体外扩增脐血CD+34细胞
作者：刘颉 李桂霞 丘峰云 阮文宾
单位：香港中文大学医学院儿科学系
关键词：抗原；CD34；胎血；造血干细胞
中华儿科杂志/980706 【摘要】 目的 探讨某些造血细胞因子对脐血造血干细胞的扩增效应。方法 脐血CD+34细胞经免疫磁珠法分选后，在含有重组人Flt3配基(rhFlt3-L)、干细胞因子(rhSCF)、白细胞介素1β(rhIL-1β)、rhIL-3和rhIL-6的液体培养体系中培养7至14天。采用流式细胞仪、造血细胞集落和长期培养起始细胞(LTCIC)方法检测扩增后的细胞。结果 在上述细胞因子作用下，脐血CD+34细胞明显扩增。细胞总数、CD+34细胞和造血细胞集落总数在第7天分别扩增31±19、4±5、10±67倍、第9天分别扩增236±106、20±20、57±62，第14天分别扩增770±505、30±30、189±133。扩增的细胞以髓系祖细胞为主，极少红系祖细胞，无淋巴系细胞，并含有LTCIC。结论 理想的造血细胞因子的组合可以加速体外扩增脐血CD+34细胞，在细胞数量和质量上可能满足成人移植的需要。
, http://www.100md.com
Ex vivo expansion of CD+34 stem cells and progenitor cells from cord blood Jie Liu, Karen Li, Fung-Wan Yau, et al. Department of Paediatrics, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
【Abstract】 Objective To expand umbilical cord blood (UCB) in the presence of cytokine combinations.Methods CD+34 cells were enriched using immuno-magnetic beads and cultured in cytokine combinations. The expanded cells were characterized by flow cytometry, colony forming units (CFU) and long term culture initiating cells (LTCIC) assays.Results UCB CD+34 cells could be significantly expanded in the presence of flt3-ligand (Flt3-L), stem cell factor (SCF), interleukin 3 (IL-3), IL-6, and IL-1β. The total haematopoietic cells, CD+34 cells and CFU were increased by 31±19, 4±5, and 10±67 folds on day 7 of culture; 236±106, 20±20, 57±62 folds on day 9 of culture, and 770±505, 30±30, 189±133 folds on day 14 of culture. These cells were mostly of the myeloid lineage (CD+34, CD+33, CD+45, CD+14, CD+38), with very few erythropoietin progenitors, and no lymphocyte (CD-3, CD-19, CD-16, CD-56). Expanded cells also contained LTCIC, which may contribute to long term engraftment if transplanted. Conclusion The results indicate that it is possible to expand UCB CD+34 cells ex vivo with the appropriate combination of cytokines. This approach may provide stem and progenitor cells for adult transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 Antigens, CD34 Fetal blood Hematopoietic stem cells
迄今为止，在全世界应用脐血移植治疗白血病、恶性实体肿瘤和某些非恶性血液系统疾病已超过400多例。有报道对体重70 kg的成年患者成功进行脐血移植。但大部分受脐血移植的是儿童。这主要是由于脐血的单位采集量少，所含有的造血干细胞数量难以用于体重超过70 kg的患者。另外，与骨髓和外周血移植相比较，脐血移植后中性粒细胞，尤其是血小板的增殖需要较长时间。因此，体外扩增造血干细胞数量及其它所需要的有关细胞(如中性粒细胞和巨核细胞)将可以满足成人移植的需要，提供足够的血小板或中性粒细胞。本研究的目的是探讨某些重组人造血细胞因子对脐血CD+34细胞的体外培养和扩增作用。
资料和方法
一、标本来源 一、标本来源
, 百拇医药
