原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞白细胞介素6、Gp130 mRNA表达及其相互关系
作者：孙林 许韩师 曾丽霞 陈述枚 汤洁如 叶任高
单位：510080 广州，中山医科大学肾脏病研究所
关键词：肾变病综合征；白细胞介素6；膜糖蛋白类
中华儿科杂志/980607 【摘要】 目的 观察原发性肾病综合征患儿白细胞介素6(IL-6)、Gp130 mRNA表达及其相互关系。方法 用细胞原位杂交技术检测了11例活动期原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞IL-6、Gp130 mRNA表达。结果 IL-6、Gp130 mRNA表达分别是2.96±0.99与1.35±0.74，正常对照组分别为0.031±0.019、0.022±0.013，两组差异均有显著意义(P均<0.05)；IL-6与Gp130 mRNA表达量呈正相关。结论 原发性肾病综合征患儿IL-6、Gp130 mRNA表达存在异常，并可能参与了其分子发病机制过程。
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Gene expression of IL-6, Gp130 in peripheral blood mononuclear cells and its relationship with idiopathic nephrotic syndrome in children
Sun Lin, Xu Hanshi, Zeng Lixia, et al.
The Institute of Nephrology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To observe the gene expression of IL-6, Gp130 genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their relationship with idiopathic nephrotic syndrome (INS) in children. Methods Cellular in situ hybridization was used to detect mRNA expression in PBMCs. Result The mRNA expressions of IL-6 and Gp130 in INS group were 2.96±0.99 and 1.35±0.74, respectively, which were significantly higher than those in control group (P<0.01), and a positive correlation was found between the IL-6 mRNA and Gp130 mRNA expressions (P<0.01). Conclusion The IL-6 and Gp130 gene expressions in PBMC from INS cases are abnormal, which suggests that IL-6 and Gp130 may be involved in the immune pathogenesis of INS.
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【Key words】 Nephrotic syndrome Interleukin-6 Membrane glycoproteins
近年来，白细胞介素6(IL-6)在肾脏病学中的作用日益受到人们的关注, 但有关原发性肾病综合征(INS)患儿血清IL-6的变化结论不一，故有必要从分子水平探讨INS患儿外周血单个核细胞IL-6基因表达是否存在异常；Gp130是IL-6靶细胞膜上的一种Ⅰ型糖蛋白分子(分子量为130 000，简称Gp130)，它是IL-6发挥生物学效应及信息传递中的关键性物质，Gp130表达的高低将直接影响到IL-6水平及生物学活性的发挥[1]，因此我们采用细胞核酸分子原位杂交技术，观察了INS患儿外周血单个核细胞IL-6、Gp130 mRNA表达，并分析二者的相互关系，以进一步从分子水平探讨IL-6、 Gp130在肾病综合征中的作用和意义。
对象和方法
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一、对象
观察组11例，男8例，女3例，年龄2岁7个月～12岁，平均6岁6个月。所有病例均处于活动期，排除HBsAg(+)或继发性肾病，诊断符合国内小儿INS诊断标准[2]，其中单纯型肾病8例，肾炎型肾病3例。患儿均无发热、感染及肝功能异常，均为未用过激素及免疫抑制剂的初发病例；对照组13例，男7例，女6例，年龄3岁8个月～12岁，为健康儿童。
二、材料
1. 原位杂交用寡核苷酸探针： IL-6寡核苷酸特异性探针序列: 3′-CAT TTG CCG AAG AGC CCT CA-5′； Gp130寡核苷酸特异性探针序列：3′TTG AAA AGG AGG CAA TGT CTT CCA CAC GAG-5′；β-Actin寡核苷酸特异性探针序列： 3′-GTC ATG CTT AAC TCT GCA GG- 5′(寡核苷酸序列由DNA sis软件设计，上海细胞生物研究所DNA合成仪合成，33 mmol/μl).
