云南苯丙氨酸羟化酶基因内(TCTA)n多态性及其在苯丙酮尿症诊断中的应用
作者：朱月春 汪宁 邱志明 徐葵
单位：650031 昆明医学院生化教研室
关键词：苯丙酮尿症；聚合酶链反应；苯丙氨酸羟化酶；基因；产前诊断
中华儿科杂志990506 【摘要】 目的 应用苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内(TCTA)n多态性连锁分析进行经典型苯丙酮尿症(PKU)的基因诊断和产前诊断。方法 应用聚合酶链反应-扩增片段长度多态性(PCR-Amp-FLP)方法，分析云南省13个家系苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内(TCTA)n多态性。结果 在13个家系中检测到224～252 bp的8种等位片段，其PIC为0.698,杂合频率是51%。可诊断率为100%和50%的家系各6个，1个家系因双亲带型为纯合型而未能诊断，可诊断率为69%。完成1例产前基因诊断和2例回顾性的基因诊断。结论 (TCTA)n的PCR-Amp FLP分析可作为经典型PKU基因诊断和产前诊断的一种简便有效的方法。
, http://www.100md.com
Application of (TCTA)n polymorphism in PAH gene in PKU prenatal diagnosis in Yunnan ZHU Yuechun, WANG Ning, QIU Zhiming, et al. Department of Biochemistry, Kunming Medical College, Kunming 650031
【Abstract】 Objective To evaluate applicability of (TCTA)n polymorphism analysis in PAH gene in classical PKU prenatal diagnosis. Methods (TCTA)n polymorphism was analysed in 13 PKU families in Yunnan province by PCR-Amp-FLP. Results Eight alleles (224-252 bp) of (TCTA)n were identified, and PIC and degree of heterozygosity were 0.698 and 51%, respectively. Six families had a diagnosis rate of 100% and another 6 had a diagnosis rate of 50%. In one family the diagnosis could not be made because the parents carried homozygote. The rate of diagnosis that could be made was 69%. The prenatal diagnosis was made in one fetus and in two cases a retrospective gene diagnosis was made. Conclusion (TCTA)n Amp-FLP is an effective, simple and widely applicable PKU gene diagnosis method.
, 百拇医药
【Key words】 Phenylketonuria Polymerase chain reaction Phenylalanine hydroxylase Gene Prenatal diagnosis
经典型苯丙酮尿症(classic phenylketonuria,PKU)为肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenyalanine hydroxylase, PAH)缺陷所致，是引起智力缺陷的一种主要遗传病。我国发病率为1/16,500，杂合频率高达1/65[1]。因新生儿筛查和低苯丙氨酸饮食治疗尚未普及，患儿智力损害不能控制。加上PAH基因只在肝细胞特异表达,生化检查不能进行产前诊断。所以预防PKU的首选方法是产前基因诊断辅以异常胎儿的人工流产。在人类基因组序列中，发现有短串联重复序列(short tandem repeat,STR)存在[2]，自WOO克隆了人PAH基因后,Golfsov等[3]发现PAH基因内含子3中有(TCTA)n的四核苷酸STR，对PKU基因诊断有较高价值。STR基因座等位基因因种族、人群不同而异。我们分析了云南PKU的这一STR位点多态性，并将其连锁分析用于PKU产前诊断。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.标本来源：13个PKU家系取自云南各地，患儿除有典型PKU临床表现外，血清苯丙氨酸均高于1.21 mmol/L(荧光分光光度法)。产前诊断样品为妊娠10周的胎儿绒毛组织。
2.仪器和试剂：Perkin elmer Cetus热循环仪,恒压恒流电泳仪,小型垂直电泳槽(适用于12 cm长的胶)。Taq聚合酶(医科院基础所),(TCTA)n STR 的引物由北京遗传医学中心提供，其序列为F5′-GCCAGAACAACTACTGGTTC-3′和5′-AATCATAAGTGT TCCAGAC-3′。
二、方法
1.基因组DNA和绒毛组织DNA：采用常规酚：氯仿：异戊醇抽提。
, 百拇医药
