整合素在胚胎和成熟肾组织中的表达
作者：蔡毅 黄松明 费莉 姜新猷 陈荣华
单位：210029 南京，南京医科大学小儿肾脏病研究中心 第二附属医院儿科
关键词：结合素类；胚胎；肾
中华儿科杂志/980915 【摘要】 目的 观察细胞外基质的整合素受体在胚胎肾发育中表达的时空顺序，揭示其在胚胎肾发育中的作用。方法 选用针对整合素α1、α2、α3、α5、α6、αv的单克隆抗体，采用间接免疫碱性磷酸酶技术，观察其在11例胎儿肾中的表达和分布，并以正常成人肾组织为对照。结果 除α2、α6在未成熟肾小球出现一过性表达外，其余各链随着肾小球成熟表达逐渐增加，但各自分布不同。α1、αv在肾小球和间质广泛分布，α3仅出现于小球，α5在幼稚小球分布于系膜区，而成熟小球其分布以肾小球基底膜为主。成熟肾组织中α2、α6在肾间质和小管壁大量表达。结论 整合素α链在胚胎肾发育过程中存在着一定的时空顺序，推测它们各自在肾发育过程中所起作用不同。
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The expression of integrin in human fetal and adult kidney
Cai Yi, Huang Songming, Fei Li, et al. Center of Pediatric Nephrology and Pediatric Department, The Second Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective The chronological and spatial changes in expression of integrin receptors of extracellular matrix were investigated for finding out their function during nephrogenesis. Methods Eleven fetal and 1 normal adult kidney were examined by immuno-alkaline phosphatase technique, using monoclonal mouse anti-human integrin (α1，α2，α3，α5，α6，αv) antibodies. Results Except for transient expression of α2 and α6 chains in immature glomeruli, the expression of the other chains of integrin increased with the kidney maturation. Alpha 1 and αv had a diffused expression in the glomeruli and interstitium. Alpha 3 only expressed in glomeruli. Alpha 5 was positive in the mesangium in immature glomeruli but prominent in GBM of mature ones. The expression of α2 and α6 chains was diffused in interstitium and tubular basement membranes in the mature kidneys. Conclusion The α chains of integrin may have certain chronological and spatial sequence in expression in the developing kidney, which suggested that they might play a different role in the kidney maturation.
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【Key words】 【Key words】 Integrins Embryo Kidney
细胞外基质大分子受体研究是细胞生物学的一个重要内容，它们在细胞的定殖、迁移、生长和分化中起着重要作用。其中整合素作为受体的作用越来越被人们所关注。
整合素是由α和β两个亚单位通过非共价键结合形成的异二聚体蛋白质，目前至少发现15种不同的α亚单位与8种β亚单位构成的至少19种整合素[1，2]。近年来体内外研究发现，整合素通过介导细胞与细胞外基质间的粘附，参与诱导细胞的迁移、分化和细胞外基质成分的形成聚集以及基底膜的形成，如果阻断整合素在细胞与基质之间的这种粘附，将会引起组织器官的结构异常和功能障碍[3，4]。
