红细胞糖原的微量酶法测定及其初步临床应用
作者：陶德定 舒丹 魏虹 何善述 王慕逖
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科代谢研究室(陶德定、舒丹、魏虹、王慕逖)；同济医科大学生化教研室(何善述)
关键词：
中华儿科杂志990219
糖原累积病(glycogen storage disease, GSD)是一组与糖原合成和分解代谢有关的某些特定酶的缺失或活力低下，导致糖原在不同组织异常储积而造成的疾病。微量酶法测定红细胞糖原含量，可以代替肝糖原测定，作为GSD患儿的诊断手段，现报告如下。
主要试剂及仪器：(1)淀粉葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、糖原，均为Sigma产品。临用前按文献[1]配制成工作液。(2)酶反应缓冲液，按文献配制。(3)仪器：日立3400型紫外分光光度计。
, http://www.100md.com
检测对象：(1)正常样本：采自体检儿童，临床均已排除了糖原累积病及其他内分泌疾病。其中男性儿童36例，女性儿童24例，年龄范围为1个月～16岁，将其分为小于1岁、1～12岁和大于12岁三组，分别有16、29和15例。(2)被临床诊断为GSD及疑诊为GSD儿童的血样本，共7例。
检测方法：(1)标本处理：采集空腹晨静脉血1 ml，肝素抗凝，尽快低温离心分离出红细胞，按文献方法测定血红蛋白含量[2]。同时，取200 μl红细胞，提取糖原[1]，低温保存备用。糖原标准用同样方法沉淀。(2)糖原测定：采用James Farquharson等建立的酶学方法，对葡萄糖进行定量，并根据标准曲线确定红细胞糖原的含量。(3)标准曲线的制作：糖原标准曲线范围以0～10 μg为宜，在此范围内糖原含量与光密度之间呈线性关系，符合比尔定律。糖原量超过该范围的样本应进行适当稀释后再次测定。每次批量分析均须制作标准曲线。
结果：(1)准确性：以回收试验检验方法的准确性。在同一红细胞样本中分别添加不同量的标准糖原进行回收，平均回收率为92.4%，标准差(s)7.38%。(2)重复性：对一样本糖原重复测定5次，变异系数为8.26%。(3)正常儿童红细胞糖原测定结果：本法测定了60例不同年龄阶段正常儿童的红细胞糖原含量，结果以红细胞每克血红蛋白所含糖原量表示(μg/g)。测定值范围从难以检测(0 μg/g)到92.0 μg/g，几何平均值=21.1，95%正常范围为0～111.8 μg/g(lgG±1.96slgx)。经Wilcoxon检验，无年龄差异，也无性别差异。以红细胞糖原含量升高为不正常，95%单侧上界为97.6 μg/g(lgG+1.645slgx)。
, 百拇医药
临床应用：自1994年10月起，有针对性地对已被临床确诊的GSD患儿5例和临床怀疑为GSD的患儿2例的红细胞糖原进行了测定，其中两例患儿进行了肝活检。称取一定量新鲜湿组织立即按文献[3]测定肝组织糖原含量，同时按文献[4]方法作肝组织葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)活力测定，另将活检组织固定送病理检查。结果见表1。
表1 7例患儿红细胞糖原检测结果及其他检查结果 病例
号
性别
年龄
(岁)
临床诊断
红细胞糖原
(μg/g)
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肝糖原
(g/100 g)
病理报告
肝脏G6Pase
活性(U)
1
女
3
GSD-Ⅰ
762.7
2
男
3.5
, 百拇医药
GSD-Ⅰ
306.2
3
男
2
GSD-Ⅰ
440.1
4
男
3
GSD
453.5
5
, http://www.100md.com 男
2.5
GSD-Ⅰ
289.2
11.6
PAS染色阳性，符合GSD改变：
镜下可见大量糖原颗粒
4.8
6
男
1.5
肥厚型
心肌病(GSD?)
, http://www.100md.com
138.9
7
男
7月
婴儿肝炎
综合征(GSD?)
