脆性X基因FMR-1的分子遗传研究
作者：丁秀原 陈虹 王红
单位：100020 北京，首都儿科研究所
关键词：
中华儿科杂志/990414 脆性X综合征是一种以智力障碍表现为主的X连锁遗传病,该病与位于Xq27.3处的一个对叶酸敏感的脆性位点有关。我们用Southern印迹杂交及PCR技术对脆性X相关基因FMR-1进行了基因分析,现报道如下。
对象:用细胞遗传学方法从55名男性智力低下患者中检出两个脆性X综合征家系A、B。两个家系中的6例患者均具有典型的脆性X综合征临床表现,如智力低下(轻度者2例:AⅢ6、BⅡ1;中度者3例:AⅢ8、AⅢ9、BⅡ5;重度者1例：AⅢ4),语言障碍,前额、下颌突出,大睾丸等。细胞遗传学方法检查脆性X[fra(X)]均阳性,检出频率7%～24%。3例肯定携带者(患者之母:AⅡ1、AⅡ6、BⅠ1)除AⅡ1fra(X)检出频率为1%外,余者及AⅠ1(患者外祖母)、BⅢ1(患者之女)皆为零。45名正常人(男23名,女22名)为对照组。
, 百拇医药
实验方法:(1)Southern印迹杂交:基因组DNA从外周血按低渗溶血法提取。探针StB12.3及StB12xx由法国INSERM.Dr Mandel Jl赠送,其纯化片段应用随机引物法进行(α-32P)dCTP标记。基因组DNA分别经EcoRⅠ、EcoRⅠ和BssHⅡ、BclⅠ酶解。酶解后的基因组DNA电泳转膜,与相应的探针杂交,洗膜,-70℃放射自显影。(2)PCR分析:引物序列为:5′-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTT-3′和5′-CTCCATCTTCTCTTCAGCCCT-3′。当CGG重复为16拷贝时,扩增片段约250 bp。在PCR反应前,先将基因组DNA进行化学变性。在PCR反应中,每种引物浓度为0.5 μmol/L,dNTP 200 μmol/L(其中7- deaza-dGTP:dGTP的浓度为3∶1),并加5%DMSO。加入TaqDNA聚合酶和矿物油后，于DNA热循环仪进行PCR，循环条件为94℃1分钟，55℃2分钟,72℃2分钟,循环40次后于72℃再延伸10分钟。取扩增产物10 μl于1.8%琼脂糖凝胶上电泳16小时(1×TBE缓冲液,2 V/cm),将DNA转移到硝酸纤维膜上,用(r-32P)ATP标记的寡核苷酸探针(CGG)5杂交,洗膜,-20℃放射自显影。根据Hinf1消化的PBR 322 DNA片段,来估算扩增片段的大小,从而推算出CGG三核苷酸重复序列的拷贝数。
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结果:1.Southern印迹杂交结果:EcoRⅠ酶切的基因组DNA与探针StB 12.3杂交时:正常人及女性携带者基因组DNA杂交片段为5.2 kb, 6名患者均见大于5.8kb的弥散带。EcoRⅠ和BssHⅡ双酶切的基因组DNA与探针StB 12.3杂交时:正常男性和女性分别检出2.8 kb和2.8 kb/5.2 kb杂交带。6名患者检出5.8～9 kb的带型,CpG岛出现异常甲基化。2名携带者AⅡ1、BⅠ1(AⅡ6未取到基因分析标本)及AⅠ1的基因组DNA无明显异常,患者之女(BⅢ1)见2.8 kb/3.1 kb/5.2 kb的杂交带。经BclⅠ酶切的DNA与探针StB12xx杂交结果:正常人见12 kb/1 kb杂交带,女性携带者AⅡ1、BⅠ1及患者之女BⅢ1比正常人多一条大于1 kb的杂交带,分别为1.6 kb、1.3 kb、1.4 kb。
, http://www.100md.com 2.PCR分析:45名正常人中9名女性DNA扩增产物显示2条杂交带,余者及23名男性的基因组DNA均显示一条杂交带,杂交片段约240～360 bp,表明正常人FMR-1基因含有13～52个CGG重复,其中约有86%集中在32～39个,6例脆性X综合征患者见弥散的区带。AⅠ1、AⅡ1、BⅠ1及BⅢ1显示的两条杂交带，CGG重复数分别为24/34、24/105、39/65、39/65。
