Fas基因在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用
作者：徐令 廖清奎 罗春华 符仁义 郭文俊
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院(徐令现在510089 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院)
关键词：三尖杉酯碱；白血病；早幼粒细胞；急性；脱噬作用；HL-60细胞
中华儿科杂志981010 【摘要】 目的 探讨高三尖杉酯碱诱导HL-60白血病细胞凋亡的机制。方法 应用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、免疫组织化学技术、Northern印迹杂交进行检测分析。结果 HL-60白血病细胞在高三尖杉酯碱的作用下，出现典型的凋亡特征，细胞形态学表现出细胞核裂解、染色质聚集、核碎裂，胞浆浓缩、有空泡形成，琼脂糖电泳出现典型的DNA梯带。免疫组织化学技术发现促凋亡蛋白Fas在用药后明显增高，Fas配体无明显变化，Northern印迹杂交分析发现Fas mRNA在用药后表达无明显改变，Fas蛋白与Fas mRNA无相关性。结论 高三尖杉酯碱诱导凋亡的机理之一是增加促凋亡蛋白Fas水平，Fas蛋白增高的原因可能是高三尖杉酯碱促进Fas mRNA转录为Fas蛋白，而不是增加Fas mRNA的表达。
, 百拇医药
Effect of Fas on homoharringtonine-induced apoptosis in HL-60 cell line Xu Ling, Liao Qingkui, Luo Chunhua, et al. 2nd University Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism by which homoharringtonine induced apoptosis in HL-60 leukemia cells. Methods Cell morphology, DNA agarose gel electrophoresis, immunohistochemistry and Northern blot were performed. Results HL-60 leukemia cells treated with homoharringtonine underwent apoptosis. Apoptosis cells demonstrated compaction and segregation of the nuclear chromatin, condensation and vacuolus of the cytoplasm. Nuclear DNA of apoptosis cells displayed ladder bands characteristic of internucleosomal DNA fragmentation. Protein expression of Fas, inducer of apoptosis, was increased, while that of FasL did not change. mRNA expression of Fas, examined by Northern blot, did not change. Conclusion The mechanism by which homoharringtonine induces apoptosis in HL-60 cells involves increasing Fas protein expression. The cause of altered expression of Fas protein is probably that homoharringtonine promotes Fas mRNA translation but not Fas mRNA level.
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【Key words】 Harringtonine Leukemia, promyclocytic, acute Apoptosis HL-60 cells
高三尖杉酯碱(HHT)是一种临床治疗白血病的常用药，对白血病治疗有确切的疗效。以前研究认为其抗白血病机制可能是抑制G1和G2期的蛋白合成[1]，也有人报道是通过诱导分化起作用[2]。近年来有人报道HHT和三尖杉酯碱(HT) 可诱导白血病细胞凋亡[3]，但对其机理未进行探讨。虽然对抗白血病药物的诱导凋亡进行了大量的研究，但目前研究主要局限于某药引起某细胞株凋亡，而对于刺激与效应之间的联系机制研究较少。我们通过HHT诱导HL-60白血病细胞株凋亡，并对其凋亡过程中凋亡相关基因Fas和Fas配体进行研究，探讨Fas基因在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用。
材料及方法
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一、HL-60白血病细胞株的培养及处理
