神经生长因子减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤
作者：徐放生 吴婉芳 林久治
单位：100020 北京，首都儿科研究所
关键词：神经生长因子；脑缺氧；脑缺血；婴儿, 新生
中华儿科杂志990616 【摘要】 目的 观察神经生长因子(NGF)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用。方法 对54只7日龄Wistar大鼠随机分为NGF治疗组(NGF组，n=30)和对照组(n=24)，缺氧缺血后即刻腹腔内注射NGF或生理盐水。44小时后测定各组脑含水量，28天后测量各组脑重量并观察脑大体改变和组织学改变。结果 NGF组和对照组左脑含水量分别为(89.2±1.5)%和(89.9±1.3)%(P>0.05)。NGF组左脑萎缩比对照组减轻58.7%，脑大体检查和显微镜检查也优于对照组。结论 NGF能减轻缺氧缺血后远期的脑损伤，但不能减少新生大鼠缺氧缺血后脑水肿。
Protective effect of nerve growth factor on hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn rats XU Fangsheng, WU Wanfang, LIN Jiuzhi. Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To evaluate protective effect of nerve growth factor (NGF) on hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn rats.Methods Wistar rats of 7-day old were divided randomly into NGF-treated and control groups. Right after hypoxic-ischemic insult, NGF or normal saline solution were injected intraperitoneally. Brain water contents in 44 hours and brain weights in 28 days were examined. Macro- and microscopical changes were observed.Results Left brain water contents were (89.2±1.5)% and (89.9±1.3)%, respectively for NGF and control groups (P> 0.05). Left brain atrophy in NGF group was about 58.7% less than those in control group. Macro- and microscopical changes were less extensive in NGF group than those in control group.Conclusion NGF could reduce long-term brain damages after hypoxic-ischemic insult but not brain edema.
, 百拇医药
【Key words】 Nerve growth factors Cerebral anoxia Cerebral ischemia Infant, newborn
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经系统最主要的神经营养因子之一，它通过与效应神经细胞上的受体trkA结合，能诱导神经纤维定向生长，控制神经细胞存活数量和分化，促进损伤神经细胞的修复，参与神经细胞的凋亡过程。NGF也是一种多功能生长因子，除神经系统外，它还可能影响免疫、造血、内分泌和生殖等多系统的功能[1]。Yamamoto等[2，3]观察到NGF对成年动物和新生动物的神经细胞具有保护作用。本次实验我们改为对鼠腹腔内注射给药，观察NGF对新生大鼠缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalophathy，HIE)的治疗效果，报告如下。
对象和方法
, http://www.100md.com
一、实验分组
54只7日龄wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)，性别不拘，每窝大鼠按体重顺序随机分为短期NGF治疗组(NGF组)12只和对照组10只，长期NGF组18只和对照组14只。我们以前的实验证实假手术组双侧脑含水量和脑重量无明显差异[4，5]，本次实验未设假手术组，仅在病理检查中另设假手术组3只。实验时各组体重分别为(16.0±1.6) g、(16.1±2.0) g、(16.8±2.3) g、(16.9±2.4) g、(16.6±2.0) g(P>0.05)。
二、模型制备
NGF组和对照组使用我们实验室建立的HIE模型制备方法[4]：将7日龄大鼠短暂乙醚麻醉后切开颈部皮肤，结扎左侧颈总动脉，2小时后放入缺氧罐中，吸入8%浓度氧2小时，制成新生大鼠HIE模型。假手术组仅切开7日龄大鼠颈部皮肤，分离颈总动脉，但不结扎，缝合皮肤后也不缺氧，做为正常对照组。
, 百拇医药
三、实验治疗
NGF(购自北京市天力兰生物医学工程研究所，批号961118)使用前用注射用水稀释成500 U/ml。NGF组缺氧缺血后即刻腹腔注射NGF 100 U(约5 000～7 000 U/kg)，以后每天一次，短期组连续2天，长期组连续7天。对照组和假手术组缺氧缺血后即刻腹腔注射等量的生理盐水，注射量及时间与相应的NGF组相同。