2.PCR扩增：25 μl体系中含2.5 mmol/L dNTP 1 μl,每个引物82.5 ng,Taq酶1-1.5 U,模板DNA 0.3～0.5 μg。扩增条件：95℃变性5分钟后,94℃30秒，53℃ 30秒，70℃ 1分钟。循环30次,最后70℃延伸10分钟。扩增产物经2%的琼脂糖电泳检测，以鉴定扩增效果。
3.扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP)分析：取1～2 μl上述扩增产物(视扩增效率而定)，加电泳加样液(含95%甲酰胺及0.05%溴酚蓝，二甲苯蓝等。)3μl, 98℃变性10分钟，冰浴骤冷，进行6%聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol/L尿素)电泳分离,恒压600 V，预电泳1小时, 加样后电泳1.2～1.5小时，用银染色法显示扩增DNA区带，具体步骤为：10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定凝胶6分钟2次，0.2%硝酸银溶液染10～15分钟(新鲜试剂只需3～5分钟)，蒸馏水充分漂洗凝胶数次，1.5%氢氧化钠,0.4%甲醛溶液显色至适度，蒸馏水终止显色。电泳时，以PBR322/MSPI酶解质粒DNA片段作为扩增片段长度的参考标准(加样前同法变性成单链)。实验结果干胶保存并照相[4]。
, 百拇医药
4.位点多态性信息量(polymorphism information- contents,PIC)按以下公式计算：
结 果
一、(TCTA)n多态性基因诊断率
分析云南籍13个PKU家系52条染色体检出225～252 bp 8种等位片段。其中以240 bp和244bp频率最高(表1)，PIC是0.698，杂合频率为51%。13个家系中有6个家系具有100%可诊断率，6个家系具有50%可诊断率，1个家系因双亲带型呈纯合型而不能诊断，本组可诊断率为69%。
二、(TCTA)n STR连锁分析在PKU产前诊断中的应用
家系1作产前诊断,风险胎儿10周,先证者(胎儿之姐)为PKU患者。按上述方法分析胎儿之父、母、先证者、风险胎儿的STR多态性。他们的STR位点检测如下：父有2条长度不等的等位片段分别为244 bp和240 bp；母为2条长度均为240 bp的等位片段；先证者STR位点的2条等位片段长度均为240bp，与母亲的相似，但本质是不同的，显然先证者的这两条等位片段都与致病基因连锁，而且分别来自父的240 bp的等位片段和母的240 bp等位片段。这样可区分出父的240 bp等位片段是与致病基因相连锁而另一条244 bp的等位片段则与正常基因连锁。风险胎儿的STR位点的2条等位片段长度与其父的完全相同，即既有与致病基因连锁的240 bp扩增等位片段,又有与正常基因连锁的244 bp片段，所以与其父一样是PKU基因携带者,无临床症状,可娩出。通过此产前诊断，作出了明确的诊断。
, 百拇医药
表1 13个PKU家系(TCTA)nSTR位点的多态性 等位基因
片断长度(bp)
染色体数
频率
1
224
3
0.058
2
228
2
0.038
3
, http://www.100md.com
232
5
0.096
4
236
3
0.058
5
240
20
0.385
6
244
, http://www.100md.com 16
0.308
7
248
2
0.038
8
252
1
0.019
合计
52
1
家系2为一回顾性基因诊断。已知先证者为PKU，其弟是PKU基因携带者,其父、母、先证者及其弟的STR位点分别如下：父有长度为240 bp和236 bp的两条STR等位片段，母有240 bp和232 bp两条STR等位片段，先证者的STR等位片段长度为240 bp和232 bp，分别来自父亲和母亲的致病基因。这样即可确定出父的240 bp等位片段和母的232 bp等位片段分别均与致病基因相连锁，而父的236 bp和母的240 bp等位片段则与正常基因连锁。先证者之弟的STR位点等片段的长度均为240 bp，分别来自于父的240 bp等位片段(与致病基因相连锁)和母的240 bp片段(与正常基因相连锁)，故而是PKU基因携带者，与实际情况相吻合。
, 百拇医药
家系3亦为一回顾性基因诊断，已知先证者之妹亦为PKU患者。STR连锁分析表明，其父有长度均为232 bp的2条等位片段,母有长度为232 bp和238 bp的2条等位片段,先证者有长度均为232 bp的STR位点等片段。从而可知母的232 bp等位片段是与致病基因连锁，而238 bp等位片段则与正常基因连锁。而父的232 bp等位片段的其中一条与致病基因连锁，另一条则与正常基因连锁,由于片段长度相同表现为一条电泳区带,无法区别开，故先证者的同胞的STR位点等位片段为纯合型的232 bp时，可以是PKU基因携带者也可以是PKU患者。因此无法作明确的诊断，需要配合其他的分析。该家系的实际情况是先证者之妹为PKU患者。
讨 论
(TATC)n四核苷酸STR位于PAH基因内含子3的5′端700 bp处。具有高度的多态性、很多的等位片段和较高的信息量。白种人群中存在228～260 bp的9种等位片段，PIC是0.80[5]，我国北方PKU家系中有224～256 bp的9种片段，其PIC是0.680～0.730[4，6]。云南人群中则分布有224～252 bp的8种等位片段,未检出256 bp的等位片段,PIC为0.698。与我国北方人群的结果相似。由于STR有很高的信息量,是非常有用的遗传标志。利用与PKU致病基因紧密连锁的(TCTA)n的STR进行连锁分析，证明对PKU基因诊断的成功率较高。它的优点还在于不须知道基因的DNA序列或突变的位置与性质，所以是一种间接基因诊断法，检测方法简单易行，不需任何基因探针，不需酶解基因组DNA或印迹转移，就能得出结果。它经济快速，在诊断明确的经典型PKU家析分析中是目前最好的首选的方法。但是正如我们在家系3的分析中看到的那样，不管在北方人群还是云南地区检出的STR等位片段多态性信息量约为0.70左右，对待诊者不能百分之百地都作出明确诊断。因此除了以STR连锁分析法为主要和首选诊断途径以外，还需结合其他的方法，如应用PCR-SSCP方法直接检测PAH基因常见的突变位点(直接基因诊断)，制定出适合该地区的快速有效的产前诊断方案，使PKU的产前诊断更臻于完善。
