神经母细胞瘤眼部转移与N-myc癌基因扩增的临床意义
作者：张锦华 王亦群 杨学忠 尹树国 李新娜
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院血液研究室(张锦华、杨学忠、李新娜)，眼科(尹树国)；美国国立卫生研究院眼科研究所(王亦群)
关键词：神经母细胞瘤；基因；MYC；眼肿瘤；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980505 【摘要】 目的 通过定量研究小儿神经母细胞瘤(NB)N-myc基因扩增倍数，观察NB眼部转移以及与预后的关系。方法 选择25例Ⅳ期NB患儿(有眼部转移15例、无眼部转移10例)做骨穿，有眼部转移者并取转移灶组织，用内参照差示聚合酶链反应(PCR)的方法确定NB细胞的N-myc拷贝数。结果 25例中有24例(96%)出现N-myc扩增，眼部转移组平均拷贝数(51.3±32.4)显著高于无眼部转移组的平均拷贝数(4.3±2.8)，P<0.05，且前者两年生存率明显低于后者。结论 NB的疗效及预后与癌基因扩增倍数密切相关，扩增倍数高者预后差。应用差示PCR方法可及时判断预后，且操作简便快速，适于临床推广应用。
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Ocular metastasis of neuroblastoma and amplification of N-myc oncogene
Zhang Jinhua*, Wang Yiqun, Yang Xuezhong, et al. *
Hematological Lab, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study the effects of amplification of N-myc oncogene on the oculometastasis and prognosis of neuroblastoma (NB).Methods The authors detected the bone marrow and metastasized tumor in 25 cases of NB in stage Ⅳ with differential polymerase chain reaction, among whom 15 had oculometastasis.Results Amplification of N-myc oncogene was found in 24 of 25 cases (96.0%). The N-myc copy number in oculometastasis group (51.3±32.4) was higher than that in non-oculometastasis group (4.3±2.8) (P<0.05), and the 2-year-survival rate of the former was significantly lower than that of the latter (P<0.05).Conclusion N-myc oncogene has effects on the prognosis of NB. Meanwhile, the differential PCR and local puncture are techniques suitable to be developed in clinical practice.
, 百拇医药
【Key words】 Neuroblastoma Genes, myc Eye neoplasms Polymerase chain reaction
神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童胚胎性交感神经系统的恶性肿瘤，早期诊断困难，且易发生骨髓、肝、皮肤及眼眶等多部位转移。NB的生物学特性、临床过程以及预后与N-myc癌基因扩增密切相关[1]。我们采用聚合酶链反应(PCR)，根据内参照原理，应用特异的N-myc引物建立了差示PCR方法，对未经治疗的NB作了N-myc癌基因扩增的检测[2，3]
资料及方法
一、对象 一、对象
1992年～1995年我院确诊的神经母细胞瘤患儿25例(有眼部转移的15例，无眼部转移的10例)。男17例，女8例；年龄1～6岁。肿瘤分期均为Ⅳ期，每例随访2年。所有患儿均根据临床表现、尿儿茶酚胺代谢产物香草杏仁酸(VMA)定性定量，骨髓细胞形态学、骨髓单克隆抗体以及腹部B超等检查确诊[4～6]。眼部转移主要表现为单侧眼球外突，眼眶组织充血肿胀，眼睑浮肿伴有片状瘀斑(本病特异表现)。在眼球周围的眶组织处取穿刺物行N-myc定量分析，同时做涂片染色镜检寻找肿瘤细胞[7]，证实为NB转移。