脐血标本来自香港中文大学威尔斯亲王医院足月妊娠健康产妇。以采血针从脐静脉穿刺取血，肝素抗凝(10 U/ml)。
二、脐血CD+34细胞的分选
脐血经磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后Ficoll-Hypaque(密度=1.077 g/ml; Pharmacia Biotech, Sweden)梯度离心，20℃，35分钟，速度1 350 r/min。收集单个核细胞后用PBS洗涤。将单个核细胞悬液(细胞总数<108)与100 μlFc受体(FcR)阻滞剂和100 μl磁珠标记的单克隆鼠抗人CD+34抗体QBEND/10 (MiltenyiBiotec, Germnay)。4℃孵育30分钟，洗涤2次。将标记了的细胞通过磁场中的分离柱，CD+34细胞将被吸附于分离柱，而CD-34细胞则被洗脱去除。将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞。
, 百拇医药
三、脐血CD+34细胞体外液体培养
细胞培养液含伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscoves mdified Dulbecco′ medium, IMDM)培养液(Gibco)，小牛血清20%(Gibco)，青霉素和链霉素(Gibco)，L-谷氨酸(Gibco)，和人重组Flt3配基(rhFlt3-L)100 ng/ml，干细胞因子(rhSCF)10 ng/ml，白细胞介素1β(rhIL-1β)3 ng/ml，rhIL-3 100 ng/ml，rhIL-6 100 ng/ml(Genzyme)。CD+34细胞(104/ml)在37℃，5%CO2条件下培养7～14天。培养液每7天半量换液。
四、三维流式细胞仪检测扩增细胞的表型
将扩增的细胞在不同时间收集，经洗涤后同时与三种不同的荧光标记单克隆鼠抗人抗体在4℃孵育20分钟。洗涤后用1%三聚甲醛固定细胞。所用的抗体包括：CD-34FITC，CD-38PE，CD-33PE，HLA-DR-PerCP，CD-3FITC，CD-19PE，CD-16PE，CD-56PE，CD-45PE，CD-14PE和对照抗体-FITC/PE，对照抗体-PerCP(Dako, Copenhagen, Denmark)。用FACScan, LysysⅡ流式细胞仪及分析软件，分析104个细胞。
, 百拇医药
五、造血细胞集落培养
采用甲基纤维素培养体系。其组成为甲基纤维素3%(Sigma)，小牛血清30%(Gibco)，牛血清白蛋白10%(Sigma)，造血因子包括rhSCF 20 ng/ml (Bachem, CA, USA)，重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子100 ng/ml (rhGM-CSF; Leucomax R, Sandoz, Switzerland)和重组人红细胞生成素1 U/ml(rhEpo; Eprex, Switzerland)。加入的扩增细胞数量为3 000/ml，在37℃，5%CO2孵育14天后，相差显微镜下分别计数单核-粒细胞集落生成单位(CFU-GM)，红系集落生成单位(CFU-E)，红系爆式集落生成单位(BFU-E)，混合集落生成单位(CFU-mix)的集落数量。
六、长期培养起始细胞(long-term culture initiating cells, LTCIC)
, 百拇医药
1.建立骨髓基质细胞层2×106/ml正常成人骨髓有核细胞种入25cm2培养瓶内与长期组织培养液培养。长期组织培养液含小牛血清12.5%，马血清12.5%(Gibco)，氢化可的松1 mmol/L(Sigma)，抗生素和IMDM。每7天半量换液，待基质细胞铺满瓶底后给予3 000拉德γ射线照射以杀死残留在基质中的造血祖细胞及减低基质细胞的增殖能力。
2.将扩增第9天的细胞与照射后的骨髓基质细胞层一起培养，每7天半量换液。从培养的第5周起至第14周，每周换液时收集游离的细胞做集落培养。
结果
一、脐血CD+34细胞的体外扩增变化
脐血CD+34细胞对Flt3-L，SCF，IL-1β，IL-3，IL-6五种细胞因子的组合具有良好的扩增反应(附表)。有核细胞总数随培养的时间延长迅速倍增。虽然CD+34细胞的百分比随着扩增时间的增加而减少，但由于扩增细胞总数明显增加，所以CD+34细胞的总数明显增加。
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附表 不同培养时间脐血CD+34细胞
的扩增情况(n=6，
±s，个) 时间
有核细
胞总数
CD+34细
胞总数
造血细胞
集落总数
第7天
31± 19
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4± 5
10± 67
第9天
236±106
20±20
57± 62
第14天
770±505
30±30
189±133
二、扩增细胞的表型
大部分扩增的细胞为髓系祖细胞包括：CD++34、38、CD+34DR+、CD++34、33、无T、B淋巴细胞和杀伤细胞的表型存在，即CD-3、CD-19、CD-16、CD-56。
, 百拇医药
三、扩增细胞的集落产率
