生长激素和胰岛素样生长因子与小儿免疫系统发育的研究
作者：杨毅 郭履 马力 刘湘云
单位：200032 上海医科大学儿科医院
关键词：促生长素；生长调节素类；免疫系统；儿童
中华儿科杂志/980604 【摘要】 目的 研究生长激素(GH)和胰岛素样生长因子(IGFs)对小儿免疫系统发育的调节作用及其机制。方法 采用放射受体竞争结合、核酸分子杂交、免疫组化等方法，从蛋白质和(或)基因表达水平系统观察了GH及其受体(GHR)、IGF多肽(IGF-I、-II)、受体(IGF-IR、-IIR)和结合蛋白(IGFBP1-6)在小儿外周血淋巴细胞(PBL)、胸腺和淋巴结的表达、分布与调节。结果 GHR在PBL的表达呈年龄相关的变化；胸腺、淋巴结和PBL都有GH合成细胞，且GH缺乏患儿与正常人无异；IGFs多肽、受体和结合蛋白基因在儿童胸腺和淋巴结均有不同水平的表达，提示它们在免疫器官局部以自分泌或旁分泌的形式产生和发挥作用。结论 GH-IGF对于影响和调节小儿免疫系统发育具有重要意义。
, 百拇医药
The effects of growth hormone and insulin-like growth factor on development of the immune system in childhood
Yang Yi, Guo Luzhou, Ma Li, et al.
Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To study the effect of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor (IGF) on development of the immune system in childhood. Methods RRA, dot blot, in situ hybridization, and immunohistochemistry were used to determine the expression and distribution of GH, growth hormone receptor (GHR), IGFs, IGF receptors (IGFRs) and IGFs binding protein genes and/or proteins in children′s thymus, lymphonodus and peripheral blood lymphocytes (PBL). Results The age-related GHR expression was found in PBL. The GH synthesizing cells were found in thymus, lymphonodus and PBL. There was no significant difference between the children with GH deficiency and the controls in the levels of GH synthesizing cells. All compounds of IGF genes were expressed in immune organs and cells in varying levels, and were related to the immune development and functions.Conclusion GH-IGF may play an important role in the regulation of development and functions of the immune system in childhood.
, 百拇医药
【Key words】 Somatotropin Somatomedins Immune system Child
生长激素(GH)是调节小儿生长发育最重要的内分泌激素之一，胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth factors，IGFs)与GH的作用密切相关，不少研究结果提示，GH和IGFs对免疫系统发育及功能维持可能具有重要意义[1，2]。为了深入研究GH-IGF对小儿免疫系统发育的调控影响及其机制，我们采用放射受体结合，核酸分子杂交，免疫组化等方法，从蛋白质和(或)基因表达水平系统观察了GH及其受体(GHR)，IGFs多肽(IGF-I、-II)及其受体(IGF-IR、-IIR)，IGF结合蛋白(IGF BP1-6)在小儿外周血淋巴细胞，胸腺和淋巴结的表达、分布与调节。
资料及方法