, http://www.100md.com
志谢 本研究得到北京中国遗传医学中心黄尚志、袁丽芳等老师的帮助
本课题由云南省应用基础研究基金资助(基金项目编号：95CO69M)
参考文献
1 11省市苯丙酮尿症筛查协作组.我国11省市苯丙酮尿症新生儿筛查.中华儿科杂志，1985,23:321-323.
2 Brian C, Paul S,Wolfgang S.The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature,1994, 371:215-220.
3 Golfsov AA, Eisensmith RC, Naughtan ER, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993,2:577-581.
, 百拇医药
4 黄尚志,方柄良，初海鹰,等.苯丙氨酸羟化酶基因内短串联重复序列多态性的分析及应用.中华医学杂志，1995，75：22-24.
5 Eisensmith RC, Goltsov AA, Woo SL. A simple rapid highly informative PCR-based procedure for prenatal diagnosis and carrier screening of phenylketonuria. Prenat Diagn (ENGLAND)，1994，14：1113-1118.
6 宋,吴冠芸，徐光芝.联合应用STR连锁分析与多重等位基因特异PCR进行PKU基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14:9-12.
(收稿：1998-03-04 修回：1998-11-09), 百拇医药
单位：650031 昆明医学院生化教研室
关键词：苯丙酮尿症；聚合酶链反应；苯丙氨酸羟化酶；基因；产前诊断
中华儿科杂志990506 【摘要】 目的 应用苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内(TCTA)n多态性连锁分析进行经典型苯丙酮尿症(PKU)的基因诊断和产前诊断。方法 应用聚合酶链反应-扩增片段长度多态性(PCR-Amp-FLP)方法，分析云南省13个家系苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因内(TCTA)n多态性。结果 在13个家系中检测到224～252 bp的8种等位片段，其PIC为0.698,杂合频率是51%。可诊断率为100%和50%的家系各6个，1个家系因双亲带型为纯合型而未能诊断，可诊断率为69%。完成1例产前基因诊断和2例回顾性的基因诊断。结论 (TCTA)n的PCR-Amp FLP分析可作为经典型PKU基因诊断和产前诊断的一种简便有效的方法。
, http://www.100md.com
Application of (TCTA)n polymorphism in PAH gene in PKU prenatal diagnosis in Yunnan ZHU Yuechun, WANG Ning, QIU Zhiming, et al. Department of Biochemistry, Kunming Medical College, Kunming 650031
【Abstract】 Objective To evaluate applicability of (TCTA)n polymorphism analysis in PAH gene in classical PKU prenatal diagnosis. Methods (TCTA)n polymorphism was analysed in 13 PKU families in Yunnan province by PCR-Amp-FLP. Results Eight alleles (224-252 bp) of (TCTA)n were identified, and PIC and degree of heterozygosity were 0.698 and 51%, respectively. Six families had a diagnosis rate of 100% and another 6 had a diagnosis rate of 50%. In one family the diagnosis could not be made because the parents carried homozygote. The rate of diagnosis that could be made was 69%. The prenatal diagnosis was made in one fetus and in two cases a retrospective gene diagnosis was made. Conclusion (TCTA)n Amp-FLP is an effective, simple and widely applicable PKU gene diagnosis method.