扩增细胞形成集落的主要成分为CFU-GM，极少形成BFU-E，CFU-E，CFU-mix。与扩增前相比，扩增后形成的集落总数明显增加(附表)，但是，随着扩增时间的增加，集落的产生率开始下降，而且集落体积(组成集落细胞数)减小。
四、扩增细胞中的LTCIC
体外长期培养LTCIC的方法是至今为止用来证明最幼稚的造血祖细胞的方法[1]。从开始培养至第5周后产生集落为LTCIC，本组结果显示扩增第9天的细胞在第5至9周形成LTCIC的集落(结果省略)。
讨论
本研究采用Flt3-L，SCF，IL-1β，IL-3，IL-6早期造血细胞因子组合，结果显示能使脐血CD+34细胞在体外短期内明显扩增。扩增的细胞以髓系祖细胞为主，极少红系祖细胞，无淋巴系细胞。扩增的细胞中含有LTCIC，从理论上提示可以满足成人移植需要，提供足够的中性粒细胞和重建长期造血功能。
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Flt3-L是最近发现的新的造血细胞因子，在造血早期的调节过程中起重要作用[2]。它与SCF相似，单独使用只能刺激少量造血祖细胞增殖，但与其他细胞因子协同作用，能够明显刺激祖细胞增殖。两者的不同之处是，SCF能够刺激红系祖细胞增殖，Flt3-L则无此作用[3]。另外，Flt3-L刺激早期祖细胞(例如CD+34CD-38细胞)增殖，而这些细胞一般对其他早期造血细胞因子包括SCF无反应[4]。
脐血CD+34细胞经扩增培养后，一方面细胞总数和造血祖细胞的总数均显著增加；另一方面，造血祖细胞占细胞总数的百分比随着时间的增加而明显下降，并且祖细胞趋于成熟分化。因此，作者认为扩增时间短，祖细胞的分化成熟低，具有长期造血能力的LTCIC多。虽然脐血CD+34细胞具有良好的扩增反应，但是如何在体外扩增的同时，防止祖细胞过度分化尚未得到解决。
, 百拇医药
造血干细胞的移植成功，取决于移植后是否能加速移植受体重建早期和长期造血功能。动物实验证明体外扩增的骨髓细胞能在移植受体重建造血功能[5]。有临床研究报道体外扩增的骨髓CD+34细胞能够在接收移植的病人体内重建早期造血功能[6]，但也有临床研究报道体外扩增的外周血CD+34细胞不能在移植受体重建早期造血功能[7]。关于体外扩增的脐血CD+34细胞是否能在接收移植的病人体内重建造血功能至今尚无报道。另外，虽然体外扩增的细胞中有LTCIC，但是这些LTCIC是否能使移植受体重建长期造血功能还有待进一步研究。
参考文献
1 Sutherland HJ, Eaves CJ, Eaves AC, et al. Characterization and partial purification of human marrow cells capable of initiating long-term hematopoiesis in vitro. Blood, 1989,74：1563-1570.
, 百拇医药
2 Lyman SD, James L, Johnson L, et al. Cloning of the human homologue of the murine flt3 ligand: a growth factor for early hematopoietic progenitor cells. Blood, 1994,83：2795-2801.
3 McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, et al. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD+34 hematopoietic progenitor cells. Blood, 1995,86：3413-3420.
4 Shah AJ, Smogozewska EM, Hannum C, et al. Flt3 ligand induces proliferation of quiescent human bone marrow CD+34 CD-38 cells and maintains progenitor cells in vitro. Blood, 1996, 87：3563-3570.
, 百拇医药
5 Scaradavou A, Isola L, Rubinstein P, et al. A murine model for human cord blood transplantation: near-term fetal and neonatal peripheral blood cells can achieve long-term bone marrow engraftment in sublethally irradiated adult recipients. Blood, 1997,89：1089-1099.
6 Stiff P, Oldenberg D, Hsi E, et al. Transplantation of ex vivo expanded cells grown in Aastrom stromal-based perfusion bioreactors from small marrow aliquots (40 ml) products durable hematopoietic reconstitution after ablative chemotherapy. Blood, 1997,90：395a.