88.7
2.9
PAS染色阴性，新生儿巨细胞型肝炎
22.4
结果显示，GSD患儿的红细胞糖原明显高于正常范围。其中病例5肝活检组织的糖原测定结果明显高于正常值(正常人肝组织糖原含量低于7 g/100 g湿组织[5])，其病理报告及电镜检查均提示肝组织大量糖原储积，支持临床GSD诊断，酶学分析发现G6Pase活性明显低于文献报道的正常值(25.6 U)[4]，证实为Ⅰ型GSD。病例7临床怀疑为GSD，但经测定红细胞糖原及肝组织糖原含量正常，病理检查未见肝细胞内糖原储积，酶学分析G6Pase正常，排除GSD的可能性。而病例6可能是因为糖原储积，累及心脏，从而致心脏功能受损，有待进一步证实。
, http://www.100md.com
讨论：对于GSD患儿，首先必须了解受影响的组织是肝脏或是肌肉，再通过对活检组织进行糖原含量测定及酶学分析才能确诊。然而，组织活检存在许多困难，是一种损伤性检查，特别是对肝脏和心肌组织。有鉴于此，建立取材容易、灵敏的糖原测定方法具有重要意义。
正常情况下，红细胞内糖原代谢非常活跃，因其磷酸化酶和脱枝酶的相对活性实际上比糖原合成酶及分枝酶活性高，因此其糖原含量很低，除非在病理情况下，糖原不会在红细胞内储积，准确测定红细胞糖原含量可反映机体糖原代谢状况[6]。以往组织糖原测定多采用化学法，由于灵敏度所限，不适于红细胞微量糖原的测定。James Farquharson等建立的红细胞糖原测定方法，糖原回收率可达90%以上，本组采用此法，60例正常儿童红细胞糖原检测值范围较其报道的范围(0～78 μg/g，几何平均值=12，95%正常范围为1.7～84)略高，这可能与样本处理过程有关，本法在样本处理过程中未除去白细胞层，由于白细胞的存在，导致红细胞糖原测定结果偏高[7]。
, 百拇医药
红细胞糖原微量酶法测定灵敏度高，准确可靠，稳定性和重复性较好，临床应用显示，红细胞糖原测定具有较高的特异性，可以代替肝糖原测定，作为GSD患儿的筛查手段。 参考文献
1 Farquharson J, Jamieson EC, MacPhee GB, et al. A new sensitive microassay for the measurement of erythrocyte glycogen. Clin Chim Acta, 1990,187：89-94.
2 上海市医学化验所.临床生化检验.上册.上海：上海科学技术出版社，1982.121.
3 Roe JH, Dailey RE. Determination of glycogen with the anthrone reagent. Anal Biochem, 1966,15：245-250.
, http://www.100md.com
4 李世新，何善述.绒毛、血小板、结肠粘膜组织对糖原累积症Ia型诊断价值的探讨.遗传与疾病，1990，7：230-231.
5 John BS, James BW, Donald SF, et al. The metabolic basis of inherited disease. fifth edition. USA: McGraw-Hill Book Company, 1983.143.
6 Moses SW, Steiner DF. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood, 1972,40：836-843.
7 Wayne C, Ian B, William HT. Interference in the measurement of red cell glycogen by glycogen from white cells. Clin Chim Acta, 1987,162：207-213.
(收稿：1998-03-30 修回：1998-10-27), 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科代谢研究室(陶德定、舒丹、魏虹、王慕逖)；同济医科大学生化教研室(何善述)
关键词：
中华儿科杂志990219
糖原累积病(glycogen storage disease, GSD)是一组与糖原合成和分解代谢有关的某些特定酶的缺失或活力低下，导致糖原在不同组织异常储积而造成的疾病。微量酶法测定红细胞糖原含量，可以代替肝糖原测定，作为GSD患儿的诊断手段，现报告如下。
主要试剂及仪器：(1)淀粉葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、糖原，均为Sigma产品。临用前按文献[1]配制成工作液。(2)酶反应缓冲液，按文献配制。(3)仪器：日立3400型紫外分光光度计。
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检测对象：(1)正常样本：采自体检儿童，临床均已排除了糖原累积病及其他内分泌疾病。其中男性儿童36例，女性儿童24例，年龄范围为1个月～16岁，将其分为小于1岁、1～12岁和大于12岁三组，分别有16、29和15例。(2)被临床诊断为GSD及疑诊为GSD儿童的血样本，共7例。
检测方法：(1)标本处理：采集空腹晨静脉血1 ml，肝素抗凝，尽快低温离心分离出红细胞，按文献方法测定血红蛋白含量[2]。同时，取200 μl红细胞，提取糖原[1]，低温保存备用。糖原标准用同样方法沉淀。(2)糖原测定：采用James Farquharson等建立的酶学方法，对葡萄糖进行定量，并根据标准曲线确定红细胞糖原的含量。(3)标准曲线的制作：糖原标准曲线范围以0～10 μg为宜，在此范围内糖原含量与光密度之间呈线性关系，符合比尔定律。糖原量超过该范围的样本应进行适当稀释后再次测定。每次批量分析均须制作标准曲线。
结果：(1)准确性：以回收试验检验方法的准确性。在同一红细胞样本中分别添加不同量的标准糖原进行回收，平均回收率为92.4%，标准差(s)7.38%。(2)重复性：对一样本糖原重复测定5次，变异系数为8.26%。(3)正常儿童红细胞糖原测定结果：本法测定了60例不同年龄阶段正常儿童的红细胞糖原含量，结果以红细胞每克血红蛋白所含糖原量表示(μg/g)。测定值范围从难以检测(0 μg/g)到92.0 μg/g，几何平均值=21.1，95%正常范围为0～111.8 μg/g(lgG±1.96slgx)。经Wilcoxon检验，无年龄差异，也无性别差异。以红细胞糖原含量升高为不正常，95%单侧上界为97.6 μg/g(lgG+1.645slgx)。
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临床应用：自1994年10月起，有针对性地对已被临床确诊的GSD患儿5例和临床怀疑为GSD的患儿2例的红细胞糖原进行了测定，其中两例患儿进行了肝活检。称取一定量新鲜湿组织立即按文献[3]测定肝组织糖原含量，同时按文献[4]方法作肝组织葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)活力测定，另将活检组织固定送病理检查。结果见表1。
表1 7例患儿红细胞糖原检测结果及其他检查结果 病例
号
性别
年龄
(岁)
临床诊断
红细胞糖原
(μg/g)
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肝糖原
(g/100 g)
病理报告
肝脏G6Pase
活性(U)
1
女
3
GSD-Ⅰ
762.7
2
男
3.5
, 百拇医药
GSD-Ⅰ
306.2
3
男
2
GSD-Ⅰ
440.1
4
男
3
GSD
453.5
5
, http://www.100md.com 男
2.5
GSD-Ⅰ
289.2
11.6
PAS染色阳性，符合GSD改变：
镜下可见大量糖原颗粒
4.8
6
男
1.5
肥厚型
心肌病(GSD?)
