全反式维甲酸对抗肿瘤药物促进HL-60细胞凋亡作用的影响
作者：卢新天 郑玉花 于载泺 郭在晨 马瑞英
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：脱噬作用；细胞分化；抗肿瘤药；HL-60细胞；维甲酸
中华儿科杂志990501 【摘要】 目的 观察诱导分化剂对抗肿瘤药物促进HL-60细胞凋亡的影响。方法 采用苏木精染色、流式细胞仪及DNA电泳的方法，研究全反式维甲酸(ATRA)分别与阿糖胞苷、长春新碱、鬼臼乙叉甙、柔红霉素4种抗肿瘤药协同作用后HL-60细胞凋亡的发生情况。结果 当先以ATRA作用HL-60细胞3天后再分别给予抗肿瘤药物，发现各个药物引起的凋亡细胞的数量减少60%以上。反之，先以抗肿瘤药作用后再以ATRA处理HL-60细胞，各个药物可使凋亡细胞的数量增加15%以上。结论 ATRA对某些抗肿瘤药的促HL-60细胞凋亡作用可能有一定影响。
The effect of all-trans-retinoic acid (ATRA) on the response of HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs LU Xintian, ZHENG Yuhua, YU Zaile, et al. Department of Pediatrics, First Hospital of Bejing Medical University, Beijing 100034
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To observe the effects of differentiating drugs on the response of HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs. Methods The responses of HL-60 cells to apoptosis induced by Ara-C, VCR, VP-16 and DNR in combined with ATRA were studied by detection of apoptotic cells, and hematoxylin staining, flow cytometry and DNA electrophoresis were used to assay apoptosis. Results The number of apoptotic cells decreased by over 60% with administration of ATRA three days before treating HL-60 cells with four antitumor drugs respectively, while the apoptosis increased by over 15% with administration of drugs in reverse sequence. Conclusion The results of this study suggest that ATRA might probably affect the susceptibility to apoptosis of HL-60 cells induced by Ara-C, VCR, VP-16 and DNR.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis Cell differentiation Antineoplastic agents HL-60 cells Tretinoin
已经证实，一些抗肿瘤药物通过促进细胞凋亡而达到其治疗作用[1]。全反式维甲酸(ATRA)可以诱导HL-60细胞分化成熟，在这一过程中伴有细胞凋亡现象出现[2]。为了解分化诱导剂与凋亡促进剂的协同作用对肿瘤细胞凋亡反应性有何影响，我们以全反式维甲酸作为分化诱导剂，以常用的4种抗肿瘤药阿糖胞苷(Ara-C)、长春新碱(VCR)、鬼臼乙叉甙(VP-16)和柔红霉素(DNR)作为凋亡促进剂，对HL-60细胞作了初步观察，报告如下。
材料及方法
一、制剂
全反式维甲酸系重庆第六制药厂产品，以无水乙醇配制成0.01 mol/L贮存液。Ara-C，北京医科大学实验药厂生产；VCR，广州明兴制药厂产品；VP-16，北京制药工业研究所实验药厂产品；DNR，意大利爱宝大药厂出品。以上药物均用生理盐水配制成贮存液。