7 Holyoake TL, Alcorn MJ, Richmond L, et al. CD34 positive PBSC expanded ex vivo may not provide durable engraftment following myeloablative chemoradiotherapy regimens. Bone Marrow Transplant, 1997, 19：1095-1101., 百拇医药
单位：香港中文大学医学院儿科学系
关键词：抗原；CD34；胎血；造血干细胞
中华儿科杂志/980706 【摘要】 目的 探讨某些造血细胞因子对脐血造血干细胞的扩增效应。方法 脐血CD+34细胞经免疫磁珠法分选后，在含有重组人Flt3配基(rhFlt3-L)、干细胞因子(rhSCF)、白细胞介素1β(rhIL-1β)、rhIL-3和rhIL-6的液体培养体系中培养7至14天。采用流式细胞仪、造血细胞集落和长期培养起始细胞(LTCIC)方法检测扩增后的细胞。结果 在上述细胞因子作用下，脐血CD+34细胞明显扩增。细胞总数、CD+34细胞和造血细胞集落总数在第7天分别扩增31±19、4±5、10±67倍、第9天分别扩增236±106、20±20、57±62，第14天分别扩增770±505、30±30、189±133。扩增的细胞以髓系祖细胞为主，极少红系祖细胞，无淋巴系细胞，并含有LTCIC。结论 理想的造血细胞因子的组合可以加速体外扩增脐血CD+34细胞，在细胞数量和质量上可能满足成人移植的需要。
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Ex vivo expansion of CD+34 stem cells and progenitor cells from cord blood Jie Liu, Karen Li, Fung-Wan Yau, et al. Department of Paediatrics, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
【Abstract】 Objective To expand umbilical cord blood (UCB) in the presence of cytokine combinations.Methods CD+34 cells were enriched using immuno-magnetic beads and cultured in cytokine combinations. The expanded cells were characterized by flow cytometry, colony forming units (CFU) and long term culture initiating cells (LTCIC) assays.Results UCB CD+34 cells could be significantly expanded in the presence of flt3-ligand (Flt3-L), stem cell factor (SCF), interleukin 3 (IL-3), IL-6, and IL-1β. The total haematopoietic cells, CD+34 cells and CFU were increased by 31±19, 4±5, and 10±67 folds on day 7 of culture; 236±106, 20±20, 57±62 folds on day 9 of culture, and 770±505, 30±30, 189±133 folds on day 14 of culture. These cells were mostly of the myeloid lineage (CD+34, CD+33, CD+45, CD+14, CD+38), with very few erythropoietin progenitors, and no lymphocyte (CD-3, CD-19, CD-16, CD-56). Expanded cells also contained LTCIC, which may contribute to long term engraftment if transplanted. Conclusion The results indicate that it is possible to expand UCB CD+34 cells ex vivo with the appropriate combination of cytokines. This approach may provide stem and progenitor cells for adult transplantation.
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【Key words】 Antigens, CD34 Fetal blood Hematopoietic stem cells
迄今为止，在全世界应用脐血移植治疗白血病、恶性实体肿瘤和某些非恶性血液系统疾病已超过400多例。有报道对体重70 kg的成年患者成功进行脐血移植。但大部分受脐血移植的是儿童。这主要是由于脐血的单位采集量少，所含有的造血干细胞数量难以用于体重超过70 kg的患者。另外，与骨髓和外周血移植相比较，脐血移植后中性粒细胞，尤其是血小板的增殖需要较长时间。因此，体外扩增造血干细胞数量及其它所需要的有关细胞(如中性粒细胞和巨核细胞)将可以满足成人移植的需要，提供足够的血小板或中性粒细胞。本研究的目的是探讨某些重组人造血细胞因子对脐血CD+34细胞的体外培养和扩增作用。
资料和方法
一、标本来源 一、标本来源
