粘附分子在肾病综合征患儿周围血和肾组织的表达
作者：张爱平 王艳侠 尹格平 孙晓明 郭云珊
单位：250031 济南，济南军区总医院肾内科(张爱平、王艳侠、郭云珊)，流式细胞室(尹格平、孙晓明)
关键词：
中华儿科杂志/990315 细胞粘附分子(CAMs)介导的细胞间、细胞与细胞外基质粘附机制在多种形式的肾小球肾炎、血管炎、小管间质性炎症中的重要作用已引起特别关注。我们以免疫荧光标记单克隆抗体，对肾病综合征(N S)患儿观察了CAMs β2整合素(CD18)、P选择素(CD62P)在肾活检组织中的表达分布，并对其周围血中表达水平以流式细胞术分析，旨在探讨CAMsCD18、CD62P在NS患儿发病中的作用。
对象：患儿组：16例，为1996年7月～1997年9月住院患儿，临床均符合NS诊断，并除外继发性因素。男10例，女6例，年龄7～12岁(平均10岁)，患儿尿蛋白(+)～(++++)，24小时尿蛋白定量3.6～14 .6 g，均处于发作期。均行肾活检，肾活检组织作光镜、免疫酶标和透射电镜检查。病理类型(WHO1982年制订标准)：系膜增生性肾炎(MsPGN)9例、微小病变性肾病(MCD)3例、膜性肾病(MN)2例、膜增生性肾炎(MPGN)2例，病程16天至3年，所有患儿均无肾功能失代偿表现。
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正常对照组：20例，为健康体检者。男10例，女10例，年龄8～12岁(平均10岁)。肾活检病例设正常对照组8例，为用于肾移植术的健康肾组织。
方法：(1)周围血CD18、CD62P流式细胞测定[1]：特殊试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体CD18、CD62P(鼠抗人)，阴性对照为免疫球蛋白(IgG1)(羊抗鼠)，均为法国国际免疫公司产品。流式细胞仪：FACScan型，美国Becton Dickison公司生产。取静脉抗凝血2 ml，分离淋巴细胞悬液100 μl于2支试管中，分别加入CD18-FITC、IgG1-FITC 20 μl；再取血小板悬液100 μl于2支试管中，分别加入CD62P-FITC、IgG1-FITC 20 μl，离心漂洗弃上清，流式细胞仪检测。计算方法：
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(2)肾活检组织CD18、CD62P表达测定：直接免疫荧光法：取肾活检冰冻组织切片5 μm厚，分别滴加鼠抗人CD18-FITC、CD62P-FITC，羊抗鼠(阴性对照)IgG1-FITC工作液30 μl。孵育40分钟后漂洗，荧光显微镜下判断，+～＃为表达阳性。(3)统计学处理：实验数据以
±s表示，两组间的比较采用t检验及直线相关分析。
结果：(1)NS患儿周围血CD18、CD62P表达：16例患儿CD18表达量为(50±17)%，CD62P表达量为(7.6±3.0)%，均明显高于正常对照组(17±5，3.1±1.0,P<0.01)。(2)CD18病理类型的表达为：MsPGN 8/9例、MCD 1/3例、MN 2/2例、MPGN 2/2例，即13/16例在肾组织表达(81%)；CD62P病理类型的表达为：MsPGN 9/9例、MCD 1/3例、MN 2/2例、MPGN 2/2例，即14/16例在肾组织表达(87%)。表达部位多见于小球系膜区和毛细血管袢、肾小管、间质小血管壁，表达强度多介于(++)～(+++)之间，CD62P的表达，以细胞增生的肾炎肾组织中尤为显著，CD18、CD62P在肾组织表达明显增强，与周围血表达增高水平密切相关，且表达部位和水平与肾脏病理类型的病变部位和程度相一致。(3)本组患儿血胆固醇8.5±1.0(mmo1/L，下同)。甘油三脂2.0±0.6，均高于正常对照组(3.24±0.61、0.88±0.24,P<0.01)，通过相关性分析显示，周围血CD62P表达水平与血胆固醇、甘油三脂之间呈线性正相关(r分别为0.7538，0.6924，P均<0.01)；与凝血酶原时间[(9.2±1.6)秒]之间呈线性负相关(r=-0.56，P<0.05)。
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讨论：CD18分子量为180 000/95 000，是整合素β2亚单位，它是细胞骨架成分，对维持组织结构与功能及白细胞与内皮细胞粘附起重要作用，我们的研究结果显示NS患儿周围血中CD18表达量明显提高，肾组织中亦有明显表达，表明CD18参与了NS的发病过程。
常规血小板活化检测方法特异性低并受多种因素影响，单纯血小板数量变化并不能完全反映血小板的功能。CD62P为分子量140 000的α颗粒完整膜蛋白，属选择素家族主要成员，当血小板被活化时，血小板的分泌导致其颗粒膜与质膜相融合，成为活化血小板的分子标志物，可用以特异评价血小板活化程度。NS患儿存在免疫功能失调导致组织炎症反应和损伤，伴有高凝状态和血栓形成，我们发现9例系膜增生性肾炎和2例膜增生性肾炎肾组织中CD62P表达明显增强，提示CD62P介导了肾内血小板聚集活化、炎细胞浸润，导致细胞增生和细胞外基质分泌增加，在NS的发病机理中具有重要作用，故可以CD62P为指标观察和鉴别患儿体内血小板和内皮细胞激活状态。
参考文献
1 孙晓明，尹格平.实体瘤组织细胞粘 附分子流式细胞研究方法的建立.中华医学检验杂志，1997，20:9.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-12-23), 百拇医药