, 百拇医药
二、细胞培养
HL-60细胞由北京师范大学生物系提供。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃，5%CO2条件下培养，定期换液及调整细胞浓度。实验前采用锥虫蓝染色测定活细胞数，活细胞超过95%可用于实验，细胞密度调至5×105/ml备用。本实验每次每组设置2孔，相同实验条件下进行3次实验，结果取均值。
三、细胞分化检测
1.瑞氏-姬姆萨(R-G)混合染色：观察细胞形态，分类200个细胞；
2.硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验：计数200个细胞，计算阳性细胞百分比。
四、细胞凋亡检测
1.苏木精染色：细胞经药物作用后，将细胞悬液制成涂片，室温干燥后甲醛固定5分钟，苏木精染液染1分钟，以含1%盐酸的80%乙醇液分化1～3秒钟，最后观察细胞形态，计数200个细胞，计算凋亡细胞百分比[1]。
, http://www.100md.com
2.流式细胞仪检测：细胞经PBS洗涤，无水乙醇、4℃固定12小时以上，用前离心弃去乙醇，细胞置PBS中，加入终浓度为100 μg/ml的RNA酶，孵育30分钟，碘化丙啶(PI)染色，1小时内用流式细胞仪检测不同DNA含量的细胞分布，每份标本至少检测104个细胞。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳：细胞经PBS洗涤后，加细胞裂解液100 μl ；再加入RNA酶，终浓度为200 μg/ml，37℃水浴1小时；加入蛋白酶K，终浓度300 μg/ml，37℃过夜；加入1/2体积的5 mol/L NaCl，形成白色沉淀，离心后吸取上清液置另一管内;加入1/10体积3 mol/L醋酸钠，2倍体积冷无水乙醇，-20℃；离心弃上清，70%乙醇洗涤，待乙醇挥发殆尽，加20 μl的TE(Tris-盐酸、EDTA溶液，pH 8.0)放置1小时以上;取10 μl样品，2 μl上样液，1.8%琼脂糖凝胶电泳3～4小时，电压2 V/cm，紫外灯下观测结果[1]。
, 百拇医药
五、统计学方法
数据以平均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。
结 果
一、ATRA单独诱导HL-60细胞分化及凋亡的作用
以10-6 mol/L的ATRA处理HL-60细胞，ATRA作用2天，NBT试验阳性率开始升高；作用5天，阳性率达75%左右。当ATRA作用6天后，约90%细胞分化成熟。ATRA作用3天后凋亡细胞的数量与对照组相比差异有显著意义(图1)。这时DNA琼脂糖凝胶电泳尚无梯状条带(Ladder)出现，第5天以后DNA电泳出现典型的Ladder。流式细胞仪检测显示出反应凋亡特征的Sub-G1峰。
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图1 ATRA作用HL-60细胞不同时间
细胞分化与细胞凋亡情况
二、ATRA预先作用对抗肿瘤药诱导HL-60细胞凋亡的影响
HL-60细胞预先经10-6 mol/L的ATRA作用2天或3天后，然后分别以一定浓度的Ara-C、VCR、VP-16及DNR作用4小时。表1显示各药物作用后凋亡细胞百分比的变化，其中0天，指细胞只经抗肿瘤药作用而没有经ATRA作用。ATRA预先作用2天，再经Ara-C、VP-16、DNR作用的细胞凋亡反应下降明显，但经VCR作用的细胞无明显变化。ATRA预先作用HL-60细胞3天后，细胞对4种药物的促细胞凋亡反应较0天组下降60%以上，DNA电泳已无ladder出现，4种药物显示了一致的结果，这种凋亡反应性的减弱作用以ATRA预先作用3天更明显。图1显示ATRA单独作用HL-60细胞引起凋亡最多约为30%(7天时)。ATRA作用3天后加用抗肿瘤药作用后的凋亡细胞数(表1)低于ATRA的单独作用。
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表1 ATRA预先作用HL-60细胞不同时间对药物致细胞凋亡作用的影响(%) ATRA
作用
时间(d)
苏木精染色(±s)
流式细胞仪
Ara-C
(10μg/ml)
VCR
(0.1μg/ml)
VP-16
, http://www.100md.com (1μg/ml)
DNR
(0.1μg/ml)
Ara-C
(10μg/ml)
VCR
(0.1μg/ml)
VP-16
(1μg/ml)
DNR
(0.1μg/ml)
0
, 百拇医药 50.3±10.7
42.3±1.2