一、不同年龄阶段外周血淋巴细胞GHR的检测
, 百拇医药
1. 标本来源：不同年龄阶段静脉血标本分别来自上海市血液中心健康献血者(成人组)、本院体检儿童、本校妇产科医院产房(新生儿脐血组)。
2. 放射受体竞争结合分析：静脉血常规分离单个核细胞后，用玻器吸附法去除巨噬细胞，淋巴细胞采用125I-hGH(卫生部上海生物制品研究所产品)和非标记的rhGH(中国科学院上海细胞研究所提供)，参照Kiess等[3]的方法检测GHR总结合率和特异性结合率。
3. GHR mRNA水平检测:应用聚合酶链反应(PCR)技术构建hGHR DNA探针，32P随机引物法标记，淋巴细胞抽提RNA后进行斑点杂交，放射自显影底片作灰度扫描和定量分析。
二、淋巴细胞合成GH的观察
1.标本来源与制备:正常胸腺和淋巴结取自本院外科手术切除标本，常规制备石蜡片;垂体性侏儒症系本院门诊随访患儿的标本作全血培养72小时后涂片固定。
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2.免疫组化染色:采用兔抗人GH抗体(购自DAKO公司)作ABC法免疫组化染色。
三、原位杂交观测IGFs各基因在胸腺和淋巴结的表达与分布
1.组织标本来源与制备:胸腺和淋巴结标本来源同上，4%多聚甲醛固定后，制备冰冻切片。
2.原位杂交:hIGF-I、-II、-IR、-IIR、BP 1-6十个cDNA探针均由德国慕尼黑大学儿童医院W.Kiess博士惠赠，采用德国宝灵曼公司的DIG RNA Labeling Kit转录标记反意义RNA探针。组织切片在42℃杂交过夜，免疫显色用德国宝灵曼公司的DIG nucleic acid detection kit。
结果
一、各年龄组淋巴细胞GHR总结合百分率和特异结合百分率的测定结果(图1)
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图1 各年龄阶段淋巴细胞GHR总结合率和特异结合率
用t检验对各组间均值差别进行显著性检验，成人组GHR总结合率和特异结合率均高于各儿童年龄组和脐血组，差别有显著意义(t=4.429、2.636，P<0.01、P<0.05)；各儿童组和脐血组之间差异无显著意义。
二、不同年龄阶段淋巴细胞GHR mRNA水平(图2)
初生时最低，而后迅速增加，但在整个儿童期直至青春前期都没有明显变化(P>0.05)，在成年期达到高峰，各儿童组与成年组相比，差异均有非常显著意义(t=6.649、4.279，P<0.001)。
图2 不同年龄阶段淋巴细胞hGHR mRNA水平检测结果
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三、免疫组化染色显示胸腺、淋巴结和外周血涂片均可见GH阳性细胞(棕黄染色)(图3)
在胸腺中GH阳性细胞分布于胸腺髓质，而皮质缺如;在淋巴结GH阳性细胞集中于副皮质区和髓质。垂体性侏儒症患儿淋巴细胞无论是自发的，或经PHA、PWM诱导后的GH阳性细胞百分率，与同龄正常儿或成人比较，差异均无显著意义。
四、原位杂交结果
发现10个IGF基因在胸腺、淋巴结都有不同程度的表达。在胸腺IGF-I探针阳性杂交细胞多分布于小叶皮质区和间隔区；IGF-IR和IGF-IIR探针阳性杂交细胞也多见于皮质区；6种结合蛋白基因均有较丰富的表达，其中IGF BP 1、3、6 mRNA主要分布于小叶间隔和外皮质区(紫色染色细胞)(图4)，IGF BP 2、4、5mRNA分布较均匀。在淋巴结IGFs基因主要在间质网状细胞表达(图5)，IGF-I、IGF BP2和IGFBP3mRNA阳性表达细胞在淋巴结较均匀分布；IGF-IIR主要分布于成熟B细胞和巨噬细胞(图6)；IGFBP4、5 mRNA阳性表达多见于副皮质区。
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讨论
70年代就有学者证实人的胸腺和淋巴结上存在GHR[4]，80年代后期有学者发现淋巴细胞能自身合成和分泌GH[5]。这些研究结果提示，除了经典的GH产生途径外，免疫器官和细胞也能通过自分泌或旁分泌GH在免疫系统产生调节作用。然而GH如何影响免疫系统功能还有待深入研究。不少实验结果显示，人外周血淋巴细胞和某些淋巴母细胞株表达IGF受体[6]和产生IGF结合蛋白[7]，提示GH对免疫细胞的调节可能也通过IGFs介导。 我们的研究结果表明，小儿从初生到成年期其淋巴细胞GHR，无论在受体结合水平还是在mRNA转录水平方面，都表现出与年龄相关的变化。这一变化与小儿免疫系统功能发育成熟的年龄过程有平行趋势，说明淋巴细胞在其生长分化和功能成熟过程中受到GH的影响与调节。