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脐血标本来自香港中文大学威尔斯亲王医院足月妊娠健康产妇。以采血针从脐静脉穿刺取血，肝素抗凝(10 U/ml)。
二、脐血CD+34细胞的分选
脐血经磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后Ficoll-Hypaque(密度=1.077 g/ml; Pharmacia Biotech, Sweden)梯度离心，20℃，35分钟，速度1 350 r/min。收集单个核细胞后用PBS洗涤。将单个核细胞悬液(细胞总数<108)与100 μlFc受体(FcR)阻滞剂和100 μl磁珠标记的单克隆鼠抗人CD+34抗体QBEND/10 (MiltenyiBiotec, Germnay)。4℃孵育30分钟，洗涤2次。将标记了的细胞通过磁场中的分离柱，CD+34细胞将被吸附于分离柱，而CD-34细胞则被洗脱去除。将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞。
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三、脐血CD+34细胞体外液体培养
细胞培养液含伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscoves mdified Dulbecco′ medium, IMDM)培养液(Gibco)，小牛血清20%(Gibco)，青霉素和链霉素(Gibco)，L-谷氨酸(Gibco)，和人重组Flt3配基(rhFlt3-L)100 ng/ml，干细胞因子(rhSCF)10 ng/ml，白细胞介素1β(rhIL-1β)3 ng/ml，rhIL-3 100 ng/ml，rhIL-6 100 ng/ml(Genzyme)。CD+34细胞(104/ml)在37℃，5%CO2条件下培养7～14天。培养液每7天半量换液。
四、三维流式细胞仪检测扩增细胞的表型
将扩增的细胞在不同时间收集，经洗涤后同时与三种不同的荧光标记单克隆鼠抗人抗体在4℃孵育20分钟。洗涤后用1%三聚甲醛固定细胞。所用的抗体包括：CD-34FITC，CD-38PE，CD-33PE，HLA-DR-PerCP，CD-3FITC，CD-19PE，CD-16PE，CD-56PE，CD-45PE，CD-14PE和对照抗体-FITC/PE，对照抗体-PerCP(Dako, Copenhagen, Denmark)。用FACScan, LysysⅡ流式细胞仪及分析软件，分析104个细胞。
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五、造血细胞集落培养
采用甲基纤维素培养体系。其组成为甲基纤维素3%(Sigma)，小牛血清30%(Gibco)，牛血清白蛋白10%(Sigma)，造血因子包括rhSCF 20 ng/ml (Bachem, CA, USA)，重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子100 ng/ml (rhGM-CSF; Leucomax R, Sandoz, Switzerland)和重组人红细胞生成素1 U/ml(rhEpo; Eprex, Switzerland)。加入的扩增细胞数量为3 000/ml，在37℃，5%CO2孵育14天后，相差显微镜下分别计数单核-粒细胞集落生成单位(CFU-GM)，红系集落生成单位(CFU-E)，红系爆式集落生成单位(BFU-E)，混合集落生成单位(CFU-mix)的集落数量。
六、长期培养起始细胞(long-term culture initiating cells, LTCIC)
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1.建立骨髓基质细胞层2×106/ml正常成人骨髓有核细胞种入25cm2培养瓶内与长期组织培养液培养。长期组织培养液含小牛血清12.5%，马血清12.5%(Gibco)，氢化可的松1 mmol/L(Sigma)，抗生素和IMDM。每7天半量换液，待基质细胞铺满瓶底后给予3 000拉德γ射线照射以杀死残留在基质中的造血祖细胞及减低基质细胞的增殖能力。
2.将扩增第9天的细胞与照射后的骨髓基质细胞层一起培养，每7天半量换液。从培养的第5周起至第14周，每周换液时收集游离的细胞做集落培养。
结果
一、脐血CD+34细胞的体外扩增变化
脐血CD+34细胞对Flt3-L，SCF，IL-1β，IL-3，IL-6五种细胞因子的组合具有良好的扩增反应(附表)。有核细胞总数随培养的时间延长迅速倍增。虽然CD+34细胞的百分比随着扩增时间的增加而减少，但由于扩增细胞总数明显增加，所以CD+34细胞的总数明显增加。
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附表 不同培养时间脐血CD+34细胞
的扩增情况(n=6，
±s，个) 时间有核细
胞总数
CD+34细
胞总数
造血细胞
集落总数
第7天
31± 19
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4± 5
10± 67
第9天
236±106
20±20
57± 62
第14天
770±505
30±30
189±133
二、扩增细胞的表型
大部分扩增的细胞为髓系祖细胞包括：CD++34、38、CD+34DR+、CD++34、33、无T、B淋巴细胞和杀伤细胞的表型存在，即CD-3、CD-19、CD-16、CD-56。
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三、扩增细胞的集落产率
扩增细胞形成集落的主要成分为CFU-GM，极少形成BFU-E，CFU-E，CFU-mix。与扩增前相比，扩增后形成的集落总数明显增加(附表)，但是，随着扩增时间的增加，集落的产生率开始下降，而且集落体积(组成集落细胞数)减小。