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标本收集：所有患儿于初次确诊后未经治疗前行骨髓穿刺抽取骨髓约2 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝，于-70℃冻存，骨髓涂片计数瘤细胞数。眼部穿刺物标本处理同骨髓。
引物由美国Cybersyn公司合成。所用仪器：光密度扫描仪(Backman公司生产)、紫外透射仪(Fisher公司生产)、垂直电泳仪(北京六一厂生产)。PCR仪(MJ公司生产)等。
二、方法
1.差示PCR的内参照原理：同一PCR扩增体系中如果有两种模板同时得到扩增，它们的产量之比直接反映模板量的比值(因为其他因素都相同)，就可以通过扩增产物的产量之比推测体系中的两种模板量之比[8]。
2.实验操作过程：用标准酚氯仿法提取标本DNA，进行PCR扩增，同一反应体系中包含N-myc基因和内参照基因两对引物。扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色，于紫外透射光源下观察并摄影，底片显影后用光密度扫描仪扫描，即可得到各电泳条带对应的峰面积，它代表了对应条带的产量。计算出同一标本中N-myc基因产物和内参照基因产物的峰面积比值。
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3.标准曲线的制作：用已知N-myc和内参照基因比值的混合模板进行PCR扩增后检测两种产物的比值。N-myc模板为洛杉矶儿童医院所赠的N-myc探针，内参照模板为正常人基因组DNA，均经定量检测确定其浓度，通过倍比稀释得到一系列梯度浓度比值的混合液。以其为模板进行扩增，根据两种产物含量的比值与模板比值的线性关系绘出标准曲线。
4.N-myc扩增倍数的计算：将上述2所得的峰面积比代入标准曲线得出两种模板拷贝数的比值，再根据骨髓细胞分数中瘤细胞含量即可算出瘤细胞的N-myc癌基因的拷贝数。
结果
一、标本所见的两条目的带内参照基因260 bp和N-myc基因284 bp。
二、NB细胞的N-myc扩增情况
全部25例Ⅳ期患儿有24例出现N-myc扩增(占96%)，其扩增结果与眼部转移的关系见表1。
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表1 眼部有无转移NB患儿的N-myc扩增结果 眼部转移
及穿刺部位
例
数
扩增
扩增拷贝数
秩和检
验t值
例数
(%)
±s
范围
, 百拇医药 无转移
骨髓
10
9
90.0
4.3± 2.8
3.1～ 5.7
91
有转移
骨髓
15
15
100.0
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51.3±32.4
18.5～110.2
眼穿刺物
8
8
100.0
48.1±16.7
15.3～ 98.2
71
注：秩和检验，有转移组扩增拷贝数高于无转移组，P<0.05 表1经统计学分析得知，有眼部转移和无眼部转移两组基本都出现N-myc扩增(无眼部转移组只有1例无扩增)，两者相比差异不显著(P>0.05)，但两组平均拷贝数相差很大，差异有非常显著意义(P<0.01)。同时在眼部转移组中骨髓与眼穿刺物标本的扩增拷贝数结果相近，两者之间差异无显著意义(P>0.05)。
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三、眼部转移N-myc扩增与预后关系(表2，3)
从表2可知，N-myc癌基因扩增倍数与预后密切相关，扩增倍数越高，预后越差，两组差异有显著意义(P<0.05)。
表3经统计学分析得知，眼部转移组2年生存率明显低于无眼部转移组，两组差异有显著意义(P<0.05)。
表2 N-myc扩增倍数不同者2年后生存率 N-myc
扩增倍数
例 数
生存率
(%)
生存
死亡
, 百拇医药
合计
≤10
6
2
8
75.00
>10
3
14
17
17.65
注：校正χ2(χ2c)=5.476，P<0.05表3 有无眼部转移者2年后生存率 眼部转移
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例 数
生存率
(%)
生存
死亡
合计
有
2
13
15
13.33
无
7
3
, 百拇医药
10
70.00
注：校正χ2(χ2c)=6.084，P<0.05讨论
一、眼部穿刺及进行N-myc基因定量的意义
NB是一种恶性度极高的儿童肿瘤，其特点是早期易发生多部位转移，如骨髓、肝、皮肤及眼眶等。眼部表现有时可作为来诊的首发症状，而此时缺乏其他常见的全身症状，如发热、贫血或骨痛等，从而被误认为是眼部疾患而片面诊治。因此眼科医生充分了解NB，特别是以眼部表现为首发症状者，注意与其他眼科疾病相鉴别，尽早予以确诊，及时与专科医生合作是十分必要的。