整合素在体内的主要配体有板层蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原等，它们同是系膜基质和肾小球基底膜的重要组成成分。这些成分的异常聚集在慢性进展性肾小球疾病中起着重要作用。我们通过免疫酶的技术观察作为板层蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白受体的一些整合素结构链在胚胎和成熟肾组织中的表达，以明确其在正常肾组织中表达的时空顺序。
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材料和方法
一、标本来源及制备 一、标本来源及制备
11例胎龄在16～33周的水囊引产的胎儿肾组织取自本院妇科，1例正常成人肾组织为拟行肾移植未用肾。以上肾组织均用OCT包埋剂包埋-20℃下冰冻切片4 μm厚，自然晾干后丙酮固定。-60℃冰箱保存备检。
二、主要试剂
整合素α1、α2、α3、α5、α6、αv的单克隆抗体购自法国国际免疫技术有限公司。碱性磷酸酶标记的第二抗体购自Sigma公司，酶反应底物NBT/BCIP购自德国宝灵曼公司。
三、方法
本研究采用间接免疫碱性磷酸酶技术。简介如下：冰冻切片取出后经磷酸盐缓冲液洗，用经适当稀释的单克隆抗体37℃湿盒内孵育1小时，Bouin液处理后加碱性磷酸酶标记的第二抗体，37℃孵育1小时，再加底物溶液，显微镜下监测反应结果，适时中止反应，0.5%美兰淡染胞核后观察。
, 百拇医药
结果
一 整合素在正常成熟肾组织中的分布
α1、α3、α5、αv均可表达于肾小球，α1在系膜区、肾小囊表达，毛细血管壁仅为弱阳性，间质、小管壁亦为阳性。α3在系膜区、毛细血管壁表达，在肾小囊为阴性，小球外亦为阴性。α5在肾小球基底膜(GBM)为阳性，在系膜区、肾小球囊阴性，间质、小管基底膜有线样、片状均匀表达。αv在系膜区呈阳性、毛细血管壁强阳性表达，肾小囊也有不连续线样表达。α2、α6在小球内未见表达，仅在间质、肾小管基底膜表达。
二、整合素在胚胎肾组织中的分布
α1在S期肾单位的壁层上皮细胞外周有较强的表达，随着肾小球成熟其表达主要在系膜区和肾小囊；α3在细胞团期的外周、血管极开放肾小球的上皮细胞内外侧均有弱的表达，随着肾小球成熟表达逐步增加，主要分布于肾小球系膜区、毛细血管壁，而肾小囊及间质为阴性。α5在未成熟小球主要分布在系膜区，成熟小球则表达于GBM。αv在未成熟小球外周足细胞周围有强的表达，随着小球成熟主要分布于系膜区、毛细血管壁和肾小囊。而α2在输尿管芽外周呈强阳性表达，未成熟小球系膜区有弱的表达，成熟小球中未见其表达，仅见于小球外的间质。α6除在S期肾单位上皮细胞周围有较弱的一过性表达外，大量表达于间质和肾小管基膜(附表)。
, 百拇医药
讨论
作为一种跨膜蛋白的整合素，其一端可识别细
附表 整合素α链在肾小球不同发育期和肾组织中的分布 结构链
名称
未成熟肾小球
成熟肾小球
TBM
逗点期
S期
婴儿型小球
系膜区
GBM
, 百拇医药
肾小囊
α1
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++
++
++
+
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α2
+++
+
-
-
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-
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α3
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α5
-
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+
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α6
+
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-
-
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-
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αv
, 百拇医药
+
++
+++
+++
+++
+
+
注：-表示阴性，+表示弱阳性，++表示阳性，+++表示强阳性
胞外配体细胞外基质(ECM)并与之结合，另一端与胞浆骨架成分结合，将信号传入胞内，从而控制着细胞的功能，在细胞生长、迁移、分化和基因表达中发挥重要作用。肾小球固有细胞表面可表达多种整合素，其中整合素β1亚基家族与肾小球细胞外基质成分的关系最为密切[5]，如α1β1、α2β1是胶原蛋白(Ⅰ、Ⅳ型)和板层蛋白的受体，α3β1除了是胶原和板层蛋白的受体外，还与α5β1同是纤维连接蛋白的受体，α6β1则只为板层蛋白受体。在β3亚基家族中αvβ3是Vitonectin的受体。过去人们对ECM-整合素相互作用影响肾小球细胞行为的资料大多基于体外细胞培养，而对它们在组织中的作用研究甚少，胚胎组织不失为研究其在组织中功能的理想模型。