四、观察项目
1.短期组大鼠在缺氧缺血后44小时处死，检测双侧脑组织含水量[4]。即称湿脑重量，然后放到80℃烤箱内48小时，再称干脑重量，计算：(湿重-干重)/湿重＝脑含水量。
2.长期组和假手术组大鼠在缺氧缺血后28天处死，观察脑大体改变。双侧脑组织分别称重并计算左脑和右脑重量比例，作为脑萎缩的指标。
, 百拇医药
3.为证实NGF对中枢神经细胞的保护作用，我们选择了两窝长期组大鼠，在左侧脑组织海马丘脑水平做冠状切片，HE染色后摄片，比较前脑皮层厚度。以假手术组皮层厚度为标准，保留90%以上者为无减薄，～50%为轻度减薄，<50%为重度减薄。同时选取前脑相同区域0.2 mm宽度计数全层神经细胞存活数量和神经胶质细胞数量。
统计学处理：采用t、χ2检验和直接概率法。
结 果
一、鼠死亡数
短期NGF组实验过程中死亡1只，对照组死亡2只(P=0.57)；长期NGF组死亡2只，对照组死亡6只(P=0.10)。
二、脑含水量
缺氧缺血后44小时检查，两组大鼠的左侧大脑顶颞部均可见到白色的梗死灶。NGF组左脑含水量比对照组左脑略低，差异无显著意义(表1)，两组左脑含水量都比右脑明显增高。
, http://www.100md.com
表1 两组鼠脑含水量比较(
±s，%) 组别
鼠数(只)
左脑
右脑
t值
P值
NGF组
11
89.2±1.5
86.9±0.6
4.556
, http://www.100md.com
<0.001
对照组
8
89.9±1.3
86.8±0.9
5.548
<0.001
t值
1.068
0.385
P值
>0.05
>0.05
, http://www.100md.com
三、脑大体检查
缺氧缺血后4周检查，两组大鼠的左侧视神经全部萎缩。脑大体改变主要表现为左脑半球缩小，左侧顶颞部脑皮层凹陷或脑室明显扩大，类似囊肿样改变。NGF组类似囊肿样改变4只(25%)，对照组5只(62.5%, P>0.05)。假手术组视神经和脑大体观均未见明显改变。
四、脑组织重量
NGF组左脑重量占右脑重量的比例为(86.7±12.1)%，对照组为(67.8±15.4)%(表2)，NGF组脑萎缩比对照组减轻58.7%(32.2～13.3)/32.2%)。假手术组左脑重量与右脑重量之比为(100.5±2.6)%。
表2 两组鼠脑组织重量比较(±s, mg) 组别
, http://www.100md.com
鼠数(只)
左脑
右脑
NGF组
16
510±81
589±48
对照组
8
405±96
598±38
t值
2.829
, 百拇医药
0.443
P值
<0.01
>0.05
五、组织学检查
从切面上观察，假手术组大体观和显微镜下检查未见明显异常。NGF组与假手术组比较皮层重度减薄1只、轻度减薄3只、无减薄2只，对照组3只全部重度减薄。假手术组、NGF组和对照组的前脑皮层厚度之比为1∶0.64∶0.29。三组前脑区域全层神经细胞数之比为1∶0.63∶0.33。三组神经胶质细胞数的比例为1∶0.99∶1.80(表3)。
表3 前脑皮层厚度及细胞数(±s) 组别
, http://www.100md.com
鼠数
(只)
皮层厚度
(mm)
神经细胞
(个)
神经胶质细胞
(个)
NGF组
6
0.92±0.32
81±13
35±5
, 百拇医药
对照组
3
0.41±0.22*
43±14**
64±27*
假手术组
3
1.39±0.10*
129±27**
36±5
* 与NGF组比较P<0.05 **与NGF组比较P<0.01
, 百拇医药
讨 论
国外研究，证实人NGF的β亚基是由两条含有118个氨基酸残基的相同肽链组成，其基因位于第一条染色体短臂上[6]。1996年Holtzman[3]报道了NGF对7日龄新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用。他们的实验显示新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后14天，纹状体和大脑皮层的切面面积减少了30%～35%，而NGF治疗组仅减少10%。我们采用测定脑组织重量的方法，结果对照组左脑萎缩32.2%，NGF组萎缩13.3%，与之相似。为观察NGF组脑组织中神经细胞的存活情况，我们随机选择了2窝大鼠进行了组织学检查，结果显示NGF组神经细胞存活数量明显比对照组多，而神经胶质细胞比对照组少，与Yamamoto等[2]对成年沙土鼠的观察结果类似。我们的观察说明NGF确实能促进中枢神经细胞修复，减少新生大鼠缺氧缺血后的远期脑损伤。我们的实验同时也显示治疗组左脑含水量比对照组仅降低0.7%，而比两组右脑的含水量高3%左右，提示NGF不能明显减轻新生大鼠缺氧缺血性脑水肿。
, 百拇医药
NGF减少神经细胞损伤的确切机理目前还不清楚，一般认为NGF由效应神经元支配的靶组织合成和分泌，与神经末梢上的相应受体结合后进入轴突，逆行至胞体，在此过程中影响某些基因的转录以及转录后的翻译和蛋白修饰，从而引起一系列的生物效应，如支持神经元存活并促进神经纤维的生长等[1]。
我们的实验有两个特点，(1)采用缺氧缺血后给药，国外几个实验均采用缺氧缺血前或缺氧缺血前后给药的方法[2，3]。缺氧缺血后给药更接近新生儿HIE的临床状况，我们的实验也同样显示了良好的脑保护作用。(2)采用腹腔内注射给药，以往的实验是脑室内注射给药或脑组织内植入药丸的方法，临床上使用比较繁琐。Nozaki等[7]的实验给我们以提示，他把另一种神经营养因子—碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)注射到7日龄新生大鼠腹腔内，证实腹腔注射也能减轻缺氧缺血性脑损伤。NGF是一种大分子多肽，能够通过血脑屏障的原因可能是由于新生动物血脑屏障发育不完善，同时缺氧缺血本身进一步损伤了血脑屏障，从而使大分子NGF能作用于脑组织。本次实验结果为今后NGF的用药时机和用药途径提供了实验依据。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Snider WD, Johnson EM. Neurotrophic molecules. Ann Neurol, 1989, 26:489-506.