眼局部穿刺操作简便、快速，易于施行，为眼科可疑病例的诊疗提供了有力的手段。在本组中有8例患儿同时完成了骨髓和眼局部穿刺物标本的PCR反应的检测，它们之间的结果相近，二者差异无显著性(P>0.05)。因此有眼部转移的患儿只做眼部穿刺物的PCR反应，同时镜检找到瘤细胞即可作出诊断。且眼部穿刺成功率高，穿刺物中瘤细胞数目多，十分适合N-myc基因定量，具有很大的实用价值。
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二、眼部转移、N-myc基因扩增与预后的关系
本组25例NB均属Ⅳ期，采用统一的化疗方案及综合治疗。NB伴骨髓、肝、脾、皮肤转移的晚期病例，经多年观察发现存活5～10年的病例(能正常上学上班)已不少见，唯有眼部转移的预后差。每例患儿初用化疗效果明显，但短期即复发，再次化疗则不敏感，易产生耐药，病情迅速恶化。本组存活时间3个月～27个月，中数生存期为13个月。
N-myc的高倍扩增提示预后不良。多数学者如Brodeur认为N-myc癌基因扩增与NB预后密切相关，即N-myc扩增倍数越高，预后越差。从表1中可看出眼部转移组N-myc扩增的平均拷贝数明显高于无眼部转移组，本组有1例N-myc扩增高达110.2倍的患儿仅存活3个月；另1例扩增倍数为3.1倍(无眼部转移)已存活3年余。由此说明N-myc扩增与NB预后密切相关。本实验与文献报道相近似。本实验进一步说明对初诊的NB做N-myc癌基因检测可及时判断预后和指导化疗。
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三、差示PCR的实用价值
差示PCR于1989年由Frye等[8]提出，在实践中不断完善，为快速、灵敏地进行基因的定量检测提供了有效的手段。与常规Southern杂交检测基因扩增相比具有很多优点：(1)标本用量少(以ng为单位计算)、标本质量要求低。(2)操作简便，已完全自动化。(3)快速，检测一批标本半天即可完成。(4)不需要同位素，克服了由同位素带来的污染。因此适于临床开展。
Gilbert等[9]和Gramlich等[10]在运用差示PCR的同时对照地做了Southern杂交，指出差示PCR与Southern杂交具有一致性，且前者更为灵敏，能检测出2个倍数的基因扩增，而无非特异性扩增。
参考文献
1 Tsuda T, Obara M, Hirano H, et al. Analysis of N-myc amplification in relation to disease stage and histologic types in human neuroblastomas. Cancer, 1987,60：802-806.
, 百拇医药
2 Brodeur GM, Azar C, Brother M, et al. Neuroblastoma. Effect of genetic factors on prognosis and treatment. Cancer, 1992, 70(6 suppl)：1685-1694.
3 Nakagawara A, Sasazuki T, Akiyama H, et al. N-myc oncogene and stage IV-S neuroblastoma. Preliminary observations on ten cases. Cancer, 1990,65：1960-1967.
4 张锦华，康绍婵.陈世杰，等.小儿隐匿型神经母细胞瘤诊断的探讨.中华儿科杂志，1989；27：141-143.
5 白岩，张锦华，张德芳.用单克隆抗体检测骨髓转移的神经母细胞瘤.中华肿瘤杂志，1989，11：260-262.
, 百拇医药
6 王善伯，张锦华，赵国贵.二维超声在诊断隐蔽型神经母细胞瘤中的价值.中华物理医学杂志，1988；1：14-15.
7 尹树国，张锦华.神经母细胞瘤的眼部改变.实用眼科杂志，1987；5：479-481.
8 Frye RA, Benz CC, Liu E. Detection of amplified oncogenes by differential polymerase chain reaction. Oncogene, 1989,4：1153-1157.
9 Gilbert J, Norris MD, Haber M, et al.Determination of N-myc gene amplification in neuroblastoma by differential polymerase chain reaction. Mol Cell Probes, 1993,7：227-234.