培养液为含有15%小牛血清及青、链霉素(100 U/ml) 的RPMI-1640液，在37℃，饱和湿度和5%CO2孵箱中培养，每3～4天换液传代。取对数生长期浓度为5×105个细胞/ml的培养液150 ml，分为5组。对照组不加药；用药组按1 μg/ml加入HHT，用药后继续在CO2孵箱内培养，用药2、4、8、24小时组分别于用药后2、4、8、24小时时收取细胞。
二、用药前后HL-60白血病细胞株形态学观察
取对照组和用药各组的培养液2 ml，800 g(g为重力常数)离心沉淀，磷酸缓冲液(PBS)洗2次，行细胞涂片，晾干后用瑞氏染色，光镜下观察形态学改变。
三、DNA提取及电泳
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取对照组和用药各组的培养液10 ml，800 g离心沉淀细胞，加入细胞裂解液0.5 ml， 0.1%RNA酶5 U，在37℃水浴中孵育30分钟，然后加入蛋白酶K 1 mg/ml，37℃孵育30分钟，在1.5%琼脂糖凝胶中5 V/cm电泳2小时，溴乙啶染色后在紫外灯下观察结果。
四、免疫组织化学染色
取对照组和用药各组的培养液3 ml， 离心后涂片，待干燥后，冷丙酮固定，采用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法进行免疫组织化学染色。
五、质粒扩增，DNA片段回收及探针标记
通过细菌转化，碱裂解法提取质粒DNA，以相应的限制性内切酶酶切，透析袋法回收所需片段，作为杂交探针。用同位素标记探针，标记程序按随机引物标记系统(random-primer labelling system)说明进行[4]。
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六、HL-60白血病细胞总RNA提取
取对照组和用药各组的培养液15 ml， 离心沉淀后室温下加入溶液D(SD)1 ml，2 mol/L醋酸钠0.1 ml，水饱和酚1 ml，氯仿/异戊醇(49∶1)0.2 ml，彻底混匀后冰浴15 min，10 000 g，4℃离心20分钟，转移水相并加入与SD液等体积的异丙醇，-20℃放置至少1小时，10 000 g，离心20分钟沉淀RNA，以原体积1/3的SD液复溶，加入等体积异丙醇于-20℃放置至少1小时，同样条件离心，75%乙醇漂洗2次，真空干燥，以无RNA酶的水溶解RNA，储于-70℃。
七、Northern印迹杂交
参照文献[4]进行。
结果
一、HHT诱导HL-60白血病细胞凋亡模型的建立
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1.HHT诱导HL-60白血病细胞凋亡的形态学改变：(1)对照组为典型早幼粒白血病细胞形态，细胞完整，呈圆形细胞，核大， 占据细胞绝大部分，胞核呈圆形或椭园形，染色质细，分布均匀，胞浆少，呈兰色，胞浆内无明显的颗粒。(2)用药组HHT处理2小时时的细胞变化不明显；4小时时出现典型凋亡细胞形态学改变。可见细胞完整， 部分细胞体积缩小，核染色质聚集成团；细胞浆浓缩，导致细胞外形和核外形皱缩；少数细胞可见核碎裂；胞浆内有大量的空泡出现。
2.HHT诱导HL-60白血病细胞的DNA降解：不同用药时间HL-60白血病细胞DNA 琼脂糖电泳结果显示，对照组及HHT处理2小时组均无DNA梯带，HHT处理4小时组开始出现DNA梯带，HHT处理8小时及24小时组，仍可见到DNA梯带。
经1 μg/ml的HHT诱导HL-60白血病细胞4小时出现典型的形态学改变及DNA降解，出现特征性DNA梯带，可以说明本研究的凋亡模型已建立。
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二、免疫组化改变
1.Fas蛋白：在HL-60细胞对照组无明显的Fas表达，细胞膜未见着色。经HHT诱导2小时，部分细胞膜出现Fas蛋白表达，细胞膜可见棕黑色着色；HHT诱导4小时，Fas蛋白表达达高峰(附表)。
附表 Fas蛋白在HL-60白血病细胞对照组及
用药各组的表达情况 组别
染色强度
细胞百分比(%)
染色系数
对照组
-
100
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0
用药2小时组
+++
40
1.2
4小时组
++++
100
4.0
8小时组
+++
40
1.2
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24小时组
++++
90
3.6
注：染色系数=染色强度(-～++++记为0～4分)×染色细胞百分比 2.Fas配体：Fas配体在HL-60白血病细胞对照组及用药各组无表达，细胞未见着色。
三、Fas mRNA表达情况
Fas，β-actin Northern杂交后吸光度A(曾称光密度OD)值及二者比值：FasA值/β-actinA值在对照组为0.78，用药2、4和8小时分别为0.97、1.02和0.73，各组的比值差异不明显。用Fas的染色系数代表Fas蛋白水平，Northern印迹杂交FasA值/β-actinA值代表Fas mRNA水平，用SPSS/PC+统计分析软件进行相关回归分析，Fas蛋白与mRNA的相关系数(R)为0.7709，概率(P)为0.115(>0.05)，差异无显著性，表明Fas蛋白与mRNA无明显相关。
