早产儿脐带血单核细胞白细胞介素表达状态的研究
作者：刘方 张平 曾超美 唐军 王申五
单位：100044 北京医科大学第二临床医学院附属人民医院儿科(刘方、曾超美)，血研所(张平、王申五)，妇产科(唐军)
关键词：
中华儿科杂志/980819 白细胞介素-6(IL-6)是多功能细胞因子，即可以刺激B细胞产生抗体，又可以刺激T细胞的增殖分化。为研究分娩时早产儿及新生儿IL-6水平，应用常规测定脐血IL-6浓度，特别对于早产儿IL-6血浆低于0.5 μg/L时难以测定。因此，作者应用原位杂交的分子生物学技术，检测早产儿及足月儿脐血单个核细胞(CBMC)IL-6 mRNA自然表达状态，以探讨早产儿免疫功能。
资料及方法：
1.标本来源：标本来源于1994年10月～1996年10月，在本院妇产科自然分娩的早产儿18例，胎龄31～36周，体重2 080±586 g；足月儿20例，胎龄37～42周，体重3 587±269 g。以上病例产妇在3天前均无发热、寒战及血象明显增高现象，脐带血培养均阴性。
2.mRNA原位杂交：(1)随机引物标记生物素IL-6 cDNA，采用常规方法，IL-6 cDNA片段为1.2 kb(由北京医科大学马大龙教授提供)。(2)标本制备：常规无菌取脐带静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离CBMC，滴在载玻片上，用多聚甲醛一戊二醛固定65℃30分钟。(3)杂交前处理：标本经10 μg/L蛋白酶K消化，酒精梯度脱水，室温晾干。(4)载玻片上滴含有生物素标记IL-6 cDNA探针杂交液(20%硫酸葡聚糖/甲酰胺2×杂交缓冲液氧钒苷复合物RVC)42℃温盒过夜。(5)杂交后处理：常规洗片，用碱性磷酸酶SA-AP 37℃30分钟，NBT/BCIP显色2～3小时，0.5%核固红复染后镜下观察，细胞图像扫描100个细胞(北京医科大学细胞图像扫描室)测定积分光密度(IA)。(6)阴性对照：杂交前标本经RNase处理杂交液中不加生物素化IL-6探针。
结果：早产儿的IA为18 511±3 649，足月儿为32 078±2 416，早产儿自然表达明显低于足月儿，差异有非常显著意义(t=3.92，P<0.001)。
讨论：新生儿，特别是未成熟儿，其产生抗细菌抵抗能力低下，在受到感染后，其成熟B淋巴细胞产生抗体能力低下，而T细胞又处于成熟障碍，同时造血细胞进入循环池呈延迟现象。IL-6在促进B细胞产生抗体、调节粒细胞功能方面具有重要作用。本研究结果表明，自然分娩早产儿，其IL-6 mRNA在CBMC内自然表达状态明显低于足月新生儿，机理尚不清。Keneth等研究发现，在早产儿CBMC及足月儿CBMC受到LPS及IL-1刺激后，早产儿CBMC IL-6蛋白质及mRNA在细胞内含量明显低于足月新生儿。早产儿CBMC自然状态IL-6 mRNA低水平表达与其抗体产生和中性粒细胞功能暂时性低下的关系，有待于进一步研究。
作者认为，应用细胞原位杂交技术检测mRNA基因表达具有直观性，应用细胞图像分析技术，可以进行细胞水平的半定量分析，细胞图像分析较斑点杂交更为敏感。, http://www.100md.com
单位：100044 北京医科大学第二临床医学院附属人民医院儿科(刘方、曾超美)，血研所(张平、王申五)，妇产科(唐军)
关键词：
中华儿科杂志/980819 白细胞介素-6(IL-6)是多功能细胞因子，即可以刺激B细胞产生抗体，又可以刺激T细胞的增殖分化。为研究分娩时早产儿及新生儿IL-6水平，应用常规测定脐血IL-6浓度，特别对于早产儿IL-6血浆低于0.5 μg/L时难以测定。因此，作者应用原位杂交的分子生物学技术，检测早产儿及足月儿脐血单个核细胞(CBMC)IL-6 mRNA自然表达状态，以探讨早产儿免疫功能。
资料及方法：
1.标本来源：标本来源于1994年10月～1996年10月，在本院妇产科自然分娩的早产儿18例，胎龄31～36周，体重2 080±586 g；足月儿20例，胎龄37～42周，体重3 587±269 g。以上病例产妇在3天前均无发热、寒战及血象明显增高现象，脐带血培养均阴性。
2.mRNA原位杂交：(1)随机引物标记生物素IL-6 cDNA，采用常规方法，IL-6 cDNA片段为1.2 kb(由北京医科大学马大龙教授提供)。(2)标本制备：常规无菌取脐带静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离CBMC，滴在载玻片上，用多聚甲醛一戊二醛固定65℃30分钟。(3)杂交前处理：标本经10 μg/L蛋白酶K消化，酒精梯度脱水，室温晾干。(4)载玻片上滴含有生物素标记IL-6 cDNA探针杂交液(20%硫酸葡聚糖/甲酰胺2×杂交缓冲液氧钒苷复合物RVC)42℃温盒过夜。(5)杂交后处理：常规洗片，用碱性磷酸酶SA-AP 37℃30分钟，NBT/BCIP显色2～3小时，0.5%核固红复染后镜下观察，细胞图像扫描100个细胞(北京医科大学细胞图像扫描室)测定积分光密度(IA)。(6)阴性对照：杂交前标本经RNase处理杂交液中不加生物素化IL-6探针。
结果：早产儿的IA为18 511±3 649，足月儿为32 078±2 416，早产儿自然表达明显低于足月儿，差异有非常显著意义(t=3.92，P<0.001)。
讨论：新生儿，特别是未成熟儿，其产生抗细菌抵抗能力低下，在受到感染后，其成熟B淋巴细胞产生抗体能力低下，而T细胞又处于成熟障碍，同时造血细胞进入循环池呈延迟现象。IL-6在促进B细胞产生抗体、调节粒细胞功能方面具有重要作用。本研究结果表明，自然分娩早产儿，其IL-6 mRNA在CBMC内自然表达状态明显低于足月新生儿，机理尚不清。Keneth等研究发现，在早产儿CBMC及足月儿CBMC受到LPS及IL-1刺激后，早产儿CBMC IL-6蛋白质及mRNA在细胞内含量明显低于足月新生儿。早产儿CBMC自然状态IL-6 mRNA低水平表达与其抗体产生和中性粒细胞功能暂时性低下的关系，有待于进一步研究。
作者认为，应用细胞原位杂交技术检测mRNA基因表达具有直观性，应用细胞图像分析技术，可以进行细胞水平的半定量分析，细胞图像分析较斑点杂交更为敏感。, http://www.100md.com