, 百拇医药
【Key words】 Phenylketonuria Polymerase chain reaction Phenylalanine hydroxylase Gene Prenatal diagnosis
经典型苯丙酮尿症(classic phenylketonuria,PKU)为肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenyalanine hydroxylase, PAH)缺陷所致，是引起智力缺陷的一种主要遗传病。我国发病率为1/16,500，杂合频率高达1/65[1]。因新生儿筛查和低苯丙氨酸饮食治疗尚未普及，患儿智力损害不能控制。加上PAH基因只在肝细胞特异表达,生化检查不能进行产前诊断。所以预防PKU的首选方法是产前基因诊断辅以异常胎儿的人工流产。在人类基因组序列中，发现有短串联重复序列(short tandem repeat,STR)存在[2]，自WOO克隆了人PAH基因后,Golfsov等[3]发现PAH基因内含子3中有(TCTA)n的四核苷酸STR，对PKU基因诊断有较高价值。STR基因座等位基因因种族、人群不同而异。我们分析了云南PKU的这一STR位点多态性，并将其连锁分析用于PKU产前诊断。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.标本来源：13个PKU家系取自云南各地，患儿除有典型PKU临床表现外，血清苯丙氨酸均高于1.21 mmol/L(荧光分光光度法)。产前诊断样品为妊娠10周的胎儿绒毛组织。
2.仪器和试剂：Perkin elmer Cetus热循环仪,恒压恒流电泳仪,小型垂直电泳槽(适用于12 cm长的胶)。Taq聚合酶(医科院基础所),(TCTA)n STR 的引物由北京遗传医学中心提供，其序列为F5′-GCCAGAACAACTACTGGTTC-3′和5′-AATCATAAGTGT TCCAGAC-3′。
二、方法
1.基因组DNA和绒毛组织DNA：采用常规酚：氯仿：异戊醇抽提。
, 百拇医药
2.PCR扩增：25 μl体系中含2.5 mmol/L dNTP 1 μl,每个引物82.5 ng,Taq酶1-1.5 U,模板DNA 0.3～0.5 μg。扩增条件：95℃变性5分钟后,94℃30秒，53℃ 30秒，70℃ 1分钟。循环30次,最后70℃延伸10分钟。扩增产物经2%的琼脂糖电泳检测，以鉴定扩增效果。
3.扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP)分析：取1～2 μl上述扩增产物(视扩增效率而定)，加电泳加样液(含95%甲酰胺及0.05%溴酚蓝，二甲苯蓝等。)3μl, 98℃变性10分钟，冰浴骤冷，进行6%聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol/L尿素)电泳分离,恒压600 V，预电泳1小时, 加样后电泳1.2～1.5小时，用银染色法显示扩增DNA区带，具体步骤为：10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定凝胶6分钟2次，0.2%硝酸银溶液染10～15分钟(新鲜试剂只需3～5分钟)，蒸馏水充分漂洗凝胶数次，1.5%氢氧化钠,0.4%甲醛溶液显色至适度，蒸馏水终止显色。电泳时，以PBR322/MSPI酶解质粒DNA片段作为扩增片段长度的参考标准(加样前同法变性成单链)。实验结果干胶保存并照相[4]。
, 百拇医药
4.位点多态性信息量(polymorphism information- contents,PIC)按以下公式计算：
结 果
一、(TCTA)n多态性基因诊断率
分析云南籍13个PKU家系52条染色体检出225～252 bp 8种等位片段。其中以240 bp和244bp频率最高(表1)，PIC是0.698，杂合频率为51%。13个家系中有6个家系具有100%可诊断率，6个家系具有50%可诊断率，1个家系因双亲带型呈纯合型而不能诊断，本组可诊断率为69%。
二、(TCTA)n STR连锁分析在PKU产前诊断中的应用
家系1作产前诊断,风险胎儿10周,先证者(胎儿之姐)为PKU患者。按上述方法分析胎儿之父、母、先证者、风险胎儿的STR多态性。他们的STR位点检测如下：父有2条长度不等的等位片段分别为244 bp和240 bp；母为2条长度均为240 bp的等位片段；先证者STR位点的2条等位片段长度均为240bp，与母亲的相似，但本质是不同的，显然先证者的这两条等位片段都与致病基因连锁，而且分别来自父的240 bp的等位片段和母的240 bp等位片段。这样可区分出父的240 bp等位片段是与致病基因相连锁而另一条244 bp的等位片段则与正常基因连锁。风险胎儿的STR位点的2条等位片段长度与其父的完全相同，即既有与致病基因连锁的240 bp扩增等位片段,又有与正常基因连锁的244 bp片段，所以与其父一样是PKU基因携带者,无临床症状,可娩出。通过此产前诊断，作出了明确的诊断。
, 百拇医药
表1 13个PKU家系(TCTA)nSTR位点的多态性 等位基因