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我们的研究结果显示，整合素α链在胚胎肾发育过程中存在着一定的时空顺序性，提示它们在不同的发育阶段对肾组织的不同结构所起的诱导作用有所侧重。α1、α3、αv链在胚胎肾的S期肾单位的上皮细胞周围就有明显表达，随后表达于各阶段肾小球的系膜区，提示它们与各自的配体(如Ⅳ型胶原、板层蛋白等)结合对诱导肾小球上皮细胞的分化、发育，以及在肾小球系膜区的形成中起重要作用。此外，α5链也表达于未成熟小球的系膜区，而在成熟小球的系膜区未见表达，提示整合素α5链及其配体纤维连接蛋白可能对未成熟小球的系膜区形成起着一定作用，而与成熟小球系膜区形态功能的维持作用无关。在肾小球基底膜的形成过程中可见α3、αv链的表达，提示它们作为肾小球基底膜的主要受体成分在GBM的形成发育过程中起重要作用。α5仅在成熟小球出现于GBM，提示它未参与肾小球GBM早期融合形成，而其与配体的结合可能在成熟肾小球基底膜的形态、功能维持中与α3、αv一样发挥重要作用。肾小囊的发育过程中仅在其表面表达α1、αv两种成分，推测相应的整合素受体是诱导其发育成熟以及正常形态功能维持的受体成分，而β1类的其它α亚链对肾小囊的发育作用较弱。我们的研究结果还显示α2、α6链仅在未成熟小球中有一过性表达，其主要分布在肾小球间质和小管上皮细胞，这就表明，该两种整合素的受体及其重要的配体成分板层蛋白相互作用对胚胎肾发育的诱导主要在于小管和间质的发育，而对小球诱导作用较弱。此外α1、α5、αv在不同时期小管、间质中也有不同程度表达，推测它们与α2、α6成分一起参与小球外结构的发育成熟。Korhonen等[6]也有类似报道，但他们发现α3也在远端小管表达，而我们未发现小球外有α3的表达，可能这种差异来自实验方法或所用单克隆抗体的不同。
, 百拇医药
整合素通过与其配体结合对胚胎肾发育的诱导作用有学者在实验动物中已得到证实，α6β1参与诱导小鼠胚胎肾间质细胞转化为小管样结构，此时如果用单抗阻断整合素与其配体的结合则可干扰肾的发育[7]。
整合素通过与其ECM配体结合对细胞的诱导机制，有学者认为整合素能诱导多种细胞内信号途径，包括改变细胞内pH和钙的水平，酪氨酸激酶的磷酸化和诱导转录因子等[1]。因此有学者推测，在肾小球疾病时ECM可能有新的表达，其与细胞表面的整合素受体相互作用进一步影响肾小球固有细胞的表达，从而导致系膜进行性ECM积聚及肾小球硬化[8]。因此进一步研究整合素的确切细胞来源以及其在肾小球疾病中表达的异常将有助于我们更好地认识其生理功能和在肾脏疾病中的作用，为探索肾小球疾病治疗手段提供新的思路。本课题由国家博士后科研基金(基金编号:4524)和江苏省教委自然科学基金(基金编号:1996-21)资助.
, http://www.100md.com 参考文献
1 Hynes RO. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 1992,69：11-25.
2 Ruoslahti E, Noble NA, Kagami S, et al. Integrins. Kidney Int, 1994,45(Suppl 44),S17-S22.
3 Takeiehi M. The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogensis. Development, 1988,102：639-655.
4 Giancotti FG, Ruoslahti E. Elevated levels of the α5β1 fibronectin receptor supress the transformed phentype of Chinese harnster ovary cells. Cell, 1990,60：849-859.
, 百拇医药
5 Zhang DQ, Fornaro M, Bofetiado C, et al. Modulation of cell proliferation by the integrin cytoplasmic domain. Kidney Int, 1997,51：1434-1440.
6 Korhonen M, Ylanne J, Latinen L, et al. The α1～α6 subunits of integrins are characterically expressed in distinct segments of developing and adult human nephron. J Cell Biol, 1990,111：1245-1254.
7 Ekblom P. Basement membranes in development. In: Rohrbach DH, Timpl R, eds. Molecular and cellular aspects of basement membranes. San Diego, CA: Acad Press. 1993.359-383.