10 Gramlich TL, Fritsch C, Shear S, et al. Analysis of epidermal growth factor receptor gene expression in strained smears and formalin-fixed paraffin-embedded cell pellets by reverse transcription intron differential polymerase chain reaction. Anal Quant Cytol Histol, 1993,15：317-322., http://www.100md.com
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院血液研究室(张锦华、杨学忠、李新娜)，眼科(尹树国)；美国国立卫生研究院眼科研究所(王亦群)
关键词：神经母细胞瘤；基因；MYC；眼肿瘤；聚合酶链反应
中华儿科杂志/980505 【摘要】 目的 通过定量研究小儿神经母细胞瘤(NB)N-myc基因扩增倍数，观察NB眼部转移以及与预后的关系。方法 选择25例Ⅳ期NB患儿(有眼部转移15例、无眼部转移10例)做骨穿，有眼部转移者并取转移灶组织，用内参照差示聚合酶链反应(PCR)的方法确定NB细胞的N-myc拷贝数。结果 25例中有24例(96%)出现N-myc扩增，眼部转移组平均拷贝数(51.3±32.4)显著高于无眼部转移组的平均拷贝数(4.3±2.8)，P<0.05，且前者两年生存率明显低于后者。结论 NB的疗效及预后与癌基因扩增倍数密切相关，扩增倍数高者预后差。应用差示PCR方法可及时判断预后，且操作简便快速，适于临床推广应用。
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Ocular metastasis of neuroblastoma and amplification of N-myc oncogene
Zhang Jinhua*, Wang Yiqun, Yang Xuezhong, et al. *
Hematological Lab, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study the effects of amplification of N-myc oncogene on the oculometastasis and prognosis of neuroblastoma (NB).Methods The authors detected the bone marrow and metastasized tumor in 25 cases of NB in stage Ⅳ with differential polymerase chain reaction, among whom 15 had oculometastasis.Results Amplification of N-myc oncogene was found in 24 of 25 cases (96.0%). The N-myc copy number in oculometastasis group (51.3±32.4) was higher than that in non-oculometastasis group (4.3±2.8) (P<0.05), and the 2-year-survival rate of the former was significantly lower than that of the latter (P<0.05).Conclusion N-myc oncogene has effects on the prognosis of NB. Meanwhile, the differential PCR and local puncture are techniques suitable to be developed in clinical practice.
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【Key words】 Neuroblastoma Genes, myc Eye neoplasms Polymerase chain reaction
神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童胚胎性交感神经系统的恶性肿瘤，早期诊断困难，且易发生骨髓、肝、皮肤及眼眶等多部位转移。NB的生物学特性、临床过程以及预后与N-myc癌基因扩增密切相关[1]。我们采用聚合酶链反应(PCR)，根据内参照原理，应用特异的N-myc引物建立了差示PCR方法，对未经治疗的NB作了N-myc癌基因扩增的检测[2，3]
资料及方法
一、对象 一、对象
1992年～1995年我院确诊的神经母细胞瘤患儿25例(有眼部转移的15例，无眼部转移的10例)。男17例，女8例；年龄1～6岁。肿瘤分期均为Ⅳ期，每例随访2年。所有患儿均根据临床表现、尿儿茶酚胺代谢产物香草杏仁酸(VMA)定性定量，骨髓细胞形态学、骨髓单克隆抗体以及腹部B超等检查确诊[4～6]。眼部转移主要表现为单侧眼球外突，眼眶组织充血肿胀，眼睑浮肿伴有片状瘀斑(本病特异表现)。在眼球周围的眶组织处取穿刺物行N-myc定量分析，同时做涂片染色镜检寻找肿瘤细胞[7]，证实为NB转移。