片断长度(bp)
染色体数
频率
1
224
3
0.058
2
228
2
0.038
3
, http://www.100md.com
232
5
0.096
4
236
3
0.058
5
240
20
0.385
6
244
, http://www.100md.com 16
0.308
7
248
2
0.038
8
252
1
0.019
合计
52
1
家系2为一回顾性基因诊断。已知先证者为PKU，其弟是PKU基因携带者,其父、母、先证者及其弟的STR位点分别如下：父有长度为240 bp和236 bp的两条STR等位片段，母有240 bp和232 bp两条STR等位片段，先证者的STR等位片段长度为240 bp和232 bp，分别来自父亲和母亲的致病基因。这样即可确定出父的240 bp等位片段和母的232 bp等位片段分别均与致病基因相连锁，而父的236 bp和母的240 bp等位片段则与正常基因连锁。先证者之弟的STR位点等片段的长度均为240 bp，分别来自于父的240 bp等位片段(与致病基因相连锁)和母的240 bp片段(与正常基因相连锁)，故而是PKU基因携带者，与实际情况相吻合。
, 百拇医药
家系3亦为一回顾性基因诊断，已知先证者之妹亦为PKU患者。STR连锁分析表明，其父有长度均为232 bp的2条等位片段,母有长度为232 bp和238 bp的2条等位片段,先证者有长度均为232 bp的STR位点等片段。从而可知母的232 bp等位片段是与致病基因连锁，而238 bp等位片段则与正常基因连锁。而父的232 bp等位片段的其中一条与致病基因连锁，另一条则与正常基因连锁,由于片段长度相同表现为一条电泳区带,无法区别开，故先证者的同胞的STR位点等位片段为纯合型的232 bp时，可以是PKU基因携带者也可以是PKU患者。因此无法作明确的诊断，需要配合其他的分析。该家系的实际情况是先证者之妹为PKU患者。
讨 论
(TATC)n四核苷酸STR位于PAH基因内含子3的5′端700 bp处。具有高度的多态性、很多的等位片段和较高的信息量。白种人群中存在228～260 bp的9种等位片段，PIC是0.80[5]，我国北方PKU家系中有224～256 bp的9种片段，其PIC是0.680～0.730[4，6]。云南人群中则分布有224～252 bp的8种等位片段,未检出256 bp的等位片段,PIC为0.698。与我国北方人群的结果相似。由于STR有很高的信息量,是非常有用的遗传标志。利用与PKU致病基因紧密连锁的(TCTA)n的STR进行连锁分析，证明对PKU基因诊断的成功率较高。它的优点还在于不须知道基因的DNA序列或突变的位置与性质，所以是一种间接基因诊断法，检测方法简单易行，不需任何基因探针，不需酶解基因组DNA或印迹转移，就能得出结果。它经济快速，在诊断明确的经典型PKU家析分析中是目前最好的首选的方法。但是正如我们在家系3的分析中看到的那样，不管在北方人群还是云南地区检出的STR等位片段多态性信息量约为0.70左右，对待诊者不能百分之百地都作出明确诊断。因此除了以STR连锁分析法为主要和首选诊断途径以外，还需结合其他的方法，如应用PCR-SSCP方法直接检测PAH基因常见的突变位点(直接基因诊断)，制定出适合该地区的快速有效的产前诊断方案，使PKU的产前诊断更臻于完善。
, http://www.100md.com
志谢 本研究得到北京中国遗传医学中心黄尚志、袁丽芳等老师的帮助
本课题由云南省应用基础研究基金资助(基金项目编号：95CO69M)
参考文献
1 11省市苯丙酮尿症筛查协作组.我国11省市苯丙酮尿症新生儿筛查.中华儿科杂志，1985,23:321-323.
2 Brian C, Paul S,Wolfgang S.The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature,1994, 371:215-220.
3 Golfsov AA, Eisensmith RC, Naughtan ER, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993,2:577-581.
, 百拇医药
4 黄尚志,方柄良，初海鹰,等.苯丙氨酸羟化酶基因内短串联重复序列多态性的分析及应用.中华医学杂志，1995，75：22-24.
5 Eisensmith RC, Goltsov AA, Woo SL. A simple rapid highly informative PCR-based procedure for prenatal diagnosis and carrier screening of phenylketonuria. Prenat Diagn (ENGLAND)，1994，14：1113-1118.
6 宋,吴冠芸，徐光芝.联合应用STR连锁分析与多重等位基因特异PCR进行PKU基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14:9-12.
(收稿：1998-03-04 修回：1998-11-09), 百拇医药