讨论:脆性X综合征是由于FMR-1基因第一外显子5′端三核苷酸(CGG)n重复序列延长所致。正常人群中三核苷酸重复序列的拷贝数在6～54之间;携带者群体中(CGG)n拷贝数在60～200之间,已发生前突变;患者(CGG)n拷贝数大于200,同时伴随其周围DNA序列的CpG岛异常甲基化,发生完全突变。本组45名正常人所检测到的(CGG)n拷贝数范围是13～52,2名携带者及患者之女的两条X染色体则显示含有CGG重复在正常范围和前突变的等位基因,说明患者之女为携带者。而患者常因CGG重复大于200拷贝,使PCR扩增失败或呈弥散区带。在Southern印迹分析中我们使用①EcoRⅠ;②EcoRⅠ+BssHⅡ两组酶与探针StB 12.3的组合,均有效地检出患者CGG重复序列延长,在BclⅠ酶与探针StB12xx的组合中所有携带者均检出一条大于1 kb的杂交带,说明此组酶与探针的组合是检出携带者的有效方法。此外,AⅠ1的基因组DNA采用三种酶与探针的组合及PCR分析均未见异常,说明为正常女性,其两个女儿为脆性X携带者,以此推测AⅠ2(患者之外祖父)可能为正常传递男性。总之,FMR-1基因内三核苷酸(CGG)n重复呈多态分布,PCR分析方法简便,可靠性强,能检出前突变,可用于群体中携带者的检出。探针StB12xx可观察到正常与小的前突变等位基因之间的差异,但不能确定CpG岛异常甲基化,可用于携带者的检出。探针StB12.3不仅可检出CGG扩增程度,而且可检出CpG岛异常甲基化,对识别完全突变和大的前突变是可靠有效的方法,可用于脆性X综合征的检出。当携带者或先证者确定后,可根据遗传学原理和临床表现,对家系成员选用不同的DNA分析方法,进行基因诊断，提高诊断准确性。
本课题由北京市自然科学基金资助(项目编号：7932004)
(收稿：1998-04-03 修回：1999-01-05), 百拇医药
单位：100020 北京，首都儿科研究所
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中华儿科杂志/990414 脆性X综合征是一种以智力障碍表现为主的X连锁遗传病,该病与位于Xq27.3处的一个对叶酸敏感的脆性位点有关。我们用Southern印迹杂交及PCR技术对脆性X相关基因FMR-1进行了基因分析,现报道如下。
对象:用细胞遗传学方法从55名男性智力低下患者中检出两个脆性X综合征家系A、B。两个家系中的6例患者均具有典型的脆性X综合征临床表现,如智力低下(轻度者2例:AⅢ6、BⅡ1;中度者3例:AⅢ8、AⅢ9、BⅡ5;重度者1例：AⅢ4),语言障碍,前额、下颌突出,大睾丸等。细胞遗传学方法检查脆性X[fra(X)]均阳性,检出频率7%～24%。3例肯定携带者(患者之母:AⅡ1、AⅡ6、BⅠ1)除AⅡ1fra(X)检出频率为1%外,余者及AⅠ1(患者外祖母)、BⅢ1(患者之女)皆为零。45名正常人(男23名,女22名)为对照组。
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实验方法:(1)Southern印迹杂交:基因组DNA从外周血按低渗溶血法提取。探针StB12.3及StB12xx由法国INSERM.Dr Mandel Jl赠送,其纯化片段应用随机引物法进行(α-32P)dCTP标记。基因组DNA分别经EcoRⅠ、EcoRⅠ和BssHⅡ、BclⅠ酶解。酶解后的基因组DNA电泳转膜,与相应的探针杂交,洗膜,-70℃放射自显影。(2)PCR分析:引物序列为:5′-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTT-3′和5′-CTCCATCTTCTCTTCAGCCCT-3′。