57.0±6.6
48±6
37.5
39.4
34.2
40.8
2
27.7±4.2*
41.3±7.0
29.3±2.1*
, http://www.100md.com
37±4*
27.8
30.3
31.2
31.2
3
20.0±5.3*
16.0±3.6*
20.7±6.5*
20±7*
18.1
, http://www.100md.com
12.7
21.6
33.3
注：与对照组(0)比较，*P<0.05；DNA电泳0、2天均(+)，即ladder形成，3天均(-)
三、抗肿瘤药作用后再经ATRA处理的HL-60细胞凋亡发生情况
以4种抗肿瘤药分别作用HL-60细胞4小时，然后洗去药物，再与10-6 mol/L的ATRA共同孵育24小时，对照组不加ATRA继续孵育24小时。结果显示4种抗肿瘤药对HL-60细胞的诱导凋亡作用被随后应用的ATRA增强了，凋亡细胞数增加15%以上，且两者间差异有显著意义。流式细胞仪测定亦显示与形态学一致的结果(表2)。
表2 抗肿瘤药作用HL-60细胞4小时后加用
, 百拇医药
ATRA对细胞凋亡作用的影响(%) 药物(作用浓度)
苏木精染色(±s)
流式细胞仪
对照组
ATRA组
对照组
ATRA组
Ara-C(10 μg/ml)
80.0±4.0
92.3±3.2*
, 百拇医药
83.2
98.3
VCR(0.1 μg/ml)
67.0±4.4
94.3±2.1*
70.2
89.3
VP-16(1 μg/ml)
74.7±5.9
92.3±3.2*
76.4
, http://www.100md.com 92.5
DNR(0.1 μg/ml)
68.3±8.0
95.0±1.0*
76.2
98.6
注：两组比较，*P<0.05，DNA电泳均(+)
讨 论
本研究在ATRA诱导HL-60细胞分化成熟的同时对细胞凋亡的发生作了相应的观察，发现随分化成熟细胞的增加，凋亡细胞的数量也在增加。对此现象的一种解释是分化成熟的细胞属终末细胞，其死亡是按调控程序进行的“自然过程”。Martin等[2]及Solary[3]的观察结果与本研究所见基本一致。但采用不同分化剂(如二亚基亚砜)对HL-60细胞或其他白血病细胞系的观察发现，细胞分化的过程中没有细胞凋亡现象发生[2,4]。因而对细胞分化剂诱导细胞分化过程中伴随的凋亡现象还有待更多的观察和研究。
, http://www.100md.com
本实验室以往的工作已证实Ara-C、VCR、VP-16及DNR 4种抗肿瘤药在一定剂量范围及一定作用时间内对HL-60细胞有凋亡促进作用[1]。在此基础上，本研究先以ATRA作用HL-60细胞，随后又用4种药物作用，观察到细胞对药物促进凋亡的反应性明显下降，ATRA作用3天组的凋亡数量均降低60%以上。从本研究可以看到HL-60细胞在ATRA的作用下，第2天开始分化，随作用时间延长分化渐趋明显，提示HL-60细胞对抗肿瘤药促进凋亡的反应性下降可能与细胞分化有关。为进一步证实这一结果，延长作用时间，仍得出基本相同的结果。ATRA单独作用HL-60细胞引起凋亡最多约为30%(7天时，图1)，ATRA作用3天后加用抗肿瘤药作用后的凋亡细胞数(表1)低于ATRA单独作用的细胞凋亡数。提示ATRA作用3天后的HL-60细胞可能对抗肿瘤药的促凋亡作用没有反应。有作者据此提出细胞凋亡与细胞分化可能是循着两条不同的途径进行的。细胞一旦选择并开始某一途径就一直进行下去直至完成，并拒绝另一种选择。因此认为可能的原因是在ATRA启动HL-60细胞的分化程序后就对凋亡的触发有了一定的抵抗性[4,5]。
, 百拇医药
当改变给药顺序时则得到了相反的结果。以抗肿瘤药预先处理HL-60细胞，然后加 ATRA孵育细胞，发现ATRA作用后凋亡细胞的数量比没有加ATRA的细胞数增加了。提示抗肿瘤药诱导HL-60细胞的凋亡作用可被其后应用的分化诱导剂增强。Bhatia等[6]在得到这一研究结果后认为，增殖细胞与分化中的细胞在DNA被损伤检测及细胞凋亡的触发过程等方面存在差别。细胞在分化过程中开始逐渐合成一些凋亡所需要的因子为其死亡进行准备。并提出，HL-60细胞预先经促凋亡药物处理后，DNA损伤可导致细胞凋亡的发生，这时再给予分化剂处理，细胞的分化机制可促使细胞合成凋亡过程中所需要的效应因子，加快了正在发生的细胞凋亡的进程。这一现象提出了一种可能性，就是用较少剂量的抗肿瘤药联合分化诱导剂可能会达到较大的促凋亡作用，从而达到既减少药物毒副作用又增加疗效的目的。
参考文献
1 赵卫红，于载泺，叶奇鲁，等. 四种化疗药物诱导正常骨髓及白血病细胞株凋亡作用的比较.中华儿科杂志，1998，36：95-97.