单位：250031 济南，济南军区总医院肾内科(张爱平、王艳侠、郭云珊)，流式细胞室(尹格平、孙晓明)
关键词：
中华儿科杂志/990315 细胞粘附分子(CAMs)介导的细胞间、细胞与细胞外基质粘附机制在多种形式的肾小球肾炎、血管炎、小管间质性炎症中的重要作用已引起特别关注。我们以免疫荧光标记单克隆抗体，对肾病综合征(N S)患儿观察了CAMs β2整合素(CD18)、P选择素(CD62P)在肾活检组织中的表达分布，并对其周围血中表达水平以流式细胞术分析，旨在探讨CAMsCD18、CD62P在NS患儿发病中的作用。
对象：患儿组：16例，为1996年7月～1997年9月住院患儿，临床均符合NS诊断，并除外继发性因素。男10例，女6例，年龄7～12岁(平均10岁)，患儿尿蛋白(+)～(++++)，24小时尿蛋白定量3.6～14 .6 g，均处于发作期。均行肾活检，肾活检组织作光镜、免疫酶标和透射电镜检查。病理类型(WHO1982年制订标准)：系膜增生性肾炎(MsPGN)9例、微小病变性肾病(MCD)3例、膜性肾病(MN)2例、膜增生性肾炎(MPGN)2例，病程16天至3年，所有患儿均无肾功能失代偿表现。
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正常对照组：20例，为健康体检者。男10例，女10例，年龄8～12岁(平均10岁)。肾活检病例设正常对照组8例，为用于肾移植术的健康肾组织。
方法：(1)周围血CD18、CD62P流式细胞测定[1]：特殊试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体CD18、CD62P(鼠抗人)，阴性对照为免疫球蛋白(IgG1)(羊抗鼠)，均为法国国际免疫公司产品。流式细胞仪：FACScan型，美国Becton Dickison公司生产。取静脉抗凝血2 ml，分离淋巴细胞悬液100 μl于2支试管中，分别加入CD18-FITC、IgG1-FITC 20 μl；再取血小板悬液100 μl于2支试管中，分别加入CD62P-FITC、IgG1-FITC 20 μl，离心漂洗弃上清，流式细胞仪检测。计算方法：
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(2)肾活检组织CD18、CD62P表达测定：直接免疫荧光法：取肾活检冰冻组织切片5 μm厚，分别滴加鼠抗人CD18-FITC、CD62P-FITC，羊抗鼠(阴性对照)IgG1-FITC工作液30 μl。孵育40分钟后漂洗，荧光显微镜下判断，+～＃为表达阳性。(3)统计学处理：实验数据以
±s表示，两组间的比较采用t检验及直线相关分析。结果：(1)NS患儿周围血CD18、CD62P表达：16例患儿CD18表达量为(50±17)%，CD62P表达量为(7.6±3.0)%，均明显高于正常对照组(17±5，3.1±1.0,P<0.01)。(2)CD18病理类型的表达为：MsPGN 8/9例、MCD 1/3例、MN 2/2例、MPGN 2/2例，即13/16例在肾组织表达(81%)；CD62P病理类型的表达为：MsPGN 9/9例、MCD 1/3例、MN 2/2例、MPGN 2/2例，即14/16例在肾组织表达(87%)。表达部位多见于小球系膜区和毛细血管袢、肾小管、间质小血管壁，表达强度多介于(++)～(+++)之间，CD62P的表达，以细胞增生的肾炎肾组织中尤为显著，CD18、CD62P在肾组织表达明显增强，与周围血表达增高水平密切相关，且表达部位和水平与肾脏病理类型的病变部位和程度相一致。(3)本组患儿血胆固醇8.5±1.0(mmo1/L，下同)。甘油三脂2.0±0.6，均高于正常对照组(3.24±0.61、0.88±0.24,P<0.01)，通过相关性分析显示，周围血CD62P表达水平与血胆固醇、甘油三脂之间呈线性正相关(r分别为0.7538，0.6924，P均<0.01)；与凝血酶原时间[(9.2±1.6)秒]之间呈线性负相关(r=-0.56，P<0.05)。
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讨论：CD18分子量为180 000/95 000，是整合素β2亚单位，它是细胞骨架成分，对维持组织结构与功能及白细胞与内皮细胞粘附起重要作用，我们的研究结果显示NS患儿周围血中CD18表达量明显提高，肾组织中亦有明显表达，表明CD18参与了NS的发病过程。
常规血小板活化检测方法特异性低并受多种因素影响，单纯血小板数量变化并不能完全反映血小板的功能。CD62P为分子量140 000的α颗粒完整膜蛋白，属选择素家族主要成员，当血小板被活化时，血小板的分泌导致其颗粒膜与质膜相融合，成为活化血小板的分子标志物，可用以特异评价血小板活化程度。NS患儿存在免疫功能失调导致组织炎症反应和损伤，伴有高凝状态和血栓形成，我们发现9例系膜增生性肾炎和2例膜增生性肾炎肾组织中CD62P表达明显增强，提示CD62P介导了肾内血小板聚集活化、炎细胞浸润，导致细胞增生和细胞外基质分泌增加，在NS的发病机理中具有重要作用，故可以CD62P为指标观察和鉴别患儿体内血小板和内皮细胞激活状态。
参考文献
1 孙晓明，尹格平.实体瘤组织细胞粘 附分子流式细胞研究方法的建立.中华医学检验杂志，1997，20:9.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-12-23), 百拇医药