四、扩增细胞中的LTCIC
体外长期培养LTCIC的方法是至今为止用来证明最幼稚的造血祖细胞的方法[1]。从开始培养至第5周后产生集落为LTCIC，本组结果显示扩增第9天的细胞在第5至9周形成LTCIC的集落(结果省略)。
讨论
本研究采用Flt3-L，SCF，IL-1β，IL-3，IL-6早期造血细胞因子组合，结果显示能使脐血CD+34细胞在体外短期内明显扩增。扩增的细胞以髓系祖细胞为主，极少红系祖细胞，无淋巴系细胞。扩增的细胞中含有LTCIC，从理论上提示可以满足成人移植需要，提供足够的中性粒细胞和重建长期造血功能。
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Flt3-L是最近发现的新的造血细胞因子，在造血早期的调节过程中起重要作用[2]。它与SCF相似，单独使用只能刺激少量造血祖细胞增殖，但与其他细胞因子协同作用，能够明显刺激祖细胞增殖。两者的不同之处是，SCF能够刺激红系祖细胞增殖，Flt3-L则无此作用[3]。另外，Flt3-L刺激早期祖细胞(例如CD+34CD-38细胞)增殖，而这些细胞一般对其他早期造血细胞因子包括SCF无反应[4]。
脐血CD+34细胞经扩增培养后，一方面细胞总数和造血祖细胞的总数均显著增加；另一方面，造血祖细胞占细胞总数的百分比随着时间的增加而明显下降，并且祖细胞趋于成熟分化。因此，作者认为扩增时间短，祖细胞的分化成熟低，具有长期造血能力的LTCIC多。虽然脐血CD+34细胞具有良好的扩增反应，但是如何在体外扩增的同时，防止祖细胞过度分化尚未得到解决。
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造血干细胞的移植成功，取决于移植后是否能加速移植受体重建早期和长期造血功能。动物实验证明体外扩增的骨髓细胞能在移植受体重建造血功能[5]。有临床研究报道体外扩增的骨髓CD+34细胞能够在接收移植的病人体内重建早期造血功能[6]，但也有临床研究报道体外扩增的外周血CD+34细胞不能在移植受体重建早期造血功能[7]。关于体外扩增的脐血CD+34细胞是否能在接收移植的病人体内重建造血功能至今尚无报道。另外，虽然体外扩增的细胞中有LTCIC，但是这些LTCIC是否能使移植受体重建长期造血功能还有待进一步研究。
参考文献
1 Sutherland HJ, Eaves CJ, Eaves AC, et al. Characterization and partial purification of human marrow cells capable of initiating long-term hematopoiesis in vitro. Blood, 1989,74：1563-1570.
, 百拇医药
2 Lyman SD, James L, Johnson L, et al. Cloning of the human homologue of the murine flt3 ligand: a growth factor for early hematopoietic progenitor cells. Blood, 1994,83：2795-2801.
3 McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, et al. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD+34 hematopoietic progenitor cells. Blood, 1995,86：3413-3420.
4 Shah AJ, Smogozewska EM, Hannum C, et al. Flt3 ligand induces proliferation of quiescent human bone marrow CD+34 CD-38 cells and maintains progenitor cells in vitro. Blood, 1996, 87：3563-3570.
, 百拇医药
5 Scaradavou A, Isola L, Rubinstein P, et al. A murine model for human cord blood transplantation: near-term fetal and neonatal peripheral blood cells can achieve long-term bone marrow engraftment in sublethally irradiated adult recipients. Blood, 1997,89：1089-1099.
6 Stiff P, Oldenberg D, Hsi E, et al. Transplantation of ex vivo expanded cells grown in Aastrom stromal-based perfusion bioreactors from small marrow aliquots (40 ml) products durable hematopoietic reconstitution after ablative chemotherapy. Blood, 1997,90：395a.
7 Holyoake TL, Alcorn MJ, Richmond L, et al. CD34 positive PBSC expanded ex vivo may not provide durable engraftment following myeloablative chemoradiotherapy regimens. Bone Marrow Transplant, 1997, 19：1095-1101., 百拇医药