, http://www.100md.com
2 Martin SJ, Bradley JG, Cotter TG. HL-60 cells induced to differentiate toward neutrophils subsequently die via apoptosis. Clin Exp Immune, 1990, 79:448-453.
3 Solary E. Apoptosis of human leukemic HL-60 cells induced to differentiated by phobal ester treatment. Leukemia, 1994, 8: 792-797.
4 Bruel A, Benoit G, Nay D De, et al. Distinct apoptosis responses in maturation sensitive and resistant t(15;17) acute promyelocytic leukemia NB4 cells.9-cis retinoic acid induces apoptosis independent of maturation and bcl-2 expression. Leukemia, 1995, 9: 1173-1184.
, 百拇医药
5 Naumovski L, Cleary ML, Michael L. Bcl-2 inhibits apoptosis associated with terminal differentiation of HL-60 myeloid leukemia cells. Blood, 1994, 83: 2261-2267.
6 Bhatia U, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Induction of cell differentiation potentiates apptosis triggered by prior exposure to DNA-damaging drugs. Cell Growth Differen, 1995, 6: 937-944.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-07-27), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：脱噬作用；细胞分化；抗肿瘤药；HL-60细胞；维甲酸
中华儿科杂志990501 【摘要】 目的 观察诱导分化剂对抗肿瘤药物促进HL-60细胞凋亡的影响。方法 采用苏木精染色、流式细胞仪及DNA电泳的方法，研究全反式维甲酸(ATRA)分别与阿糖胞苷、长春新碱、鬼臼乙叉甙、柔红霉素4种抗肿瘤药协同作用后HL-60细胞凋亡的发生情况。结果 当先以ATRA作用HL-60细胞3天后再分别给予抗肿瘤药物，发现各个药物引起的凋亡细胞的数量减少60%以上。反之，先以抗肿瘤药作用后再以ATRA处理HL-60细胞，各个药物可使凋亡细胞的数量增加15%以上。结论 ATRA对某些抗肿瘤药的促HL-60细胞凋亡作用可能有一定影响。
The effect of all-trans-retinoic acid (ATRA) on the response of HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs LU Xintian, ZHENG Yuhua, YU Zaile, et al. Department of Pediatrics, First Hospital of Bejing Medical University, Beijing 100034
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【Abstract】 Objective To observe the effects of differentiating drugs on the response of HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs. Methods The responses of HL-60 cells to apoptosis induced by Ara-C, VCR, VP-16 and DNR in combined with ATRA were studied by detection of apoptotic cells, and hematoxylin staining, flow cytometry and DNA electrophoresis were used to assay apoptosis. Results The number of apoptotic cells decreased by over 60% with administration of ATRA three days before treating HL-60 cells with four antitumor drugs respectively, while the apoptosis increased by over 15% with administration of drugs in reverse sequence. Conclusion The results of this study suggest that ATRA might probably affect the susceptibility to apoptosis of HL-60 cells induced by Ara-C, VCR, VP-16 and DNR.
