热应激反应对大鼠感染性脑水肿保护作用的研究
作者：黄榕 杨于嘉 虞佩兰 陶永光
单位：410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990623 急性感染性脑水肿占儿内科临床各种致脑水肿原发病的70%～90%。小儿脑水肿的病死率在20%左右。如何调动机体的内源性抗损伤机制，提高细胞对致病因子的抵抗能力来防治疾病,已成为当前疾病防治研究的新领域。热应激反应(heat stress response, HSR)是机体的内源性抗损伤机制之一。高热、细菌毒素、缺氧、缺血、组织损伤等亚致死量的刺激可诱导机体细胞产生热应激反应。已证明热应激反应对大鼠的缺血性脑损伤[1]、心脏缺血-再灌流损伤、油酸肺损伤及败血症所致的肺和肝组织的损伤均有保护作用，本文将对热应激反应对大鼠的感染性脑水肿的保护作用进行探讨。
材料：1.成年健康雄性S D大鼠，体重209±30 g, 由本院动物室提供,符合二级实验动物标准。
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2.主要试剂及仪器：百日咳菌液(PB)含菌量980亿/ml，由北京生物制品研究所提供；精制大肠杆菌内毒素(O127∶B8)购自Sigma公司；伊文思蓝购自Baker.化学公司；电子天平(精度1/10万)由德国Gottingen生产；电热恒温干燥箱：PH030型，上海实验仪器厂；原子吸收光谱仪：AA-6809，日本；透射电镜: HITACH,H-600,日本。
方法：1.分组及预处理：SD大鼠68只，设正常对照组8只，余60只随机分为4组，部分动物在未到处死时间前死亡。(1)正常对照组：不作预处理，置室温24小时后向左颈内动脉注入生理盐水；(2)感染性脑水肿组(10只)：不作预处理，置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液；(3)生理盐水预处理组(10只)：腹腔注射灭菌生理盐水0.25 ml/kg，置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液；(4)热休克预处理组(11只)：使大鼠肛温升至42℃,维持15分钟，置室温恢复24小时后，向左颈内动脉注入百日咳菌液；(5)内毒素预处理组(13只)：腹腔注射精制大肠杆菌内毒素500 μg/kg(0.25 ml/kg)。置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液。
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2.感染性脑水肿动物模型的制备：大鼠用25%乌拉坦麻醉后，分离左侧颈总动脉分别结扎其颅外分支，向左颈内动脉注入百日咳菌液0.2 ml/kg(菌液使用前充分超声震荡粉碎凝块)。正常对照组则注射灭菌生理盐水0.2 ml/kg。注菌或生理盐水后半小时内从阴茎背静脉注入2%伊文思蓝2 ml/kg。注菌或注生理盐水后观察4小时断头处死。
3.检测指标：(1)脑含水量测定：采用干湿法进行,按Elliott公式计算；(2)脑组织伊文思蓝含量测定：采用甲酰胺定量法进行；(3)脑组织钠钾测定：用原子吸收光谱法测定干脑组织中钠、钾离子含量；(4)电镜标本制备与观察：实验动物经腹主动脉注入多聚甲醛-戊二醛固定液进行前固定, 从左侧海马CA1区及大脑皮层分别切取约1 mm×1 mm×0.5 mm大小的组织块，放入同样固定液中固定2小时，经电镜制样，切片定位后,透视电镜观察及摄相。
4.统计学处理:数据均采用SPSS软件计算，计量资料用
表示，组间比较用F检验，相关分析采用直线回归。
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表1 注菌或盐水侧脑组织含水量、伊文思蓝含量及离子测定() 分组
含水量
(%)
伊文思蓝含量
(μg/g)
钠离子含量
(mmol/kg)
钾离子含量
(mmol/kg)
正常对照组
78.89±0.16
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1.50±0.17
192.9±2.9
459.5±3.0
感染性脑水肿组
81.20±0.28
3.68±0.36
279.6±9.1
360.9±9.2
生理盐水预处理组
80.82±0.42