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标本收集：所有患儿于初次确诊后未经治疗前行骨髓穿刺抽取骨髓约2 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝，于-70℃冻存，骨髓涂片计数瘤细胞数。眼部穿刺物标本处理同骨髓。
引物由美国Cybersyn公司合成。所用仪器：光密度扫描仪(Backman公司生产)、紫外透射仪(Fisher公司生产)、垂直电泳仪(北京六一厂生产)。PCR仪(MJ公司生产)等。
二、方法
1.差示PCR的内参照原理：同一PCR扩增体系中如果有两种模板同时得到扩增，它们的产量之比直接反映模板量的比值(因为其他因素都相同)，就可以通过扩增产物的产量之比推测体系中的两种模板量之比[8]。
2.实验操作过程：用标准酚氯仿法提取标本DNA，进行PCR扩增，同一反应体系中包含N-myc基因和内参照基因两对引物。扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色，于紫外透射光源下观察并摄影，底片显影后用光密度扫描仪扫描，即可得到各电泳条带对应的峰面积，它代表了对应条带的产量。计算出同一标本中N-myc基因产物和内参照基因产物的峰面积比值。
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3.标准曲线的制作：用已知N-myc和内参照基因比值的混合模板进行PCR扩增后检测两种产物的比值。N-myc模板为洛杉矶儿童医院所赠的N-myc探针，内参照模板为正常人基因组DNA，均经定量检测确定其浓度，通过倍比稀释得到一系列梯度浓度比值的混合液。以其为模板进行扩增，根据两种产物含量的比值与模板比值的线性关系绘出标准曲线。
4.N-myc扩增倍数的计算：将上述2所得的峰面积比代入标准曲线得出两种模板拷贝数的比值，再根据骨髓细胞分数中瘤细胞含量即可算出瘤细胞的N-myc癌基因的拷贝数。
结果
一、标本所见的两条目的带内参照基因260 bp和N-myc基因284 bp。
二、NB细胞的N-myc扩增情况
全部25例Ⅳ期患儿有24例出现N-myc扩增(占96%)，其扩增结果与眼部转移的关系见表1。
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表1 眼部有无转移NB患儿的N-myc扩增结果 眼部转移
及穿刺部位
例
数
扩增
扩增拷贝数
秩和检
验t值
例数
(%)
±s范围
, 百拇医药 无转移
骨髓
10
9
90.0
4.3± 2.8
3.1～ 5.7
91
有转移
骨髓
15
15
100.0
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51.3±32.4
18.5～110.2
眼穿刺物
8
8
100.0
48.1±16.7
15.3～ 98.2
71
注：秩和检验，有转移组扩增拷贝数高于无转移组，P<0.05 表1经统计学分析得知，有眼部转移和无眼部转移两组基本都出现N-myc扩增(无眼部转移组只有1例无扩增)，两者相比差异不显著(P>0.05)，但两组平均拷贝数相差很大，差异有非常显著意义(P<0.01)。同时在眼部转移组中骨髓与眼穿刺物标本的扩增拷贝数结果相近，两者之间差异无显著意义(P>0.05)。
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三、眼部转移N-myc扩增与预后关系(表2，3)
从表2可知，N-myc癌基因扩增倍数与预后密切相关，扩增倍数越高，预后越差，两组差异有显著意义(P<0.05)。
表3经统计学分析得知，眼部转移组2年生存率明显低于无眼部转移组，两组差异有显著意义(P<0.05)。
表2 N-myc扩增倍数不同者2年后生存率 N-myc
扩增倍数
例 数
生存率
(%)
生存
死亡
, 百拇医药
合计
≤10
6
2
8
75.00
>10
3
14
17
17.65
注：校正χ2(χ2c)=5.476，P<0.05表3 有无眼部转移者2年后生存率 眼部转移
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例 数
生存率
(%)
生存
死亡
合计
有
2
13
15
13.33
无
7
3
, 百拇医药
10
70.00
注：校正χ2(χ2c)=6.084，P<0.05讨论
一、眼部穿刺及进行N-myc基因定量的意义
NB是一种恶性度极高的儿童肿瘤，其特点是早期易发生多部位转移，如骨髓、肝、皮肤及眼眶等。眼部表现有时可作为来诊的首发症状，而此时缺乏其他常见的全身症状，如发热、贫血或骨痛等，从而被误认为是眼部疾患而片面诊治。因此眼科医生充分了解NB，特别是以眼部表现为首发症状者，注意与其他眼科疾病相鉴别，尽早予以确诊，及时与专科医生合作是十分必要的。