2 Yamamoto S, Yoshimine T, Fujita T, et al. Protective effect of NGF atelocollagen mini-pellet on the hippocampal delayed neuronal death in gerbils. Neurosci Lett, 1992, 141:161-165.
3 Holtzman DM, Sheldon RA, Jaffe W, et al. Nerve growth factor protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury. Ann Neurol, 1996, 39:114-122.
, 百拇医药
4 吴婉芳, 徐放生, 张莉莉, 等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型.新生儿科杂志, 1992, 7, 265-267.
5 张伟, 吴婉芳, 李松, 等.高压氧治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病疗效及毒副作用观察.中华儿科杂志, 1996, 34:330-332.
6 Zabel BU, Eddy RL, Lalley PA, et al. Chromosomal locations of the human and mouse genes for precursors of epidermal growth factor and the β subunit of nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:469-473.
7 Nozaki K, Finklestein SP, Beal MF. Basic fibroblast growth factor protects against hypoxia-ischemia and NMDA neurotoxicity in neonatal rats. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13:221-228.
(收稿：1998-02-06 修回：1998-10-06), 百拇医药
单位：100020 北京，首都儿科研究所
关键词：神经生长因子；脑缺氧；脑缺血；婴儿, 新生
中华儿科杂志990616 【摘要】 目的 观察神经生长因子(NGF)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用。方法 对54只7日龄Wistar大鼠随机分为NGF治疗组(NGF组，n=30)和对照组(n=24)，缺氧缺血后即刻腹腔内注射NGF或生理盐水。44小时后测定各组脑含水量，28天后测量各组脑重量并观察脑大体改变和组织学改变。结果 NGF组和对照组左脑含水量分别为(89.2±1.5)%和(89.9±1.3)%(P>0.05)。NGF组左脑萎缩比对照组减轻58.7%，脑大体检查和显微镜检查也优于对照组。结论 NGF能减轻缺氧缺血后远期的脑损伤，但不能减少新生大鼠缺氧缺血后脑水肿。
Protective effect of nerve growth factor on hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn rats XU Fangsheng, WU Wanfang, LIN Jiuzhi. Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To evaluate protective effect of nerve growth factor (NGF) on hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn rats.Methods Wistar rats of 7-day old were divided randomly into NGF-treated and control groups. Right after hypoxic-ischemic insult, NGF or normal saline solution were injected intraperitoneally. Brain water contents in 44 hours and brain weights in 28 days were examined. Macro- and microscopical changes were observed.Results Left brain water contents were (89.2±1.5)% and (89.9±1.3)%, respectively for NGF and control groups (P> 0.05). Left brain atrophy in NGF group was about 58.7% less than those in control group. Macro- and microscopical changes were less extensive in NGF group than those in control group.Conclusion NGF could reduce long-term brain damages after hypoxic-ischemic insult but not brain edema.