3.68±0.30
272.9±8.8
, 百拇医药
361.4±10.0
热休克预处理组
79.55±0.23
2.38±0.28
200.7±5.5
393.7±19.8
内毒素预处理组
79.38±0.17
2.70±0.16
210.1±11.7
404.7±11.3
F值
, 百拇医药
12.84
7.71
20.45
2.35
P值
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
结果：1.脑含水量(%)：表1中各组脑含水量比较显示，感染性脑水肿组和生理盐水预处理组含水量明显高于正常对照组，差异有非常显著意义；热休克预处理组和内毒素预处理组含水量较感染性脑水肿组明显降低，差异有显著意义；内毒素预处理组含水量较生理盐水预处理组明显降低，差异有非常显著意义，而与正常对照组比较，二者差异无显著性意义(P>0.05)。
, 百拇医药
2.脑伊文思蓝含量(μg/g湿重)：表1显示，感染性脑水肿组和生理盐水预处理组与正常对照组比较伊文思蓝含量明显增高，差异有非常显著意义；热休克预处理组伊文思蓝含量明显低于感染性脑水肿组，差异有非常显著意义(P<0.001)，但高于正常对照组,差异有显著意义(P<0.05)；内毒素预处理组伊文思蓝含量较感染性脑水肿组和生理盐水预处理组显著降低，差异有显著意义(P<0.05)。脑含水量与伊文思蓝含量经直线相关分析二者有高度正相关(r=0.9228,P<0.01)。
3.脑组织钠离子、钾离子含量(mmol/kg干重)：表1中显示感染性脑水肿组和生理盐水预处理组钠离子含量明显高于正常对照组，钾离子含量明显低于正常对照组,差异有显著意义；热休克预处理组和内毒素预处理组钠离子含量明显低于感染性脑水肿组，差异有显著意义；各组钠离子含量与脑含水量的变化经直线相关分析显示呈直线正相关(r=0.9165,P<0.01)，钾离子含量的变化与钠离子含量的改变经直线相关分析显示呈直线负相关(r=-0.7738,P<0.01)。
, 百拇医药
4.电镜观察：电镜结果显示感染性脑水肿组毛细血管腔内未见栓塞,毛细血管腔内皮细胞中吞饮小泡增多，胶质细胞水肿明显，线粒体肿胀，嵴消失，神经细胞皱缩，粗面内质网扩张，线粒体肿胀，胞浆中有空泡样变。热休克预处理组毛细血管内皮细胞大致正常，部分毛细血管周围胶质细胞轻度水肿，神经细胞轻度皱缩，粗面内质网轻度扩张。内毒素预处理组部分毛细血管周围胶质细胞足突水肿，神经细胞部分线粒体肿胀，部分粗面内质网扩张，核皱缩。
讨论：根据脑水肿的病理学与形成机制分为血管源性脑水肿与细胞毒性脑水肿。本实验采用的大鼠百日咳菌液急性感染性脑水肿模型是本室建立的动物模型，属混合性脑水肿。脑含水量是反映脑水肿严重程度的重要指标。本实验感染性脑水肿组与正常对照组比较，注菌4小时后含水量明显增高，说明将百日咳菌液注入颅内引起了急性脑水肿。生理盐水预处理组脑含水量明显高于正常对照组，而与感染性脑水肿组比较差异无显著意义，说明生理盐水预处理不能使脑含水量降低。热休克预处理组和内毒素预处理组的脑含水量较感染性脑水肿组明显降低，差异有非常显著意义(P<0.01)，提示热休克预处理和内毒素预处理均可显著降低感染性脑水肿的脑含水量。
, 百拇医药
伊文思蓝能通过损伤的血脑屏障进入脑实质，使脑组织被蓝染，所以伊文思蓝常作为血脑屏障受损的指示剂。脑组织中伊文思蓝含量的多少反映了血脑屏障的损伤程度。实验结果显示，感染性脑水肿组伊文思蓝含量明显高于正常对照组，说明有血脑屏障的损伤，提示有血管源性脑水肿的存在；生理盐水预处理组与感染性脑水肿组的伊文思蓝含量比较，二者差异无显著意义(P>0.05)，说明生理盐水预处理没有减轻血脑屏障损伤的作用；经热休克预处理或内毒素预处理后，脑组织中伊文思蓝含量较感染性脑水肿组有明显降低，说明热休克预处理和内毒素预处理有保护血脑屏障的作用。另外，脑含水量和伊文思蓝含量经直线相关分析显示有高度正相关性，提示脑水肿的形成与血脑屏障受损有关。
细胞毒性脑水肿时，细胞膜上钠-钾泵失活。因此，细胞毒性脑水肿时脑组织中的钠含量增加，钾含量减少。本实验结果显示感染性脑水肿组和生理盐水预处理组钠离子含量较正常对照组显著增高，而钾离子含量明显降低，提示有钠-钾泵受损，说明该脑水肿模型有细胞毒性脑水肿存在；热休克预处理组和内毒素预处理组脑组织中钠离子含量较感染性脑水肿组明显降低，差异有显著意义(P<0.01)，且钠离子含量的改变与脑含水量的变化经直线相关分析显示呈高度正相关；钠离子含量降低与钾离子含量增高经直线相关分析显示呈高度负相关，提示热休克预处理和内毒素预处理减轻脑水肿与保护钠-钾泵有关。