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【Key words】 Apoptosis Cell differentiation Antineoplastic agents HL-60 cells Tretinoin
已经证实，一些抗肿瘤药物通过促进细胞凋亡而达到其治疗作用[1]。全反式维甲酸(ATRA)可以诱导HL-60细胞分化成熟，在这一过程中伴有细胞凋亡现象出现[2]。为了解分化诱导剂与凋亡促进剂的协同作用对肿瘤细胞凋亡反应性有何影响，我们以全反式维甲酸作为分化诱导剂，以常用的4种抗肿瘤药阿糖胞苷(Ara-C)、长春新碱(VCR)、鬼臼乙叉甙(VP-16)和柔红霉素(DNR)作为凋亡促进剂，对HL-60细胞作了初步观察，报告如下。
材料及方法
一、制剂
全反式维甲酸系重庆第六制药厂产品，以无水乙醇配制成0.01 mol/L贮存液。Ara-C，北京医科大学实验药厂生产；VCR，广州明兴制药厂产品；VP-16，北京制药工业研究所实验药厂产品；DNR，意大利爱宝大药厂出品。以上药物均用生理盐水配制成贮存液。
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二、细胞培养
HL-60细胞由北京师范大学生物系提供。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃，5%CO2条件下培养，定期换液及调整细胞浓度。实验前采用锥虫蓝染色测定活细胞数，活细胞超过95%可用于实验，细胞密度调至5×105/ml备用。本实验每次每组设置2孔，相同实验条件下进行3次实验，结果取均值。
三、细胞分化检测
1.瑞氏-姬姆萨(R-G)混合染色：观察细胞形态，分类200个细胞；
2.硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验：计数200个细胞，计算阳性细胞百分比。
四、细胞凋亡检测
1.苏木精染色：细胞经药物作用后，将细胞悬液制成涂片，室温干燥后甲醛固定5分钟，苏木精染液染1分钟，以含1%盐酸的80%乙醇液分化1～3秒钟，最后观察细胞形态，计数200个细胞，计算凋亡细胞百分比[1]。
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2.流式细胞仪检测：细胞经PBS洗涤，无水乙醇、4℃固定12小时以上，用前离心弃去乙醇，细胞置PBS中，加入终浓度为100 μg/ml的RNA酶，孵育30分钟，碘化丙啶(PI)染色，1小时内用流式细胞仪检测不同DNA含量的细胞分布，每份标本至少检测104个细胞。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳：细胞经PBS洗涤后，加细胞裂解液100 μl ；再加入RNA酶，终浓度为200 μg/ml，37℃水浴1小时；加入蛋白酶K，终浓度300 μg/ml，37℃过夜；加入1/2体积的5 mol/L NaCl，形成白色沉淀，离心后吸取上清液置另一管内;加入1/10体积3 mol/L醋酸钠，2倍体积冷无水乙醇，-20℃；离心弃上清，70%乙醇洗涤，待乙醇挥发殆尽，加20 μl的TE(Tris-盐酸、EDTA溶液，pH 8.0)放置1小时以上;取10 μl样品，2 μl上样液，1.8%琼脂糖凝胶电泳3～4小时，电压2 V/cm，紫外灯下观测结果[1]。
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五、统计学方法
数据以平均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。结 果
一、ATRA单独诱导HL-60细胞分化及凋亡的作用
以10-6 mol/L的ATRA处理HL-60细胞，ATRA作用2天，NBT试验阳性率开始升高；作用5天，阳性率达75%左右。当ATRA作用6天后，约90%细胞分化成熟。ATRA作用3天后凋亡细胞的数量与对照组相比差异有显著意义(图1)。这时DNA琼脂糖凝胶电泳尚无梯状条带(Ladder)出现，第5天以后DNA电泳出现典型的Ladder。流式细胞仪检测显示出反应凋亡特征的Sub-G1峰。
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图1 ATRA作用HL-60细胞不同时间
细胞分化与细胞凋亡情况
二、ATRA预先作用对抗肿瘤药诱导HL-60细胞凋亡的影响