8 Petermann A, Fees H, Grenz H, et al. Polymerase chain reaction and focal contact formation indicate integrin expression in mesangial cells. Kidney Int, 1993,44：997-1005.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-06-22), 百拇医药
单位：210029 南京，南京医科大学小儿肾脏病研究中心 第二附属医院儿科
关键词：结合素类；胚胎；肾
中华儿科杂志/980915 【摘要】 目的 观察细胞外基质的整合素受体在胚胎肾发育中表达的时空顺序，揭示其在胚胎肾发育中的作用。方法 选用针对整合素α1、α2、α3、α5、α6、αv的单克隆抗体，采用间接免疫碱性磷酸酶技术，观察其在11例胎儿肾中的表达和分布，并以正常成人肾组织为对照。结果 除α2、α6在未成熟肾小球出现一过性表达外，其余各链随着肾小球成熟表达逐渐增加，但各自分布不同。α1、αv在肾小球和间质广泛分布，α3仅出现于小球，α5在幼稚小球分布于系膜区，而成熟小球其分布以肾小球基底膜为主。成熟肾组织中α2、α6在肾间质和小管壁大量表达。结论 整合素α链在胚胎肾发育过程中存在着一定的时空顺序，推测它们各自在肾发育过程中所起作用不同。
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The expression of integrin in human fetal and adult kidney
Cai Yi, Huang Songming, Fei Li, et al. Center of Pediatric Nephrology and Pediatric Department, The Second Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective The chronological and spatial changes in expression of integrin receptors of extracellular matrix were investigated for finding out their function during nephrogenesis. Methods Eleven fetal and 1 normal adult kidney were examined by immuno-alkaline phosphatase technique, using monoclonal mouse anti-human integrin (α1，α2，α3，α5，α6，αv) antibodies. Results Except for transient expression of α2 and α6 chains in immature glomeruli, the expression of the other chains of integrin increased with the kidney maturation. Alpha 1 and αv had a diffused expression in the glomeruli and interstitium. Alpha 3 only expressed in glomeruli. Alpha 5 was positive in the mesangium in immature glomeruli but prominent in GBM of mature ones. The expression of α2 and α6 chains was diffused in interstitium and tubular basement membranes in the mature kidneys. Conclusion The α chains of integrin may have certain chronological and spatial sequence in expression in the developing kidney, which suggested that they might play a different role in the kidney maturation.
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【Key words】 【Key words】 Integrins Embryo Kidney
细胞外基质大分子受体研究是细胞生物学的一个重要内容，它们在细胞的定殖、迁移、生长和分化中起着重要作用。其中整合素作为受体的作用越来越被人们所关注。