, http://www.100md.com
感染性脑水肿组脑组织电镜观察显示毛细血管腔未见栓塞现象，毛细血管内皮细胞中吞饮小泡增多，毛细血管周围的胶质细胞足突水肿明显，线粒体肿胀，嵴消失。经热休克预处理或内毒素预处理后，电镜观察示脑水肿减轻，进一步证实热休克预处理和内毒素预处理可减轻百日咳菌液引起的急性脑水肿。近年来，通过提高机体细胞自身抗损伤的能力来对抗疾病这一观点，逐渐引起人们的重视。实验证明热应激反应是细胞对环境因素改变所产生的保护性反应,在这种反应过程中，细胞合成热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)，并认为热应激反应的保护作用与热休克蛋白的产生有关[2]。本实验的结果提示热休克预处理和内毒素预处理所诱导的热应激反应对百日咳菌液导致的大鼠感染性脑水肿有保护作用，这一结果为临床治疗感染性脑水肿提供了新的思路。
本课题为卫生部科学研究基金资助(基金编号：94-1-126)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Chopp M, Chen H, Ho HL, et al. Transient hyperthermia protects against subsequent forebrain ischemic cell damage in the rat. Neurology, 1989, 39:1396-1398.
2 Graspary H, Graham SH, Sagar SM, et al. HSP70 heat shock protein induction following global ischemia in the rat. Brain Res Mol Brain Res，1995,34: 327-332.
(收稿：1998-08-22 修回：1998-12-09), http://www.100md.com
单位：410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990623 急性感染性脑水肿占儿内科临床各种致脑水肿原发病的70%～90%。小儿脑水肿的病死率在20%左右。如何调动机体的内源性抗损伤机制，提高细胞对致病因子的抵抗能力来防治疾病,已成为当前疾病防治研究的新领域。热应激反应(heat stress response, HSR)是机体的内源性抗损伤机制之一。高热、细菌毒素、缺氧、缺血、组织损伤等亚致死量的刺激可诱导机体细胞产生热应激反应。已证明热应激反应对大鼠的缺血性脑损伤[1]、心脏缺血-再灌流损伤、油酸肺损伤及败血症所致的肺和肝组织的损伤均有保护作用，本文将对热应激反应对大鼠的感染性脑水肿的保护作用进行探讨。
材料：1.成年健康雄性S D大鼠，体重209±30 g, 由本院动物室提供,符合二级实验动物标准。
, http://www.100md.com
2.主要试剂及仪器：百日咳菌液(PB)含菌量980亿/ml，由北京生物制品研究所提供；精制大肠杆菌内毒素(O127∶B8)购自Sigma公司；伊文思蓝购自Baker.化学公司；电子天平(精度1/10万)由德国Gottingen生产；电热恒温干燥箱：PH030型，上海实验仪器厂；原子吸收光谱仪：AA-6809，日本；透射电镜: HITACH,H-600,日本。
方法：1.分组及预处理：SD大鼠68只，设正常对照组8只，余60只随机分为4组，部分动物在未到处死时间前死亡。(1)正常对照组：不作预处理，置室温24小时后向左颈内动脉注入生理盐水；(2)感染性脑水肿组(10只)：不作预处理，置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液；(3)生理盐水预处理组(10只)：腹腔注射灭菌生理盐水0.25 ml/kg，置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液；(4)热休克预处理组(11只)：使大鼠肛温升至42℃,维持15分钟，置室温恢复24小时后，向左颈内动脉注入百日咳菌液；(5)内毒素预处理组(13只)：腹腔注射精制大肠杆菌内毒素500 μg/kg(0.25 ml/kg)。置室温24小时后向左颈内动脉注入百日咳菌液。