, http://www.100md.com
138.9
7
男
7月
婴儿肝炎
综合征(GSD?)
88.7
2.9
PAS染色阴性，新生儿巨细胞型肝炎
22.4
结果显示，GSD患儿的红细胞糖原明显高于正常范围。其中病例5肝活检组织的糖原测定结果明显高于正常值(正常人肝组织糖原含量低于7 g/100 g湿组织[5])，其病理报告及电镜检查均提示肝组织大量糖原储积，支持临床GSD诊断，酶学分析发现G6Pase活性明显低于文献报道的正常值(25.6 U)[4]，证实为Ⅰ型GSD。病例7临床怀疑为GSD，但经测定红细胞糖原及肝组织糖原含量正常，病理检查未见肝细胞内糖原储积，酶学分析G6Pase正常，排除GSD的可能性。而病例6可能是因为糖原储积，累及心脏，从而致心脏功能受损，有待进一步证实。
, http://www.100md.com
讨论：对于GSD患儿，首先必须了解受影响的组织是肝脏或是肌肉，再通过对活检组织进行糖原含量测定及酶学分析才能确诊。然而，组织活检存在许多困难，是一种损伤性检查，特别是对肝脏和心肌组织。有鉴于此，建立取材容易、灵敏的糖原测定方法具有重要意义。
正常情况下，红细胞内糖原代谢非常活跃，因其磷酸化酶和脱枝酶的相对活性实际上比糖原合成酶及分枝酶活性高，因此其糖原含量很低，除非在病理情况下，糖原不会在红细胞内储积，准确测定红细胞糖原含量可反映机体糖原代谢状况[6]。以往组织糖原测定多采用化学法，由于灵敏度所限，不适于红细胞微量糖原的测定。James Farquharson等建立的红细胞糖原测定方法，糖原回收率可达90%以上，本组采用此法，60例正常儿童红细胞糖原检测值范围较其报道的范围(0～78 μg/g，几何平均值=12，95%正常范围为1.7～84)略高，这可能与样本处理过程有关，本法在样本处理过程中未除去白细胞层，由于白细胞的存在，导致红细胞糖原测定结果偏高[7]。
, 百拇医药
红细胞糖原微量酶法测定灵敏度高，准确可靠，稳定性和重复性较好，临床应用显示，红细胞糖原测定具有较高的特异性，可以代替肝糖原测定，作为GSD患儿的筛查手段。 参考文献
1 Farquharson J, Jamieson EC, MacPhee GB, et al. A new sensitive microassay for the measurement of erythrocyte glycogen. Clin Chim Acta, 1990,187：89-94.
2 上海市医学化验所.临床生化检验.上册.上海：上海科学技术出版社，1982.121.
3 Roe JH, Dailey RE. Determination of glycogen with the anthrone reagent. Anal Biochem, 1966,15：245-250.
, http://www.100md.com
4 李世新，何善述.绒毛、血小板、结肠粘膜组织对糖原累积症Ia型诊断价值的探讨.遗传与疾病，1990，7：230-231.
5 John BS, James BW, Donald SF, et al. The metabolic basis of inherited disease. fifth edition. USA: McGraw-Hill Book Company, 1983.143.
6 Moses SW, Steiner DF. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood, 1972,40：836-843.
7 Wayne C, Ian B, William HT. Interference in the measurement of red cell glycogen by glycogen from white cells. Clin Chim Acta, 1987,162：207-213.
(收稿：1998-03-30 修回：1998-10-27), 百拇医药