整合素是由α和β两个亚单位通过非共价键结合形成的异二聚体蛋白质，目前至少发现15种不同的α亚单位与8种β亚单位构成的至少19种整合素[1，2]。近年来体内外研究发现，整合素通过介导细胞与细胞外基质间的粘附，参与诱导细胞的迁移、分化和细胞外基质成分的形成聚集以及基底膜的形成，如果阻断整合素在细胞与基质之间的这种粘附，将会引起组织器官的结构异常和功能障碍[3，4]。
整合素在体内的主要配体有板层蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原等，它们同是系膜基质和肾小球基底膜的重要组成成分。这些成分的异常聚集在慢性进展性肾小球疾病中起着重要作用。我们通过免疫酶的技术观察作为板层蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白受体的一些整合素结构链在胚胎和成熟肾组织中的表达，以明确其在正常肾组织中表达的时空顺序。
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材料和方法
一、标本来源及制备 一、标本来源及制备
11例胎龄在16～33周的水囊引产的胎儿肾组织取自本院妇科，1例正常成人肾组织为拟行肾移植未用肾。以上肾组织均用OCT包埋剂包埋-20℃下冰冻切片4 μm厚，自然晾干后丙酮固定。-60℃冰箱保存备检。
二、主要试剂
整合素α1、α2、α3、α5、α6、αv的单克隆抗体购自法国国际免疫技术有限公司。碱性磷酸酶标记的第二抗体购自Sigma公司，酶反应底物NBT/BCIP购自德国宝灵曼公司。
三、方法
本研究采用间接免疫碱性磷酸酶技术。简介如下：冰冻切片取出后经磷酸盐缓冲液洗，用经适当稀释的单克隆抗体37℃湿盒内孵育1小时，Bouin液处理后加碱性磷酸酶标记的第二抗体，37℃孵育1小时，再加底物溶液，显微镜下监测反应结果，适时中止反应，0.5%美兰淡染胞核后观察。
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结果
一 整合素在正常成熟肾组织中的分布
α1、α3、α5、αv均可表达于肾小球，α1在系膜区、肾小囊表达，毛细血管壁仅为弱阳性，间质、小管壁亦为阳性。α3在系膜区、毛细血管壁表达，在肾小囊为阴性，小球外亦为阴性。α5在肾小球基底膜(GBM)为阳性，在系膜区、肾小球囊阴性，间质、小管基底膜有线样、片状均匀表达。αv在系膜区呈阳性、毛细血管壁强阳性表达，肾小囊也有不连续线样表达。α2、α6在小球内未见表达，仅在间质、肾小管基底膜表达。
二、整合素在胚胎肾组织中的分布
α1在S期肾单位的壁层上皮细胞外周有较强的表达，随着肾小球成熟其表达主要在系膜区和肾小囊；α3在细胞团期的外周、血管极开放肾小球的上皮细胞内外侧均有弱的表达，随着肾小球成熟表达逐步增加，主要分布于肾小球系膜区、毛细血管壁，而肾小囊及间质为阴性。α5在未成熟小球主要分布在系膜区，成熟小球则表达于GBM。αv在未成熟小球外周足细胞周围有强的表达，随着小球成熟主要分布于系膜区、毛细血管壁和肾小囊。而α2在输尿管芽外周呈强阳性表达，未成熟小球系膜区有弱的表达，成熟小球中未见其表达，仅见于小球外的间质。α6除在S期肾单位上皮细胞周围有较弱的一过性表达外，大量表达于间质和肾小管基膜(附表)。
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讨论
作为一种跨膜蛋白的整合素，其一端可识别细
附表 整合素α链在肾小球不同发育期和肾组织中的分布 结构链
名称
未成熟肾小球
成熟肾小球
TBM
逗点期
S期
婴儿型小球
系膜区
GBM
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注：-表示阴性，+表示弱阳性，++表示阳性，+++表示强阳性
胞外配体细胞外基质(ECM)并与之结合，另一端与胞浆骨架成分结合，将信号传入胞内，从而控制着细胞的功能，在细胞生长、迁移、分化和基因表达中发挥重要作用。肾小球固有细胞表面可表达多种整合素，其中整合素β1亚基家族与肾小球细胞外基质成分的关系最为密切[5]，如α1β1、α2β1是胶原蛋白(Ⅰ、Ⅳ型)和板层蛋白的受体，α3β1除了是胶原和板层蛋白的受体外，还与α5β1同是纤维连接蛋白的受体，α6β1则只为板层蛋白受体。在β3亚基家族中αvβ3是Vitonectin的受体。过去人们对ECM-整合素相互作用影响肾小球细胞行为的资料大多基于体外细胞培养，而对它们在组织中的作用研究甚少，胚胎组织不失为研究其在组织中功能的理想模型。
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我们的研究结果显示，整合素α链在胚胎肾发育过程中存在着一定的时空顺序性，提示它们在不同的发育阶段对肾组织的不同结构所起的诱导作用有所侧重。α1、α3、αv链在胚胎肾的S期肾单位的上皮细胞周围就有明显表达，随后表达于各阶段肾小球的系膜区，提示它们与各自的配体(如Ⅳ型胶原、板层蛋白等)结合对诱导肾小球上皮细胞的分化、发育，以及在肾小球系膜区的形成中起重要作用。此外，α5链也表达于未成熟小球的系膜区，而在成熟小球的系膜区未见表达，提示整合素α5链及其配体纤维连接蛋白可能对未成熟小球的系膜区形成起着一定作用，而与成熟小球系膜区形态功能的维持作用无关。