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讨论
HHT为一种治疗粒系白血病的药物，疗效较确切，但目前对其抗白血病的机理研究较少。Baaske等1977年报道HHT抗白血病机理是抑制蛋白合成，主要是作用于G1和G2期，Boyd于1981年报道HHT可以诱导幼稚细胞向不同方向分化，从而起到抗白血病的作用。近年来发现许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞凋亡。用流氏细胞仪及DNA分析对HHT的研究证实，HHT可诱导白血病细胞凋亡，因此认为诱导白血病细胞凋亡可能是HHT抗白血病机理之一。但对其凋亡机理未进行探导。我们的研究发现1 μg/ml的HHT用药4小时后，出现典型的凋亡形态学改变，核染色质聚集，核碎裂，细胞外形及核外形皱缩，胞浆浓缩，有空泡形成。并出现DNA降解，形成特征性DNA梯带。因此，我们的结论与从前研究结果相同，即HHT可通过诱导白血病细胞凋亡起到抗白血病的作用。
Fas为325个氨基酸组成的Ⅰ型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族。B细胞型白血病患儿中有15.6%的Fas表达，在毛细胞白血病中有44.5%的Fas蛋白表达。抗Fas抗体，细胞膜表面的Fas配体或纯化可溶性Fas配体，均可结合细胞表面的Fas蛋白，向细胞传导死亡信号，细胞在数小时内发生凋亡[5，6]。Fas配体为Ⅱ型膜蛋白，也属于TNF家族[7]，它对有Fas表达的细胞有强细胞毒活性。在HL-60白血病细胞系中，Fas及Fas配体的表达情况均未见报道。在我们的实验中，HL-60白血病细胞株并不表达Fas和Fas配体。对照组均无棕黑色着色。在HHT诱导凋亡的过程中，HL-60细胞出现了Fas蛋白的表达(2小时开始表达，4小时达高峰)，因此可以认为诱导Fas蛋白的表达是HHT诱导凋亡的机理之一。我们进一步采用Northern杂交方法测定HL-60白血病细胞株用药前后Fas mRNA，发现对照组、用药2小时组、4小时组及8小时组Fas mRNA无明显差异，因此，我们认为HHT增加蛋白的表达不是因为增高Fas mRNA的转录，而是在以下水平。HHT可能作用于Fas mRNA合成蛋白的某个环节，使Fas蛋白合成增加。但HHT是作用于Fas蛋白合成的哪个环节，还有待于进一步的研究。在我们的实验中，Fas配体在对照组及用药各组细胞中均未见表达，Fas蛋白是如何被激活，是否与抗Fas抗体或可溶性Fas配体结合，均不清楚，尚需进一步研究。
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参考文献
1 Baaske DM, Heinstein P. Cytotoxicity and cell cycle specificity of homoharringtonine. Antimicrob Agents Chemother, 1977, 12:298-300.
2 Boyd AW, Sullivan JR. Leukemic cell differentiation in vivo and in vitro: arrest of proliferation parallels the differentiation induced by the antileukemic drug harringtonine. Blood, 1984, 63:384-392.
3 Visani G， Russo O， Ottaviani E, et al. Effect of homoharringtonine alone and in combination with alpha interferon and cytosine arabinoside on in vitro′ growth and induction of apoptosis in chronic myeloid leukemia and normal hematopoietic progenitors. Leukemia, 1997, 11:624-628.
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4 萨姆布鲁克 J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，等.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社，1992.16-32，362-371.
5 Nagata S. Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995,267:1449-1456.
6 Delehanty LL, Payne JA， Farrow SN, et al. Apoptosis in a Fas resistant，T-cell receptor-sensitive human leukemic T-cell clone. Immunology, 1997, 90:383-387.