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2. 试剂和仪器：DIG寡核苷酸3′端标记试剂盒，DIG核酸检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂，批号940427)，BX50系统生物显微镜照像系统(Olympus，日本)， IBAS 2.0计算机图像分析系统(KONTRON，德国 )， SZK-202超净工作台(蚌埠净化设备厂)。
3. 原位杂交玻片处理：玻片经去污剂、清洁液处理，3×Denhart溶液65℃ 3小时，180℃烤2小时，置盒中保存，使用前用5μl (0.01mg/μL)L-多聚赖氨酸溶液推片，晾干。
三、方法
1. 目的探针标记： 用Oligonucleotide 3′末端连接试剂盒 (BM公司)说明书的方法进行探针标记。按DIG 检测试剂盒 (BM公司)说明书方法，检测标记目的基因探针浓度，结果IL-6、GP130、β-Actin探针浓度分别为5.1、4.8、5.1 μg/ml，杂交灵敏度分别为5、5、10 pg/100 μl
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2. 外周血单个核细胞分离：无菌条件下采集抗凝血2 ml加等量PBS稀释，然后沿管壁缓缓加入置分离液的上方，以2 500 r/min离心20分钟得细胞悬液，制备1×105/ml 细胞悬液。
3. 原位杂交程序：取5μl细胞悬液涂于载玻片上、晾干,4%多聚甲醛(PFA)固定10分钟，乙醇逐级脱水， 空气干燥，蛋白酶K(10～30 μg/ml)37℃、消化10分钟， 2%甘氨酸后固定10分钟，每张切片加20 μl预杂交液( 预杂交液组成：50%去离子甲酰胺、2×SSC、10%硫酸葡聚糖、250mg/L ssDNA、2×denhardts)，37℃ 预杂交1～2小时，去预杂交液，加20 μl杂交液，( 预杂交液加0.2 mg/ml tRNA、目的基因探针0.3 ng/μl)，42℃杂交过夜，然后逐级洗涤：2×SSC/0.1SDS洗涤15分钟， 0.5×SSC洗涤15分钟， bufferⅠ洗涤15分钟，再加20 μl抗DIG抗体-AKP复合物(1∶1000)室温反应1～2小时， buffer I洗涤15分钟，bufferⅢ洗涤5分钟，再加20 μl显色液(NBT4.5 μl, BCIP 3.5 μl/bufferⅢ 1 ml)，暗室显色2～5小时，苏木精染色5秒，伊红染色10秒，二甲苯透明，中性树胶封片。
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4. 对照组：以β-actin寡核苷酸探针为阳性对照；阴性对照∶(1)杂交前细胞涂片经RNase A处理；(2)用2×SSC代替目的探针。
四、结果分析
阳性杂交结果为细胞浆中出现黑色或紫蓝色的颗粒状、絮条状物或点状信号。将所得照片进行计算机图像分析系统处理，以杂交信号比值〔阳性信号总面积(μm2)÷细胞总面积(μm2)×100〕半定量地表示mRNA表达量。比值越大，说明mRNA表达量愈多。
五、统计学处理
所得数据以
±s表示，用Oxstat统计软件。进行组间比较采用t检验，相关分析采用直线回归方法。
结果
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一、INS患儿外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达
正常对照组外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达极微量(0.031±0.019)，表达信号在细胞胞浆内围绕细胞核呈深蓝色点状分布；阴性对照无表达；11例INS患儿外周血单个核细胞细胞浆中出现黑色或紫蓝色的颗粒状、絮条状物信号，IL-6 mRNA表达量较多(2.96±0.99)，明显高于正常对照组。(t=5.08，P<0.01)。
二、INS患儿外周血单个核细胞Gp130 mRNA表达
正常对照组外周血单个核细胞仅有微量的Gp130 mRNA表达(0.022±0.013)，INS患儿外周血单个核细胞Gp130的mRNA表达(1.35±0.74)显著高于正常对照(t=2.76，P<0.05)。
三、IL-6 mRNA表达与Gp130 mRNA表达相关分析
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INS患儿外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达与Gp130 mRNA表达相关分析结果表明，INS患儿外周血单个核细胞IL-6与Gp130 mRNA表达量呈高度正相关(r=0.898，P<0.01)
讨论
IL-6首次于1982年由Content等从Poly(I)、Poly(c)诱导的鼠成纤维细胞中检测到[3]。IL-6是一种多功能的细胞因子，具有广泛的生物学活性：诱导B淋巴细胞增殖，分化并产生抗体；是T细胞活化因子，可诱导T细胞表达IL-2受体等。在生理情况下，正常人体外周血中含有极少量的IL-6，肝、脾、肾、外周血白细胞均能检测到IL-6 mRNA表达。本组检测示，正常小儿外周血有少量IL-6存在，单个核细胞亦有极微量的IL-6 mRNA表达，与文献报道一致， 提示IL-6 在维持正常人体内环境稳定中有重要的生理作用。
近年来，人们研究发现IL-6与许多疾病特别是免疫相关疾病如肾小球肾炎发生发展密切相关[4]。但IL-6在小儿原发性肾病综合征发病机理中的作用尚不明，结论颇不一致，如Garin等[5]观察发现原发性微小病变型肾病(MCNS)患者血清IL-6活性较正常对照组增高；而李成荣等[6]研究发现单纯性肾病患儿血清IL-6活性较正常对照组明显下降，INS患儿IL-6血清水平的高低是否与其外周血单个核细胞IL-6基因表达异常有关? 文献尚未确定。本研究在我们以往研究INS患儿外周血IL-6水平增高的结果基础上进一步研究发现，INS患儿外周血单个核细胞内IL-6 mRNA的表达显著高于正常对照组，提示INS患儿单个核细胞IL-6基因处于激活状态，基因转录增强，故血清IL-6水平升高。