我们的实验证实，人胸腺、淋巴结和PBL都有GH染色阳性细胞，则进一步说明淋巴细胞各个发育阶段，包括非抗原依赖和抗原依赖发育阶段的淋巴细胞都有GH合成，且在活化过程中一些原来不合成GH的细胞有可能转为GH合成细胞，使局部GH产生增多。GH缺乏的垂体性侏儒患儿无明显的免疫缺陷，检测其淋巴细胞合成GH能力仍属正常，这可能是其免疫功能得以维持正常的原因之一。
, 百拇医药
IGF-I作为GH作用的介质呈GH依赖性调节。我们采用原位杂交的方法对儿童胸腺和淋巴结的观察，结果都显示了IGF-I基因较丰富的表达，在胸腺主要分布于未成熟细胞集中的皮质区，而在淋巴结主要是间质的网状细胞。说明IGF-I在胸腺淋巴细胞的自分泌和在淋巴结的旁分泌，提示通过局部产生IGF-I影响淋巴细胞成熟分化和功能维持，可能是GH对胸腺和淋巴结的作用途径之一。
IGF BPs作为IGF-I的储存和运输载体，常与IGF-I同步产生，对游离IGF-I浓度起着重要调节作用。我们还发现，IGF BP 1-6基因在胸腺和淋巴结都有较高水平的转录，且其分布与IGF-I mRNA是一致的，进一步提示IGF-I在上述免疫器官的自分泌和旁分泌，IGF BPs作为活跃的调节因子，还可通过影响IGF-I与IGFRs的结合参与IGFs对免疫系统的作用。
我们的研究发现IGF-IR和IGF-IIR基因在胸腺和淋巴结都有表达，IGF-IR mRNA在胸腺皮质较丰富，可能主要介导IGF-I的促生长分化作用。淋巴结是产生特异性体液免疫的场所之一，IGF-IIR作为一种多功能受体参与细胞生理代谢，其在成熟B淋巴细胞和间质巨噬细胞较丰富的表达，可能与免疫球蛋白产生和巨噬细胞加工处理抗原的过程有关。
, 百拇医药
总之，我们的研究证实，GH-IGF的各组分在免疫系统器官和细胞都有程度不同的表达，并与免疫发育和功能状态密切相关，充分显示了GH-IGF影响和调节小儿免疫系统发育成熟的重要意义。提示临床应用rhGH和rhIGF-I治疗生长障碍、营养不良等，对患儿的免疫系统发育成熟可能也有促进作用，然而对于非GH缺乏患儿，大剂量长期给药是否干扰免疫功能，值得进一步研究。
图3 位于髓质的胸腺细胞,胞浆GH染色阳性.ABC法*100(DAB)
图4 原位杂交IGFBP3MRNA阳性表达主要分布于胸腺小叶间隔细胞NBT*100
图5 原位杂交IGFBP2MRNA阳性表达较均匀分布于淋巴结网状细胞NBT*100
图6 原位杂交IGF-IIRMRNA阳性表达多分布于淋结生发中心"帽状区"和副皮质区NBT*100
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参考文献
1 Douglas A, Weigent J, Edwin B. Growth hormone and the immune system. Progress in NeuroEndocrinImmunology, 1990, 3:231-241.
2 Marie C, Gelato. Growth hormone-insulinlike growth factor I and immune function. TEM, 1993, 4: 106-110.
3 Kiess W， Butenandt O. Specific growth hormone receptors on human peripheral mononuclear cells: reexpression, identification, and characterization. J Clin Endocrinol Metab, 1985, 60: 740-746.
, http://www.100md.com
4 Arrenbrecht S. Specific binding of growth hormone to thymocytes. Nature, 1974, 252: 255-257.
5 Hattori N, Shimatsu A, Sugita M, et al. Immunoreactive growth hormone(GH)secretion by human lymphocytes: augmented release by exogenous GH. Biochem Biophys Res Commun， 1990, 168: 396-401.
6 Kooijman R, Willems M, de Haas CJC, et al. Expression of type I insulin-like growth factor receptors on human peripheral blood mononuclear cells. Endocrino， 1992, 131: 2244-2250.