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2.感染性脑水肿动物模型的制备：大鼠用25%乌拉坦麻醉后，分离左侧颈总动脉分别结扎其颅外分支，向左颈内动脉注入百日咳菌液0.2 ml/kg(菌液使用前充分超声震荡粉碎凝块)。正常对照组则注射灭菌生理盐水0.2 ml/kg。注菌或生理盐水后半小时内从阴茎背静脉注入2%伊文思蓝2 ml/kg。注菌或注生理盐水后观察4小时断头处死。
3.检测指标：(1)脑含水量测定：采用干湿法进行,按Elliott公式计算；(2)脑组织伊文思蓝含量测定：采用甲酰胺定量法进行；(3)脑组织钠钾测定：用原子吸收光谱法测定干脑组织中钠、钾离子含量；(4)电镜标本制备与观察：实验动物经腹主动脉注入多聚甲醛-戊二醛固定液进行前固定, 从左侧海马CA1区及大脑皮层分别切取约1 mm×1 mm×0.5 mm大小的组织块，放入同样固定液中固定2小时，经电镜制样，切片定位后,透视电镜观察及摄相。
4.统计学处理:数据均采用SPSS软件计算，计量资料用
表示，组间比较用F检验，相关分析采用直线回归。, http://www.100md.com
表1 注菌或盐水侧脑组织含水量、伊文思蓝含量及离子测定(
) 分组含水量
(%)
伊文思蓝含量
(μg/g)
钠离子含量
(mmol/kg)
钾离子含量
(mmol/kg)
正常对照组
78.89±0.16
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1.50±0.17
192.9±2.9
459.5±3.0
感染性脑水肿组
81.20±0.28
3.68±0.36
279.6±9.1
360.9±9.2
生理盐水预处理组
80.82±0.42
3.68±0.30
272.9±8.8
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361.4±10.0
热休克预处理组
79.55±0.23
2.38±0.28
200.7±5.5
393.7±19.8
内毒素预处理组
79.38±0.17
2.70±0.16
210.1±11.7
404.7±11.3
F值
, 百拇医药
12.84
7.71
20.45
2.35
P值
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
结果：1.脑含水量(%)：表1中各组脑含水量比较显示，感染性脑水肿组和生理盐水预处理组含水量明显高于正常对照组，差异有非常显著意义；热休克预处理组和内毒素预处理组含水量较感染性脑水肿组明显降低，差异有显著意义；内毒素预处理组含水量较生理盐水预处理组明显降低，差异有非常显著意义，而与正常对照组比较，二者差异无显著性意义(P>0.05)。
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2.脑伊文思蓝含量(μg/g湿重)：表1显示，感染性脑水肿组和生理盐水预处理组与正常对照组比较伊文思蓝含量明显增高，差异有非常显著意义；热休克预处理组伊文思蓝含量明显低于感染性脑水肿组，差异有非常显著意义(P<0.001)，但高于正常对照组,差异有显著意义(P<0.05)；内毒素预处理组伊文思蓝含量较感染性脑水肿组和生理盐水预处理组显著降低，差异有显著意义(P<0.05)。脑含水量与伊文思蓝含量经直线相关分析二者有高度正相关(r=0.9228,P<0.01)。
3.脑组织钠离子、钾离子含量(mmol/kg干重)：表1中显示感染性脑水肿组和生理盐水预处理组钠离子含量明显高于正常对照组，钾离子含量明显低于正常对照组,差异有显著意义；热休克预处理组和内毒素预处理组钠离子含量明显低于感染性脑水肿组，差异有显著意义；各组钠离子含量与脑含水量的变化经直线相关分析显示呈直线正相关(r=0.9165,P<0.01)，钾离子含量的变化与钠离子含量的改变经直线相关分析显示呈直线负相关(r=-0.7738,P<0.01)。
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4.电镜观察：电镜结果显示感染性脑水肿组毛细血管腔内未见栓塞,毛细血管腔内皮细胞中吞饮小泡增多，胶质细胞水肿明显，线粒体肿胀，嵴消失，神经细胞皱缩，粗面内质网扩张，线粒体肿胀，胞浆中有空泡样变。热休克预处理组毛细血管内皮细胞大致正常，部分毛细血管周围胶质细胞轻度水肿，神经细胞轻度皱缩，粗面内质网轻度扩张。内毒素预处理组部分毛细血管周围胶质细胞足突水肿，神经细胞部分线粒体肿胀，部分粗面内质网扩张，核皱缩。
