med Genet, 1984; 21:164-171., http://www.100md.com
单位：610072 四川省人民医院(李戈、李兰)；华西医科大学附属第二医院(符仁义、廖清奎)；唐山市中医院(郭俊可
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中华儿科杂志/980326 微量残留病(MRD)是导致急性淋巴细胞白血病(ALL)复发的根本原因，但临床难以检测<1%的残留白血病细胞。我们采用基因重排原理，利用聚合酶链反应(PCR)技术检测25例B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿免疫球蛋白重链(IgH)基因，以探讨其临床应用价值。
材料和方法：25例B-ALL患儿骨髓标本取自1994～1996年四川省人民医院和华西医科大学附属第二医院。全部经形态学和免疫分型确诊。标本经预处理提取DNA后进行PCR检测，3对引物VH1、VH3、VH4/JH均由芬兰赫尔辛基大学中心医院分子基因研究室Stenman赠送，反应条件参照Syv
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结果：1.ALL的IgH基因克隆检测：25例小儿B-ALL(初诊或复发)骨髓细胞DNA作IgH-PCR检测，19例(76%)可见一条或两条特异性扩增带。其中引物VH1/JH扩增的阳性率占绝大多数(18例，95%)。1例VH1阴性，用引物VH3/JH扩增出重排克隆。VH1阴性标本用引物VH4/JH扩增均未见重排克隆。1例慢性淋巴细胞白血病DNA(阳性对照)用引物VH1/JH扩增出一条110 bp特异条带。2例正常人DNA未见扩增条带。Southern blot检测重排克隆19/20(95%)，其中阳性的19例做IgH-PCR，阳性率为79%，表明两种方法有相关性。
2.IgH-PCR的敏感性：为确定IgH-PCR技术对ALL随访的价值，我们测定了B系克隆的敏感性。在正常人模板DNA中掺入已稀释的不同浓度的B-ALL(病例10，初诊时)的DNA(按100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.2%比例掺入)。用引物VH1/JH扩增后，琼脂糖电泳可见克隆性条带的梯度变化。在含0.5%的白血病细胞DNA时，仍可见较强的阳性带。
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3.IgH-PCR检测残留白血病细胞：我们对25例患儿均进行了完全缓解(CR)后的随访观察，特别是对复发病例的随访观察。19例PCR阳性的平均随访时间为11个月(2～25个月)，在11例17次复发中有8例10次复发，IgH阳性克隆检出先于形态学复发。提示IgH-PCR预测复发的阳性率为80%。11例17次复发的阳性检出率为59%。IgH-PCR克隆检出先于形态学复发的平均时间为10周(1～28周)。随访中未复发的病例作PCR扩增无重排克隆。
讨论：ALL是儿童最常见的白血病，其中B-ALL又占了绝大多数。分子生物学技术证明，当多能干细胞向B细胞分化时，最早出现的可被检测出的变化是IgH基因的重排。IgH基因V-D-J片段的重排是产生抗体多样性和特异性的主要机理。不同的B细胞克隆发生不同类型的重链基因重排。由于恶变B细胞通常是一个细胞恶性增生的结果，IgH基因重排呈单克隆，可以作为淋巴系统肿瘤克隆的特异性基因标志。我们应用B-ALL中常见类型的引物，对25例B-ALL患儿IgH重排的PCR检测，表明IgH-PCR技术简便、特异，可用于ALL的随访和复发的监测，特别对于细胞形态学完全缓解(CR)或临界CR，但IgH-PCR为阳性的病例的监测具有重要临床价值。
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参考文献
1 Syv
nen AC, Aalto-Setala K, Kontula K, et al. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E. Genomics, 1990; 8:684-692.2 Vandenplas S, Wild I, Grobler-Rabie A, et al. Blot hybridisation analysis of genomic DNA. J Med Genet, 1984; 21:164-171., http://www.100md.com