7 Nyman T, Pekonen F. The expression of insulin-like growth factor and their binding proteins in normal human lymphocytes. Acta Endocrinol, 1993, 128: 168-172, 百拇医药
单位：200032 上海医科大学儿科医院
关键词：促生长素；生长调节素类；免疫系统；儿童
中华儿科杂志/980604 【摘要】 目的 研究生长激素(GH)和胰岛素样生长因子(IGFs)对小儿免疫系统发育的调节作用及其机制。方法 采用放射受体竞争结合、核酸分子杂交、免疫组化等方法，从蛋白质和(或)基因表达水平系统观察了GH及其受体(GHR)、IGF多肽(IGF-I、-II)、受体(IGF-IR、-IIR)和结合蛋白(IGFBP1-6)在小儿外周血淋巴细胞(PBL)、胸腺和淋巴结的表达、分布与调节。结果 GHR在PBL的表达呈年龄相关的变化；胸腺、淋巴结和PBL都有GH合成细胞，且GH缺乏患儿与正常人无异；IGFs多肽、受体和结合蛋白基因在儿童胸腺和淋巴结均有不同水平的表达，提示它们在免疫器官局部以自分泌或旁分泌的形式产生和发挥作用。结论 GH-IGF对于影响和调节小儿免疫系统发育具有重要意义。
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The effects of growth hormone and insulin-like growth factor on development of the immune system in childhood
Yang Yi, Guo Luzhou, Ma Li, et al.
Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To study the effect of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor (IGF) on development of the immune system in childhood. Methods RRA, dot blot, in situ hybridization, and immunohistochemistry were used to determine the expression and distribution of GH, growth hormone receptor (GHR), IGFs, IGF receptors (IGFRs) and IGFs binding protein genes and/or proteins in children′s thymus, lymphonodus and peripheral blood lymphocytes (PBL). Results The age-related GHR expression was found in PBL. The GH synthesizing cells were found in thymus, lymphonodus and PBL. There was no significant difference between the children with GH deficiency and the controls in the levels of GH synthesizing cells. All compounds of IGF genes were expressed in immune organs and cells in varying levels, and were related to the immune development and functions.Conclusion GH-IGF may play an important role in the regulation of development and functions of the immune system in childhood.
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【Key words】 Somatotropin Somatomedins Immune system Child
生长激素(GH)是调节小儿生长发育最重要的内分泌激素之一，胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth factors，IGFs)与GH的作用密切相关，不少研究结果提示，GH和IGFs对免疫系统发育及功能维持可能具有重要意义[1，2]。为了深入研究GH-IGF对小儿免疫系统发育的调控影响及其机制，我们采用放射受体结合，核酸分子杂交，免疫组化等方法，从蛋白质和(或)基因表达水平系统观察了GH及其受体(GHR)，IGFs多肽(IGF-I、-II)及其受体(IGF-IR、-IIR)，IGF结合蛋白(IGF BP1-6)在小儿外周血淋巴细胞，胸腺和淋巴结的表达、分布与调节。