讨论：根据脑水肿的病理学与形成机制分为血管源性脑水肿与细胞毒性脑水肿。本实验采用的大鼠百日咳菌液急性感染性脑水肿模型是本室建立的动物模型，属混合性脑水肿。脑含水量是反映脑水肿严重程度的重要指标。本实验感染性脑水肿组与正常对照组比较，注菌4小时后含水量明显增高，说明将百日咳菌液注入颅内引起了急性脑水肿。生理盐水预处理组脑含水量明显高于正常对照组，而与感染性脑水肿组比较差异无显著意义，说明生理盐水预处理不能使脑含水量降低。热休克预处理组和内毒素预处理组的脑含水量较感染性脑水肿组明显降低，差异有非常显著意义(P<0.01)，提示热休克预处理和内毒素预处理均可显著降低感染性脑水肿的脑含水量。
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伊文思蓝能通过损伤的血脑屏障进入脑实质，使脑组织被蓝染，所以伊文思蓝常作为血脑屏障受损的指示剂。脑组织中伊文思蓝含量的多少反映了血脑屏障的损伤程度。实验结果显示，感染性脑水肿组伊文思蓝含量明显高于正常对照组，说明有血脑屏障的损伤，提示有血管源性脑水肿的存在；生理盐水预处理组与感染性脑水肿组的伊文思蓝含量比较，二者差异无显著意义(P>0.05)，说明生理盐水预处理没有减轻血脑屏障损伤的作用；经热休克预处理或内毒素预处理后，脑组织中伊文思蓝含量较感染性脑水肿组有明显降低，说明热休克预处理和内毒素预处理有保护血脑屏障的作用。另外，脑含水量和伊文思蓝含量经直线相关分析显示有高度正相关性，提示脑水肿的形成与血脑屏障受损有关。
细胞毒性脑水肿时，细胞膜上钠-钾泵失活。因此，细胞毒性脑水肿时脑组织中的钠含量增加，钾含量减少。本实验结果显示感染性脑水肿组和生理盐水预处理组钠离子含量较正常对照组显著增高，而钾离子含量明显降低，提示有钠-钾泵受损，说明该脑水肿模型有细胞毒性脑水肿存在；热休克预处理组和内毒素预处理组脑组织中钠离子含量较感染性脑水肿组明显降低，差异有显著意义(P<0.01)，且钠离子含量的改变与脑含水量的变化经直线相关分析显示呈高度正相关；钠离子含量降低与钾离子含量增高经直线相关分析显示呈高度负相关，提示热休克预处理和内毒素预处理减轻脑水肿与保护钠-钾泵有关。
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感染性脑水肿组脑组织电镜观察显示毛细血管腔未见栓塞现象，毛细血管内皮细胞中吞饮小泡增多，毛细血管周围的胶质细胞足突水肿明显，线粒体肿胀，嵴消失。经热休克预处理或内毒素预处理后，电镜观察示脑水肿减轻，进一步证实热休克预处理和内毒素预处理可减轻百日咳菌液引起的急性脑水肿。近年来，通过提高机体细胞自身抗损伤的能力来对抗疾病这一观点，逐渐引起人们的重视。实验证明热应激反应是细胞对环境因素改变所产生的保护性反应,在这种反应过程中，细胞合成热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)，并认为热应激反应的保护作用与热休克蛋白的产生有关[2]。本实验的结果提示热休克预处理和内毒素预处理所诱导的热应激反应对百日咳菌液导致的大鼠感染性脑水肿有保护作用，这一结果为临床治疗感染性脑水肿提供了新的思路。
本课题为卫生部科学研究基金资助(基金编号：94-1-126)
参考文献
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1 Chopp M, Chen H, Ho HL, et al. Transient hyperthermia protects against subsequent forebrain ischemic cell damage in the rat. Neurology, 1989, 39:1396-1398.
2 Graspary H, Graham SH, Sagar SM, et al. HSP70 heat shock protein induction following global ischemia in the rat. Brain Res Mol Brain Res，1995,34: 327-332.
(收稿：1998-08-22 修回：1998-12-09), http://www.100md.com