7 Nagata S, Suda T. Fas and Fas ligand: 1pr and gld mutations. Immunol Today, 1995, 16:39-43.
(收稿：1997-10-05 修回：1998-03-30), 百拇医药
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院(徐令现在510089 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院)
关键词：三尖杉酯碱；白血病；早幼粒细胞；急性；脱噬作用；HL-60细胞
中华儿科杂志981010 【摘要】 目的 探讨高三尖杉酯碱诱导HL-60白血病细胞凋亡的机制。方法 应用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、免疫组织化学技术、Northern印迹杂交进行检测分析。结果 HL-60白血病细胞在高三尖杉酯碱的作用下，出现典型的凋亡特征，细胞形态学表现出细胞核裂解、染色质聚集、核碎裂，胞浆浓缩、有空泡形成，琼脂糖电泳出现典型的DNA梯带。免疫组织化学技术发现促凋亡蛋白Fas在用药后明显增高，Fas配体无明显变化，Northern印迹杂交分析发现Fas mRNA在用药后表达无明显改变，Fas蛋白与Fas mRNA无相关性。结论 高三尖杉酯碱诱导凋亡的机理之一是增加促凋亡蛋白Fas水平，Fas蛋白增高的原因可能是高三尖杉酯碱促进Fas mRNA转录为Fas蛋白，而不是增加Fas mRNA的表达。
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Effect of Fas on homoharringtonine-induced apoptosis in HL-60 cell line Xu Ling, Liao Qingkui, Luo Chunhua, et al. 2nd University Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism by which homoharringtonine induced apoptosis in HL-60 leukemia cells. Methods Cell morphology, DNA agarose gel electrophoresis, immunohistochemistry and Northern blot were performed. Results HL-60 leukemia cells treated with homoharringtonine underwent apoptosis. Apoptosis cells demonstrated compaction and segregation of the nuclear chromatin, condensation and vacuolus of the cytoplasm. Nuclear DNA of apoptosis cells displayed ladder bands characteristic of internucleosomal DNA fragmentation. Protein expression of Fas, inducer of apoptosis, was increased, while that of FasL did not change. mRNA expression of Fas, examined by Northern blot, did not change. Conclusion The mechanism by which homoharringtonine induces apoptosis in HL-60 cells involves increasing Fas protein expression. The cause of altered expression of Fas protein is probably that homoharringtonine promotes Fas mRNA translation but not Fas mRNA level.
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【Key words】 Harringtonine Leukemia, promyclocytic, acute Apoptosis HL-60 cells
高三尖杉酯碱(HHT)是一种临床治疗白血病的常用药，对白血病治疗有确切的疗效。以前研究认为其抗白血病机制可能是抑制G1和G2期的蛋白合成[1]，也有人报道是通过诱导分化起作用[2]。近年来有人报道HHT和三尖杉酯碱(HT) 可诱导白血病细胞凋亡[3]，但对其机理未进行探讨。虽然对抗白血病药物的诱导凋亡进行了大量的研究，但目前研究主要局限于某药引起某细胞株凋亡，而对于刺激与效应之间的联系机制研究较少。我们通过HHT诱导HL-60白血病细胞株凋亡，并对其凋亡过程中凋亡相关基因Fas和Fas配体进行研究，探讨Fas基因在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用。
材料及方法
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一、HL-60白血病细胞株的培养及处理