资料及方法
一、不同年龄阶段外周血淋巴细胞GHR的检测
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1. 标本来源：不同年龄阶段静脉血标本分别来自上海市血液中心健康献血者(成人组)、本院体检儿童、本校妇产科医院产房(新生儿脐血组)。
2. 放射受体竞争结合分析：静脉血常规分离单个核细胞后，用玻器吸附法去除巨噬细胞，淋巴细胞采用125I-hGH(卫生部上海生物制品研究所产品)和非标记的rhGH(中国科学院上海细胞研究所提供)，参照Kiess等[3]的方法检测GHR总结合率和特异性结合率。
3. GHR mRNA水平检测:应用聚合酶链反应(PCR)技术构建hGHR DNA探针，32P随机引物法标记，淋巴细胞抽提RNA后进行斑点杂交，放射自显影底片作灰度扫描和定量分析。
二、淋巴细胞合成GH的观察
1.标本来源与制备:正常胸腺和淋巴结取自本院外科手术切除标本，常规制备石蜡片;垂体性侏儒症系本院门诊随访患儿的标本作全血培养72小时后涂片固定。
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2.免疫组化染色:采用兔抗人GH抗体(购自DAKO公司)作ABC法免疫组化染色。
三、原位杂交观测IGFs各基因在胸腺和淋巴结的表达与分布
1.组织标本来源与制备:胸腺和淋巴结标本来源同上，4%多聚甲醛固定后，制备冰冻切片。
2.原位杂交:hIGF-I、-II、-IR、-IIR、BP 1-6十个cDNA探针均由德国慕尼黑大学儿童医院W.Kiess博士惠赠，采用德国宝灵曼公司的DIG RNA Labeling Kit转录标记反意义RNA探针。组织切片在42℃杂交过夜，免疫显色用德国宝灵曼公司的DIG nucleic acid detection kit。
结果
一、各年龄组淋巴细胞GHR总结合百分率和特异结合百分率的测定结果(图1)
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图1 各年龄阶段淋巴细胞GHR总结合率和特异结合率
用t检验对各组间均值差别进行显著性检验，成人组GHR总结合率和特异结合率均高于各儿童年龄组和脐血组，差别有显著意义(t=4.429、2.636，P<0.01、P<0.05)；各儿童组和脐血组之间差异无显著意义。
二、不同年龄阶段淋巴细胞GHR mRNA水平(图2)
初生时最低，而后迅速增加，但在整个儿童期直至青春前期都没有明显变化(P>0.05)，在成年期达到高峰，各儿童组与成年组相比，差异均有非常显著意义(t=6.649、4.279，P<0.001)。
图2 不同年龄阶段淋巴细胞hGHR mRNA水平检测结果
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三、免疫组化染色显示胸腺、淋巴结和外周血涂片均可见GH阳性细胞(棕黄染色)(图3)
在胸腺中GH阳性细胞分布于胸腺髓质，而皮质缺如;在淋巴结GH阳性细胞集中于副皮质区和髓质。垂体性侏儒症患儿淋巴细胞无论是自发的，或经PHA、PWM诱导后的GH阳性细胞百分率，与同龄正常儿或成人比较，差异均无显著意义。
四、原位杂交结果
发现10个IGF基因在胸腺、淋巴结都有不同程度的表达。在胸腺IGF-I探针阳性杂交细胞多分布于小叶皮质区和间隔区；IGF-IR和IGF-IIR探针阳性杂交细胞也多见于皮质区；6种结合蛋白基因均有较丰富的表达，其中IGF BP 1、3、6 mRNA主要分布于小叶间隔和外皮质区(紫色染色细胞)(图4)，IGF BP 2、4、5mRNA分布较均匀。在淋巴结IGFs基因主要在间质网状细胞表达(图5)，IGF-I、IGF BP2和IGFBP3mRNA阳性表达细胞在淋巴结较均匀分布；IGF-IIR主要分布于成熟B细胞和巨噬细胞(图6)；IGFBP4、5 mRNA阳性表达多见于副皮质区。
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讨论
70年代就有学者证实人的胸腺和淋巴结上存在GHR[4]，80年代后期有学者发现淋巴细胞能自身合成和分泌GH[5]。这些研究结果提示，除了经典的GH产生途径外，免疫器官和细胞也能通过自分泌或旁分泌GH在免疫系统产生调节作用。然而GH如何影响免疫系统功能还有待深入研究。不少实验结果显示，人外周血淋巴细胞和某些淋巴母细胞株表达IGF受体[6]和产生IGF结合蛋白[7]，提示GH对免疫细胞的调节可能也通过IGFs介导。 我们的研究结果表明，小儿从初生到成年期其淋巴细胞GHR，无论在受体结合水平还是在mRNA转录水平方面，都表现出与年龄相关的变化。这一变化与小儿免疫系统功能发育成熟的年龄过程有平行趋势，说明淋巴细胞在其生长分化和功能成熟过程中受到GH的影响与调节。
我们的实验证实，人胸腺、淋巴结和PBL都有GH染色阳性细胞，则进一步说明淋巴细胞各个发育阶段，包括非抗原依赖和抗原依赖发育阶段的淋巴细胞都有GH合成，且在活化过程中一些原来不合成GH的细胞有可能转为GH合成细胞，使局部GH产生增多。GH缺乏的垂体性侏儒患儿无明显的免疫缺陷，检测其淋巴细胞合成GH能力仍属正常，这可能是其免疫功能得以维持正常的原因之一。