HL-60细胞预先经10-6 mol/L的ATRA作用2天或3天后，然后分别以一定浓度的Ara-C、VCR、VP-16及DNR作用4小时。表1显示各药物作用后凋亡细胞百分比的变化，其中0天，指细胞只经抗肿瘤药作用而没有经ATRA作用。ATRA预先作用2天，再经Ara-C、VP-16、DNR作用的细胞凋亡反应下降明显，但经VCR作用的细胞无明显变化。ATRA预先作用HL-60细胞3天后，细胞对4种药物的促细胞凋亡反应较0天组下降60%以上，DNA电泳已无ladder出现，4种药物显示了一致的结果，这种凋亡反应性的减弱作用以ATRA预先作用3天更明显。图1显示ATRA单独作用HL-60细胞引起凋亡最多约为30%(7天时)。ATRA作用3天后加用抗肿瘤药作用后的凋亡细胞数(表1)低于ATRA的单独作用。
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表1 ATRA预先作用HL-60细胞不同时间对药物致细胞凋亡作用的影响(%) ATRA
作用
时间(d)
苏木精染色(
±s)流式细胞仪
Ara-C
(10μg/ml)
VCR
(0.1μg/ml)
VP-16
, http://www.100md.com (1μg/ml)
DNR
(0.1μg/ml)
Ara-C
(10μg/ml)
VCR
(0.1μg/ml)
VP-16
(1μg/ml)
DNR
(0.1μg/ml)
0
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42.3±1.2
57.0±6.6
48±6
37.5
39.4
34.2
40.8
2
27.7±4.2*
41.3±7.0
29.3±2.1*
, http://www.100md.com
37±4*
27.8
30.3
31.2
31.2
3
20.0±5.3*
16.0±3.6*
20.7±6.5*
20±7*
18.1
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12.7
21.6
33.3
注：与对照组(0)比较，*P<0.05；DNA电泳0、2天均(+)，即ladder形成，3天均(-)
三、抗肿瘤药作用后再经ATRA处理的HL-60细胞凋亡发生情况
以4种抗肿瘤药分别作用HL-60细胞4小时，然后洗去药物，再与10-6 mol/L的ATRA共同孵育24小时，对照组不加ATRA继续孵育24小时。结果显示4种抗肿瘤药对HL-60细胞的诱导凋亡作用被随后应用的ATRA增强了，凋亡细胞数增加15%以上，且两者间差异有显著意义。流式细胞仪测定亦显示与形态学一致的结果(表2)。
表2 抗肿瘤药作用HL-60细胞4小时后加用
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ATRA对细胞凋亡作用的影响(%) 药物(作用浓度)
苏木精染色(
±s)流式细胞仪
对照组
ATRA组
对照组
ATRA组
Ara-C(10 μg/ml)
80.0±4.0
92.3±3.2*
, 百拇医药
83.2
98.3
VCR(0.1 μg/ml)
67.0±4.4
94.3±2.1*
70.2
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VP-16(1 μg/ml)
74.7±5.9
92.3±3.2*
76.4
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DNR(0.1 μg/ml)
68.3±8.0
95.0±1.0*
76.2
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注：两组比较，*P<0.05，DNA电泳均(+)
讨 论
本研究在ATRA诱导HL-60细胞分化成熟的同时对细胞凋亡的发生作了相应的观察，发现随分化成熟细胞的增加，凋亡细胞的数量也在增加。对此现象的一种解释是分化成熟的细胞属终末细胞，其死亡是按调控程序进行的“自然过程”。Martin等[2]及Solary[3]的观察结果与本研究所见基本一致。但采用不同分化剂(如二亚基亚砜)对HL-60细胞或其他白血病细胞系的观察发现，细胞分化的过程中没有细胞凋亡现象发生[2,4]。因而对细胞分化剂诱导细胞分化过程中伴随的凋亡现象还有待更多的观察和研究。