当CGG重复为16拷贝时,扩增片段约250 bp。在PCR反应前,先将基因组DNA进行化学变性。在PCR反应中,每种引物浓度为0.5 μmol/L,dNTP 200 μmol/L(其中7- deaza-dGTP:dGTP的浓度为3∶1),并加5%DMSO。加入TaqDNA聚合酶和矿物油后，于DNA热循环仪进行PCR，循环条件为94℃1分钟，55℃2分钟,72℃2分钟,循环40次后于72℃再延伸10分钟。取扩增产物10 μl于1.8%琼脂糖凝胶上电泳16小时(1×TBE缓冲液,2 V/cm),将DNA转移到硝酸纤维膜上,用(r-32P)ATP标记的寡核苷酸探针(CGG)5杂交,洗膜,-20℃放射自显影。根据Hinf1消化的PBR 322 DNA片段,来估算扩增片段的大小,从而推算出CGG三核苷酸重复序列的拷贝数。
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结果:1.Southern印迹杂交结果:EcoRⅠ酶切的基因组DNA与探针StB 12.3杂交时:正常人及女性携带者基因组DNA杂交片段为5.2 kb, 6名患者均见大于5.8kb的弥散带。EcoRⅠ和BssHⅡ双酶切的基因组DNA与探针StB 12.3杂交时:正常男性和女性分别检出2.8 kb和2.8 kb/5.2 kb杂交带。6名患者检出5.8～9 kb的带型,CpG岛出现异常甲基化。2名携带者AⅡ1、BⅠ1(AⅡ6未取到基因分析标本)及AⅠ1的基因组DNA无明显异常,患者之女(BⅢ1)见2.8 kb/3.1 kb/5.2 kb的杂交带。经BclⅠ酶切的DNA与探针StB12xx杂交结果:正常人见12 kb/1 kb杂交带,女性携带者AⅡ1、BⅠ1及患者之女BⅢ1比正常人多一条大于1 kb的杂交带,分别为1.6 kb、1.3 kb、1.4 kb。
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讨论:脆性X综合征是由于FMR-1基因第一外显子5′端三核苷酸(CGG)n重复序列延长所致。正常人群中三核苷酸重复序列的拷贝数在6～54之间;携带者群体中(CGG)n拷贝数在60～200之间,已发生前突变;患者(CGG)n拷贝数大于200,同时伴随其周围DNA序列的CpG岛异常甲基化,发生完全突变。本组45名正常人所检测到的(CGG)n拷贝数范围是13～52,2名携带者及患者之女的两条X染色体则显示含有CGG重复在正常范围和前突变的等位基因,说明患者之女为携带者。而患者常因CGG重复大于200拷贝,使PCR扩增失败或呈弥散区带。在Southern印迹分析中我们使用①EcoRⅠ;②EcoRⅠ+BssHⅡ两组酶与探针StB 12.3的组合,均有效地检出患者CGG重复序列延长,在BclⅠ酶与探针StB12xx的组合中所有携带者均检出一条大于1 kb的杂交带,说明此组酶与探针的组合是检出携带者的有效方法。此外,AⅠ1的基因组DNA采用三种酶与探针的组合及PCR分析均未见异常,说明为正常女性,其两个女儿为脆性X携带者,以此推测AⅠ2(患者之外祖父)可能为正常传递男性。总之,FMR-1基因内三核苷酸(CGG)n重复呈多态分布,PCR分析方法简便,可靠性强,能检出前突变,可用于群体中携带者的检出。探针StB12xx可观察到正常与小的前突变等位基因之间的差异,但不能确定CpG岛异常甲基化,可用于携带者的检出。探针StB12.3不仅可检出CGG扩增程度,而且可检出CpG岛异常甲基化,对识别完全突变和大的前突变是可靠有效的方法,可用于脆性X综合征的检出。当携带者或先证者确定后,可根据遗传学原理和临床表现,对家系成员选用不同的DNA分析方法,进行基因诊断，提高诊断准确性。
本课题由北京市自然科学基金资助(项目编号：7932004)
(收稿：1998-04-03 修回：1999-01-05), 百拇医药