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IGF-I作为GH作用的介质呈GH依赖性调节。我们采用原位杂交的方法对儿童胸腺和淋巴结的观察，结果都显示了IGF-I基因较丰富的表达，在胸腺主要分布于未成熟细胞集中的皮质区，而在淋巴结主要是间质的网状细胞。说明IGF-I在胸腺淋巴细胞的自分泌和在淋巴结的旁分泌，提示通过局部产生IGF-I影响淋巴细胞成熟分化和功能维持，可能是GH对胸腺和淋巴结的作用途径之一。
IGF BPs作为IGF-I的储存和运输载体，常与IGF-I同步产生，对游离IGF-I浓度起着重要调节作用。我们还发现，IGF BP 1-6基因在胸腺和淋巴结都有较高水平的转录，且其分布与IGF-I mRNA是一致的，进一步提示IGF-I在上述免疫器官的自分泌和旁分泌，IGF BPs作为活跃的调节因子，还可通过影响IGF-I与IGFRs的结合参与IGFs对免疫系统的作用。
我们的研究发现IGF-IR和IGF-IIR基因在胸腺和淋巴结都有表达，IGF-IR mRNA在胸腺皮质较丰富，可能主要介导IGF-I的促生长分化作用。淋巴结是产生特异性体液免疫的场所之一，IGF-IIR作为一种多功能受体参与细胞生理代谢，其在成熟B淋巴细胞和间质巨噬细胞较丰富的表达，可能与免疫球蛋白产生和巨噬细胞加工处理抗原的过程有关。
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总之，我们的研究证实，GH-IGF的各组分在免疫系统器官和细胞都有程度不同的表达，并与免疫发育和功能状态密切相关，充分显示了GH-IGF影响和调节小儿免疫系统发育成熟的重要意义。提示临床应用rhGH和rhIGF-I治疗生长障碍、营养不良等，对患儿的免疫系统发育成熟可能也有促进作用，然而对于非GH缺乏患儿，大剂量长期给药是否干扰免疫功能，值得进一步研究。
图3 位于髓质的胸腺细胞,胞浆GH染色阳性.ABC法*100(DAB)
图4 原位杂交IGFBP3MRNA阳性表达主要分布于胸腺小叶间隔细胞NBT*100
图5 原位杂交IGFBP2MRNA阳性表达较均匀分布于淋巴结网状细胞NBT*100
图6 原位杂交IGF-IIRMRNA阳性表达多分布于淋结生发中心"帽状区"和副皮质区NBT*100
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参考文献
1 Douglas A, Weigent J, Edwin B. Growth hormone and the immune system. Progress in NeuroEndocrinImmunology, 1990, 3:231-241.
2 Marie C, Gelato. Growth hormone-insulinlike growth factor I and immune function. TEM, 1993, 4: 106-110.
3 Kiess W， Butenandt O. Specific growth hormone receptors on human peripheral mononuclear cells: reexpression, identification, and characterization. J Clin Endocrinol Metab, 1985, 60: 740-746.
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4 Arrenbrecht S. Specific binding of growth hormone to thymocytes. Nature, 1974, 252: 255-257.
5 Hattori N, Shimatsu A, Sugita M, et al. Immunoreactive growth hormone(GH)secretion by human lymphocytes: augmented release by exogenous GH. Biochem Biophys Res Commun， 1990, 168: 396-401.
6 Kooijman R, Willems M, de Haas CJC, et al. Expression of type I insulin-like growth factor receptors on human peripheral blood mononuclear cells. Endocrino， 1992, 131: 2244-2250.
7 Nyman T, Pekonen F. The expression of insulin-like growth factor and their binding proteins in normal human lymphocytes. Acta Endocrinol, 1993, 128: 168-172, 百拇医药