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Gp130是IL-6靶细胞膜上的一种Ⅰ型糖蛋白分子，与IL-6的广泛生物学活性有关。近期研究证明：IL-6首先与IL-6受体结合，然后才识别Gp130，三者共同形成有生物活性的三元复合体，该复合体立即激活细胞内的多种激酶，导致蛋白磷酸化和核基因表达，促进/抑制细胞生长，或诱导细胞分化[7],此外IL-6和Gp130之间可相互调节。目前Gp130在肾病综合征发病机制中的作用尚不明，本研究采用原位杂交技术观察到INS患儿外周血单个核细胞Gp130 mRNA表达显著高于正常小儿，提示Gp130表达异常也可能参与了INS分子发病机制过程，但有关具体的分子机制有待进一步研究。
参考文献
1 Murakamim M，Narazaki M，Hibi M，et al. Critical cytoplasmic region of the interlurkin-6 signal transducer GP130 is conserved in the cytokine receptor family .Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:11394-11453.
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2 小儿肾脏疾病科研协作组.《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志,1981，19：241-243.
3 Content Y,Wit LD, Pierard M, et al. Secretory proteins induced in human fibroblasts under conditions used for the production of interferon .Proc Natl Acad Sci USA， 1982，79:2768-2772.
4 孙林.白细胞介素6及其在肾脏病学中的意义[综述]. 国外医学生理病理学科与临床分册,1993，12:90-92.
5 Garin EH, Corontzes N. Effect of interleukin-6 on glomerular basement membrane (GBM) 35Sulfate uptake. Pediatr Res, 1991，29:343A.
6 李成荣，杨锡强，王利佳，等.小儿单纯性肾病综合征白细胞介素-6探讨.上海免疫学杂志,1990,10：349-350.
7 Saito M, Yoshida KJ, Hibi M, et al.Molecular cloning of a murine IL-6 receptor associated signal transducer,GP130,and its regulated expression in vivo. J Immunol, 1992,148:4066-4071., 百拇医药
单位：510080 广州，中山医科大学肾脏病研究所
关键词：肾变病综合征；白细胞介素6；膜糖蛋白类
中华儿科杂志/980607 【摘要】 目的 观察原发性肾病综合征患儿白细胞介素6(IL-6)、Gp130 mRNA表达及其相互关系。方法 用细胞原位杂交技术检测了11例活动期原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞IL-6、Gp130 mRNA表达。结果 IL-6、Gp130 mRNA表达分别是2.96±0.99与1.35±0.74，正常对照组分别为0.031±0.019、0.022±0.013，两组差异均有显著意义(P均<0.05)；IL-6与Gp130 mRNA表达量呈正相关。结论 原发性肾病综合征患儿IL-6、Gp130 mRNA表达存在异常，并可能参与了其分子发病机制过程。
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Gene expression of IL-6, Gp130 in peripheral blood mononuclear cells and its relationship with idiopathic nephrotic syndrome in children
Sun Lin, Xu Hanshi, Zeng Lixia, et al.
The Institute of Nephrology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To observe the gene expression of IL-6, Gp130 genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their relationship with idiopathic nephrotic syndrome (INS) in children. Methods Cellular in situ hybridization was used to detect mRNA expression in PBMCs. Result The mRNA expressions of IL-6 and Gp130 in INS group were 2.96±0.99 and 1.35±0.74, respectively, which were significantly higher than those in control group (P<0.01), and a positive correlation was found between the IL-6 mRNA and Gp130 mRNA expressions (P<0.01). Conclusion The IL-6 and Gp130 gene expressions in PBMC from INS cases are abnormal, which suggests that IL-6 and Gp130 may be involved in the immune pathogenesis of INS.