眼局部穿刺操作简便、快速，易于施行，为眼科可疑病例的诊疗提供了有力的手段。在本组中有8例患儿同时完成了骨髓和眼局部穿刺物标本的PCR反应的检测，它们之间的结果相近，二者差异无显著性(P>0.05)。因此有眼部转移的患儿只做眼部穿刺物的PCR反应，同时镜检找到瘤细胞即可作出诊断。且眼部穿刺成功率高，穿刺物中瘤细胞数目多，十分适合N-myc基因定量，具有很大的实用价值。
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二、眼部转移、N-myc基因扩增与预后的关系
本组25例NB均属Ⅳ期，采用统一的化疗方案及综合治疗。NB伴骨髓、肝、脾、皮肤转移的晚期病例，经多年观察发现存活5～10年的病例(能正常上学上班)已不少见，唯有眼部转移的预后差。每例患儿初用化疗效果明显，但短期即复发，再次化疗则不敏感，易产生耐药，病情迅速恶化。本组存活时间3个月～27个月，中数生存期为13个月。
N-myc的高倍扩增提示预后不良。多数学者如Brodeur认为N-myc癌基因扩增与NB预后密切相关，即N-myc扩增倍数越高，预后越差。从表1中可看出眼部转移组N-myc扩增的平均拷贝数明显高于无眼部转移组，本组有1例N-myc扩增高达110.2倍的患儿仅存活3个月；另1例扩增倍数为3.1倍(无眼部转移)已存活3年余。由此说明N-myc扩增与NB预后密切相关。本实验与文献报道相近似。本实验进一步说明对初诊的NB做N-myc癌基因检测可及时判断预后和指导化疗。
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三、差示PCR的实用价值
差示PCR于1989年由Frye等[8]提出，在实践中不断完善，为快速、灵敏地进行基因的定量检测提供了有效的手段。与常规Southern杂交检测基因扩增相比具有很多优点：(1)标本用量少(以ng为单位计算)、标本质量要求低。(2)操作简便，已完全自动化。(3)快速，检测一批标本半天即可完成。(4)不需要同位素，克服了由同位素带来的污染。因此适于临床开展。
Gilbert等[9]和Gramlich等[10]在运用差示PCR的同时对照地做了Southern杂交，指出差示PCR与Southern杂交具有一致性，且前者更为灵敏，能检测出2个倍数的基因扩增，而无非特异性扩增。
参考文献
1 Tsuda T, Obara M, Hirano H, et al. Analysis of N-myc amplification in relation to disease stage and histologic types in human neuroblastomas. Cancer, 1987,60：802-806.
, 百拇医药
2 Brodeur GM, Azar C, Brother M, et al. Neuroblastoma. Effect of genetic factors on prognosis and treatment. Cancer, 1992, 70(6 suppl)：1685-1694.
3 Nakagawara A, Sasazuki T, Akiyama H, et al. N-myc oncogene and stage IV-S neuroblastoma. Preliminary observations on ten cases. Cancer, 1990,65：1960-1967.
4 张锦华，康绍婵.陈世杰，等.小儿隐匿型神经母细胞瘤诊断的探讨.中华儿科杂志，1989；27：141-143.
5 白岩，张锦华，张德芳.用单克隆抗体检测骨髓转移的神经母细胞瘤.中华肿瘤杂志，1989，11：260-262.
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6 王善伯，张锦华，赵国贵.二维超声在诊断隐蔽型神经母细胞瘤中的价值.中华物理医学杂志，1988；1：14-15.
7 尹树国，张锦华.神经母细胞瘤的眼部改变.实用眼科杂志，1987；5：479-481.
8 Frye RA, Benz CC, Liu E. Detection of amplified oncogenes by differential polymerase chain reaction. Oncogene, 1989,4：1153-1157.
9 Gilbert J, Norris MD, Haber M, et al.Determination of N-myc gene amplification in neuroblastoma by differential polymerase chain reaction. Mol Cell Probes, 1993,7：227-234.
10 Gramlich TL, Fritsch C, Shear S, et al. Analysis of epidermal growth factor receptor gene expression in strained smears and formalin-fixed paraffin-embedded cell pellets by reverse transcription intron differential polymerase chain reaction. Anal Quant Cytol Histol, 1993,15：317-322., http://www.100md.com