培养液为含有15%小牛血清及青、链霉素(100 U/ml) 的RPMI-1640液，在37℃，饱和湿度和5%CO2孵箱中培养，每3～4天换液传代。取对数生长期浓度为5×105个细胞/ml的培养液150 ml，分为5组。对照组不加药；用药组按1 μg/ml加入HHT，用药后继续在CO2孵箱内培养，用药2、4、8、24小时组分别于用药后2、4、8、24小时时收取细胞。
二、用药前后HL-60白血病细胞株形态学观察
取对照组和用药各组的培养液2 ml，800 g(g为重力常数)离心沉淀，磷酸缓冲液(PBS)洗2次，行细胞涂片，晾干后用瑞氏染色，光镜下观察形态学改变。
三、DNA提取及电泳
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取对照组和用药各组的培养液10 ml，800 g离心沉淀细胞，加入细胞裂解液0.5 ml， 0.1%RNA酶5 U，在37℃水浴中孵育30分钟，然后加入蛋白酶K 1 mg/ml，37℃孵育30分钟，在1.5%琼脂糖凝胶中5 V/cm电泳2小时，溴乙啶染色后在紫外灯下观察结果。
四、免疫组织化学染色
取对照组和用药各组的培养液3 ml， 离心后涂片，待干燥后，冷丙酮固定，采用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法进行免疫组织化学染色。
五、质粒扩增，DNA片段回收及探针标记
通过细菌转化，碱裂解法提取质粒DNA，以相应的限制性内切酶酶切，透析袋法回收所需片段，作为杂交探针。用同位素标记探针，标记程序按随机引物标记系统(random-primer labelling system)说明进行[4]。
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六、HL-60白血病细胞总RNA提取
取对照组和用药各组的培养液15 ml， 离心沉淀后室温下加入溶液D(SD)1 ml，2 mol/L醋酸钠0.1 ml，水饱和酚1 ml，氯仿/异戊醇(49∶1)0.2 ml，彻底混匀后冰浴15 min，10 000 g，4℃离心20分钟，转移水相并加入与SD液等体积的异丙醇，-20℃放置至少1小时，10 000 g，离心20分钟沉淀RNA，以原体积1/3的SD液复溶，加入等体积异丙醇于-20℃放置至少1小时，同样条件离心，75%乙醇漂洗2次，真空干燥，以无RNA酶的水溶解RNA，储于-70℃。
七、Northern印迹杂交
参照文献[4]进行。
结果
一、HHT诱导HL-60白血病细胞凋亡模型的建立
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1.HHT诱导HL-60白血病细胞凋亡的形态学改变：(1)对照组为典型早幼粒白血病细胞形态，细胞完整，呈圆形细胞，核大， 占据细胞绝大部分，胞核呈圆形或椭园形，染色质细，分布均匀，胞浆少，呈兰色，胞浆内无明显的颗粒。(2)用药组HHT处理2小时时的细胞变化不明显；4小时时出现典型凋亡细胞形态学改变。可见细胞完整， 部分细胞体积缩小，核染色质聚集成团；细胞浆浓缩，导致细胞外形和核外形皱缩；少数细胞可见核碎裂；胞浆内有大量的空泡出现。
2.HHT诱导HL-60白血病细胞的DNA降解：不同用药时间HL-60白血病细胞DNA 琼脂糖电泳结果显示，对照组及HHT处理2小时组均无DNA梯带，HHT处理4小时组开始出现DNA梯带，HHT处理8小时及24小时组，仍可见到DNA梯带。
经1 μg/ml的HHT诱导HL-60白血病细胞4小时出现典型的形态学改变及DNA降解，出现特征性DNA梯带，可以说明本研究的凋亡模型已建立。
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二、免疫组化改变
1.Fas蛋白：在HL-60细胞对照组无明显的Fas表达，细胞膜未见着色。经HHT诱导2小时，部分细胞膜出现Fas蛋白表达，细胞膜可见棕黑色着色；HHT诱导4小时，Fas蛋白表达达高峰(附表)。
附表 Fas蛋白在HL-60白血病细胞对照组及
用药各组的表达情况 组别
染色强度
细胞百分比(%)
染色系数
对照组
-
100
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0
用药2小时组
+++
40
1.2
4小时组
++++
100
4.0
8小时组
+++
40
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24小时组
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90
3.6
注：染色系数=染色强度(-～++++记为0～4分)×染色细胞百分比 2.Fas配体：Fas配体在HL-60白血病细胞对照组及用药各组无表达，细胞未见着色。
三、Fas mRNA表达情况
Fas，β-actin Northern杂交后吸光度A(曾称光密度OD)值及二者比值：FasA值/β-actinA值在对照组为0.78，用药2、4和8小时分别为0.97、1.02和0.73，各组的比值差异不明显。用Fas的染色系数代表Fas蛋白水平，Northern印迹杂交FasA值/β-actinA值代表Fas mRNA水平，用SPSS/PC+统计分析软件进行相关回归分析，Fas蛋白与mRNA的相关系数(R)为0.7709，概率(P)为0.115(>0.05)，差异无显著性，表明Fas蛋白与mRNA无明显相关。