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【Key words】 Nephrotic syndrome Interleukin-6 Membrane glycoproteins
近年来，白细胞介素6(IL-6)在肾脏病学中的作用日益受到人们的关注, 但有关原发性肾病综合征(INS)患儿血清IL-6的变化结论不一，故有必要从分子水平探讨INS患儿外周血单个核细胞IL-6基因表达是否存在异常；Gp130是IL-6靶细胞膜上的一种Ⅰ型糖蛋白分子(分子量为130 000，简称Gp130)，它是IL-6发挥生物学效应及信息传递中的关键性物质，Gp130表达的高低将直接影响到IL-6水平及生物学活性的发挥[1]，因此我们采用细胞核酸分子原位杂交技术，观察了INS患儿外周血单个核细胞IL-6、Gp130 mRNA表达，并分析二者的相互关系，以进一步从分子水平探讨IL-6、 Gp130在肾病综合征中的作用和意义。
对象和方法
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一、对象
观察组11例，男8例，女3例，年龄2岁7个月～12岁，平均6岁6个月。所有病例均处于活动期，排除HBsAg(+)或继发性肾病，诊断符合国内小儿INS诊断标准[2]，其中单纯型肾病8例，肾炎型肾病3例。患儿均无发热、感染及肝功能异常，均为未用过激素及免疫抑制剂的初发病例；对照组13例，男7例，女6例，年龄3岁8个月～12岁，为健康儿童。
二、材料
1. 原位杂交用寡核苷酸探针： IL-6寡核苷酸特异性探针序列: 3′-CAT TTG CCG AAG AGC CCT CA-5′； Gp130寡核苷酸特异性探针序列：3′TTG AAA AGG AGG CAA TGT CTT CCA CAC GAG-5′；β-Actin寡核苷酸特异性探针序列： 3′-GTC ATG CTT AAC TCT GCA GG- 5′(寡核苷酸序列由DNA sis软件设计，上海细胞生物研究所DNA合成仪合成，33 mmol/μl).
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2. 试剂和仪器：DIG寡核苷酸3′端标记试剂盒，DIG核酸检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂，批号940427)，BX50系统生物显微镜照像系统(Olympus，日本)， IBAS 2.0计算机图像分析系统(KONTRON，德国 )， SZK-202超净工作台(蚌埠净化设备厂)。
3. 原位杂交玻片处理：玻片经去污剂、清洁液处理，3×Denhart溶液65℃ 3小时，180℃烤2小时，置盒中保存，使用前用5μl (0.01mg/μL)L-多聚赖氨酸溶液推片，晾干。
三、方法
1. 目的探针标记： 用Oligonucleotide 3′末端连接试剂盒 (BM公司)说明书的方法进行探针标记。按DIG 检测试剂盒 (BM公司)说明书方法，检测标记目的基因探针浓度，结果IL-6、GP130、β-Actin探针浓度分别为5.1、4.8、5.1 μg/ml，杂交灵敏度分别为5、5、10 pg/100 μl
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2. 外周血单个核细胞分离：无菌条件下采集抗凝血2 ml加等量PBS稀释，然后沿管壁缓缓加入置分离液的上方，以2 500 r/min离心20分钟得细胞悬液，制备1×105/ml 细胞悬液。
3. 原位杂交程序：取5μl细胞悬液涂于载玻片上、晾干,4%多聚甲醛(PFA)固定10分钟，乙醇逐级脱水， 空气干燥，蛋白酶K(10～30 μg/ml)37℃、消化10分钟， 2%甘氨酸后固定10分钟，每张切片加20 μl预杂交液( 预杂交液组成：50%去离子甲酰胺、2×SSC、10%硫酸葡聚糖、250mg/L ssDNA、2×denhardts)，37℃ 预杂交1～2小时，去预杂交液，加20 μl杂交液，( 预杂交液加0.2 mg/ml tRNA、目的基因探针0.3 ng/μl)，42℃杂交过夜，然后逐级洗涤：2×SSC/0.1SDS洗涤15分钟， 0.5×SSC洗涤15分钟， bufferⅠ洗涤15分钟，再加20 μl抗DIG抗体-AKP复合物(1∶1000)室温反应1～2小时， buffer I洗涤15分钟，bufferⅢ洗涤5分钟，再加20 μl显色液(NBT4.5 μl, BCIP 3.5 μl/bufferⅢ 1 ml)，暗室显色2～5小时，苏木精染色5秒，伊红染色10秒，二甲苯透明，中性树胶封片。
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4. 对照组：以β-actin寡核苷酸探针为阳性对照；阴性对照∶(1)杂交前细胞涂片经RNase A处理；(2)用2×SSC代替目的探针。
四、结果分析
阳性杂交结果为细胞浆中出现黑色或紫蓝色的颗粒状、絮条状物或点状信号。将所得照片进行计算机图像分析系统处理，以杂交信号比值〔阳性信号总面积(μm2)÷细胞总面积(μm2)×100〕半定量地表示mRNA表达量。比值越大，说明mRNA表达量愈多。
五、统计学处理
所得数据以
±s表示，用Oxstat统计软件。进行组间比较采用t检验，相关分析采用直线回归方法。结果
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一、INS患儿外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达