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本实验室以往的工作已证实Ara-C、VCR、VP-16及DNR 4种抗肿瘤药在一定剂量范围及一定作用时间内对HL-60细胞有凋亡促进作用[1]。在此基础上，本研究先以ATRA作用HL-60细胞，随后又用4种药物作用，观察到细胞对药物促进凋亡的反应性明显下降，ATRA作用3天组的凋亡数量均降低60%以上。从本研究可以看到HL-60细胞在ATRA的作用下，第2天开始分化，随作用时间延长分化渐趋明显，提示HL-60细胞对抗肿瘤药促进凋亡的反应性下降可能与细胞分化有关。为进一步证实这一结果，延长作用时间，仍得出基本相同的结果。ATRA单独作用HL-60细胞引起凋亡最多约为30%(7天时，图1)，ATRA作用3天后加用抗肿瘤药作用后的凋亡细胞数(表1)低于ATRA单独作用的细胞凋亡数。提示ATRA作用3天后的HL-60细胞可能对抗肿瘤药的促凋亡作用没有反应。有作者据此提出细胞凋亡与细胞分化可能是循着两条不同的途径进行的。细胞一旦选择并开始某一途径就一直进行下去直至完成，并拒绝另一种选择。因此认为可能的原因是在ATRA启动HL-60细胞的分化程序后就对凋亡的触发有了一定的抵抗性[4,5]。
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当改变给药顺序时则得到了相反的结果。以抗肿瘤药预先处理HL-60细胞，然后加 ATRA孵育细胞，发现ATRA作用后凋亡细胞的数量比没有加ATRA的细胞数增加了。提示抗肿瘤药诱导HL-60细胞的凋亡作用可被其后应用的分化诱导剂增强。Bhatia等[6]在得到这一研究结果后认为，增殖细胞与分化中的细胞在DNA被损伤检测及细胞凋亡的触发过程等方面存在差别。细胞在分化过程中开始逐渐合成一些凋亡所需要的因子为其死亡进行准备。并提出，HL-60细胞预先经促凋亡药物处理后，DNA损伤可导致细胞凋亡的发生，这时再给予分化剂处理，细胞的分化机制可促使细胞合成凋亡过程中所需要的效应因子，加快了正在发生的细胞凋亡的进程。这一现象提出了一种可能性，就是用较少剂量的抗肿瘤药联合分化诱导剂可能会达到较大的促凋亡作用，从而达到既减少药物毒副作用又增加疗效的目的。
参考文献
1 赵卫红，于载泺，叶奇鲁，等. 四种化疗药物诱导正常骨髓及白血病细胞株凋亡作用的比较.中华儿科杂志，1998，36：95-97.
, http://www.100md.com
2 Martin SJ, Bradley JG, Cotter TG. HL-60 cells induced to differentiate toward neutrophils subsequently die via apoptosis. Clin Exp Immune, 1990, 79:448-453.
3 Solary E. Apoptosis of human leukemic HL-60 cells induced to differentiated by phobal ester treatment. Leukemia, 1994, 8: 792-797.
4 Bruel A, Benoit G, Nay D De, et al. Distinct apoptosis responses in maturation sensitive and resistant t(15;17) acute promyelocytic leukemia NB4 cells.9-cis retinoic acid induces apoptosis independent of maturation and bcl-2 expression. Leukemia, 1995, 9: 1173-1184.
, 百拇医药
5 Naumovski L, Cleary ML, Michael L. Bcl-2 inhibits apoptosis associated with terminal differentiation of HL-60 myeloid leukemia cells. Blood, 1994, 83: 2261-2267.
6 Bhatia U, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Induction of cell differentiation potentiates apptosis triggered by prior exposure to DNA-damaging drugs. Cell Growth Differen, 1995, 6: 937-944.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-07-27), http://www.100md.com