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HHT为一种治疗粒系白血病的药物，疗效较确切，但目前对其抗白血病的机理研究较少。Baaske等1977年报道HHT抗白血病机理是抑制蛋白合成，主要是作用于G1和G2期，Boyd于1981年报道HHT可以诱导幼稚细胞向不同方向分化，从而起到抗白血病的作用。近年来发现许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞凋亡。用流氏细胞仪及DNA分析对HHT的研究证实，HHT可诱导白血病细胞凋亡，因此认为诱导白血病细胞凋亡可能是HHT抗白血病机理之一。但对其凋亡机理未进行探导。我们的研究发现1 μg/ml的HHT用药4小时后，出现典型的凋亡形态学改变，核染色质聚集，核碎裂，细胞外形及核外形皱缩，胞浆浓缩，有空泡形成。并出现DNA降解，形成特征性DNA梯带。因此，我们的结论与从前研究结果相同，即HHT可通过诱导白血病细胞凋亡起到抗白血病的作用。
Fas为325个氨基酸组成的Ⅰ型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族。B细胞型白血病患儿中有15.6%的Fas表达，在毛细胞白血病中有44.5%的Fas蛋白表达。抗Fas抗体，细胞膜表面的Fas配体或纯化可溶性Fas配体，均可结合细胞表面的Fas蛋白，向细胞传导死亡信号，细胞在数小时内发生凋亡[5，6]。Fas配体为Ⅱ型膜蛋白，也属于TNF家族[7]，它对有Fas表达的细胞有强细胞毒活性。在HL-60白血病细胞系中，Fas及Fas配体的表达情况均未见报道。在我们的实验中，HL-60白血病细胞株并不表达Fas和Fas配体。对照组均无棕黑色着色。在HHT诱导凋亡的过程中，HL-60细胞出现了Fas蛋白的表达(2小时开始表达，4小时达高峰)，因此可以认为诱导Fas蛋白的表达是HHT诱导凋亡的机理之一。我们进一步采用Northern杂交方法测定HL-60白血病细胞株用药前后Fas mRNA，发现对照组、用药2小时组、4小时组及8小时组Fas mRNA无明显差异，因此，我们认为HHT增加蛋白的表达不是因为增高Fas mRNA的转录，而是在以下水平。HHT可能作用于Fas mRNA合成蛋白的某个环节，使Fas蛋白合成增加。但HHT是作用于Fas蛋白合成的哪个环节，还有待于进一步的研究。在我们的实验中，Fas配体在对照组及用药各组细胞中均未见表达，Fas蛋白是如何被激活，是否与抗Fas抗体或可溶性Fas配体结合，均不清楚，尚需进一步研究。
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参考文献
1 Baaske DM, Heinstein P. Cytotoxicity and cell cycle specificity of homoharringtonine. Antimicrob Agents Chemother, 1977, 12:298-300.
2 Boyd AW, Sullivan JR. Leukemic cell differentiation in vivo and in vitro: arrest of proliferation parallels the differentiation induced by the antileukemic drug harringtonine. Blood, 1984, 63:384-392.
3 Visani G， Russo O， Ottaviani E, et al. Effect of homoharringtonine alone and in combination with alpha interferon and cytosine arabinoside on in vitro′ growth and induction of apoptosis in chronic myeloid leukemia and normal hematopoietic progenitors. Leukemia, 1997, 11:624-628.
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4 萨姆布鲁克 J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，等.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社，1992.16-32，362-371.
5 Nagata S. Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995,267:1449-1456.
6 Delehanty LL, Payne JA， Farrow SN, et al. Apoptosis in a Fas resistant，T-cell receptor-sensitive human leukemic T-cell clone. Immunology, 1997, 90:383-387.
7 Nagata S, Suda T. Fas and Fas ligand: 1pr and gld mutations. Immunol Today, 1995, 16:39-43.
(收稿：1997-10-05 修回：1998-03-30), 百拇医药