正常对照组外周血单个核细胞IL-6 mRNA表达极微量(0.031±0.019)，表达信号在细胞胞浆内围绕细胞核呈深蓝色点状分布；阴性对照无表达；11例INS患儿外周血单个核细胞细胞浆中出现黑色或紫蓝色的颗粒状、絮条状物信号，IL-6 mRNA表达量较多(2.96±0.99)，明显高于正常对照组。(t=5.08，P<0.01)。
二、INS患儿外周血单个核细胞Gp130 mRNA表达
正常对照组外周血单个核细胞仅有微量的Gp130 mRNA表达(0.022±0.013)，INS患儿外周血单个核细胞Gp130的mRNA表达(1.35±0.74)显著高于正常对照(t=2.76，P<0.05)。
三、IL-6 mRNA表达与Gp130 mRNA表达相关分析
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讨论
IL-6首次于1982年由Content等从Poly(I)、Poly(c)诱导的鼠成纤维细胞中检测到[3]。IL-6是一种多功能的细胞因子，具有广泛的生物学活性：诱导B淋巴细胞增殖，分化并产生抗体；是T细胞活化因子，可诱导T细胞表达IL-2受体等。在生理情况下，正常人体外周血中含有极少量的IL-6，肝、脾、肾、外周血白细胞均能检测到IL-6 mRNA表达。本组检测示，正常小儿外周血有少量IL-6存在，单个核细胞亦有极微量的IL-6 mRNA表达，与文献报道一致， 提示IL-6 在维持正常人体内环境稳定中有重要的生理作用。
近年来，人们研究发现IL-6与许多疾病特别是免疫相关疾病如肾小球肾炎发生发展密切相关[4]。但IL-6在小儿原发性肾病综合征发病机理中的作用尚不明，结论颇不一致，如Garin等[5]观察发现原发性微小病变型肾病(MCNS)患者血清IL-6活性较正常对照组增高；而李成荣等[6]研究发现单纯性肾病患儿血清IL-6活性较正常对照组明显下降，INS患儿IL-6血清水平的高低是否与其外周血单个核细胞IL-6基因表达异常有关? 文献尚未确定。本研究在我们以往研究INS患儿外周血IL-6水平增高的结果基础上进一步研究发现，INS患儿外周血单个核细胞内IL-6 mRNA的表达显著高于正常对照组，提示INS患儿单个核细胞IL-6基因处于激活状态，基因转录增强，故血清IL-6水平升高。
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Gp130是IL-6靶细胞膜上的一种Ⅰ型糖蛋白分子，与IL-6的广泛生物学活性有关。近期研究证明：IL-6首先与IL-6受体结合，然后才识别Gp130，三者共同形成有生物活性的三元复合体，该复合体立即激活细胞内的多种激酶，导致蛋白磷酸化和核基因表达，促进/抑制细胞生长，或诱导细胞分化[7],此外IL-6和Gp130之间可相互调节。目前Gp130在肾病综合征发病机制中的作用尚不明，本研究采用原位杂交技术观察到INS患儿外周血单个核细胞Gp130 mRNA表达显著高于正常小儿，提示Gp130表达异常也可能参与了INS分子发病机制过程，但有关具体的分子机制有待进一步研究。
参考文献
1 Murakamim M，Narazaki M，Hibi M，et al. Critical cytoplasmic region of the interlurkin-6 signal transducer GP130 is conserved in the cytokine receptor family .Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:11394-11453.
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2 小儿肾脏疾病科研协作组.《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志,1981，19：241-243.
3 Content Y,Wit LD, Pierard M, et al. Secretory proteins induced in human fibroblasts under conditions used for the production of interferon .Proc Natl Acad Sci USA， 1982，79:2768-2772.
4 孙林.白细胞介素6及其在肾脏病学中的意义[综述]. 国外医学生理病理学科与临床分册,1993，12:90-92.
5 Garin EH, Corontzes N. Effect of interleukin-6 on glomerular basement membrane (GBM) 35Sulfate uptake. Pediatr Res, 1991，29:343A.
6 李成荣，杨锡强，王利佳，等.小儿单纯性肾病综合征白细胞介素-6探讨.上海免疫学杂志,1990,10：349-350.
7 Saito M, Yoshida KJ, Hibi M, et al.Molecular cloning of a murine IL-6 receptor associated signal transducer,GP130,and its regulated expression in vivo. J Immunol, 1992,148:4066-4071., 百拇医药