在肾小球基底膜的形成过程中可见α3、αv链的表达，提示它们作为肾小球基底膜的主要受体成分在GBM的形成发育过程中起重要作用。α5仅在成熟小球出现于GBM，提示它未参与肾小球GBM早期融合形成，而其与配体的结合可能在成熟肾小球基底膜的形态、功能维持中与α3、αv一样发挥重要作用。肾小囊的发育过程中仅在其表面表达α1、αv两种成分，推测相应的整合素受体是诱导其发育成熟以及正常形态功能维持的受体成分，而β1类的其它α亚链对肾小囊的发育作用较弱。我们的研究结果还显示α2、α6链仅在未成熟小球中有一过性表达，其主要分布在肾小球间质和小管上皮细胞，这就表明，该两种整合素的受体及其重要的配体成分板层蛋白相互作用对胚胎肾发育的诱导主要在于小管和间质的发育，而对小球诱导作用较弱。此外α1、α5、αv在不同时期小管、间质中也有不同程度表达，推测它们与α2、α6成分一起参与小球外结构的发育成熟。Korhonen等[6]也有类似报道，但他们发现α3也在远端小管表达，而我们未发现小球外有α3的表达，可能这种差异来自实验方法或所用单克隆抗体的不同。
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整合素通过与其配体结合对胚胎肾发育的诱导作用有学者在实验动物中已得到证实，α6β1参与诱导小鼠胚胎肾间质细胞转化为小管样结构，此时如果用单抗阻断整合素与其配体的结合则可干扰肾的发育[7]。
整合素通过与其ECM配体结合对细胞的诱导机制，有学者认为整合素能诱导多种细胞内信号途径，包括改变细胞内pH和钙的水平，酪氨酸激酶的磷酸化和诱导转录因子等[1]。因此有学者推测，在肾小球疾病时ECM可能有新的表达，其与细胞表面的整合素受体相互作用进一步影响肾小球固有细胞的表达，从而导致系膜进行性ECM积聚及肾小球硬化[8]。因此进一步研究整合素的确切细胞来源以及其在肾小球疾病中表达的异常将有助于我们更好地认识其生理功能和在肾脏疾病中的作用，为探索肾小球疾病治疗手段提供新的思路。本课题由国家博士后科研基金(基金编号:4524)和江苏省教委自然科学基金(基金编号:1996-21)资助.
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1 Hynes RO. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 1992,69：11-25.
2 Ruoslahti E, Noble NA, Kagami S, et al. Integrins. Kidney Int, 1994,45(Suppl 44),S17-S22.
3 Takeiehi M. The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogensis. Development, 1988,102：639-655.
4 Giancotti FG, Ruoslahti E. Elevated levels of the α5β1 fibronectin receptor supress the transformed phentype of Chinese harnster ovary cells. Cell, 1990,60：849-859.
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5 Zhang DQ, Fornaro M, Bofetiado C, et al. Modulation of cell proliferation by the integrin cytoplasmic domain. Kidney Int, 1997,51：1434-1440.
6 Korhonen M, Ylanne J, Latinen L, et al. The α1～α6 subunits of integrins are characterically expressed in distinct segments of developing and adult human nephron. J Cell Biol, 1990,111：1245-1254.
7 Ekblom P. Basement membranes in development. In: Rohrbach DH, Timpl R, eds. Molecular and cellular aspects of basement membranes. San Diego, CA: Acad Press. 1993.359-383.
8 Petermann A, Fees H, Grenz H, et al. Polymerase chain reaction and focal contact formation indicate integrin expression in mesangial cells. Kidney Int, 1993,44：997-1005.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-06-22), 百拇医药