, 百拇医药
【Key words】 Nerve growth factors Cerebral anoxia Cerebral ischemia Infant, newborn
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经系统最主要的神经营养因子之一，它通过与效应神经细胞上的受体trkA结合，能诱导神经纤维定向生长，控制神经细胞存活数量和分化，促进损伤神经细胞的修复，参与神经细胞的凋亡过程。NGF也是一种多功能生长因子，除神经系统外，它还可能影响免疫、造血、内分泌和生殖等多系统的功能[1]。Yamamoto等[2，3]观察到NGF对成年动物和新生动物的神经细胞具有保护作用。本次实验我们改为对鼠腹腔内注射给药，观察NGF对新生大鼠缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalophathy，HIE)的治疗效果，报告如下。
对象和方法
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一、实验分组
54只7日龄wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)，性别不拘，每窝大鼠按体重顺序随机分为短期NGF治疗组(NGF组)12只和对照组10只，长期NGF组18只和对照组14只。我们以前的实验证实假手术组双侧脑含水量和脑重量无明显差异[4，5]，本次实验未设假手术组，仅在病理检查中另设假手术组3只。实验时各组体重分别为(16.0±1.6) g、(16.1±2.0) g、(16.8±2.3) g、(16.9±2.4) g、(16.6±2.0) g(P>0.05)。
二、模型制备
NGF组和对照组使用我们实验室建立的HIE模型制备方法[4]：将7日龄大鼠短暂乙醚麻醉后切开颈部皮肤，结扎左侧颈总动脉，2小时后放入缺氧罐中，吸入8%浓度氧2小时，制成新生大鼠HIE模型。假手术组仅切开7日龄大鼠颈部皮肤，分离颈总动脉，但不结扎，缝合皮肤后也不缺氧，做为正常对照组。
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三、实验治疗
NGF(购自北京市天力兰生物医学工程研究所，批号961118)使用前用注射用水稀释成500 U/ml。NGF组缺氧缺血后即刻腹腔注射NGF 100 U(约5 000～7 000 U/kg)，以后每天一次，短期组连续2天，长期组连续7天。对照组和假手术组缺氧缺血后即刻腹腔注射等量的生理盐水，注射量及时间与相应的NGF组相同。
四、观察项目
1.短期组大鼠在缺氧缺血后44小时处死，检测双侧脑组织含水量[4]。即称湿脑重量，然后放到80℃烤箱内48小时，再称干脑重量，计算：(湿重-干重)/湿重＝脑含水量。
2.长期组和假手术组大鼠在缺氧缺血后28天处死，观察脑大体改变。双侧脑组织分别称重并计算左脑和右脑重量比例，作为脑萎缩的指标。
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3.为证实NGF对中枢神经细胞的保护作用，我们选择了两窝长期组大鼠，在左侧脑组织海马丘脑水平做冠状切片，HE染色后摄片，比较前脑皮层厚度。以假手术组皮层厚度为标准，保留90%以上者为无减薄，～50%为轻度减薄，<50%为重度减薄。同时选取前脑相同区域0.2 mm宽度计数全层神经细胞存活数量和神经胶质细胞数量。
统计学处理：采用t、χ2检验和直接概率法。
结 果
一、鼠死亡数
短期NGF组实验过程中死亡1只，对照组死亡2只(P=0.57)；长期NGF组死亡2只，对照组死亡6只(P=0.10)。
二、脑含水量
缺氧缺血后44小时检查，两组大鼠的左侧大脑顶颞部均可见到白色的梗死灶。NGF组左脑含水量比对照组左脑略低，差异无显著意义(表1)，两组左脑含水量都比右脑明显增高。
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表1 两组鼠脑含水量比较(
±s，%) 组别鼠数(只)
左脑
右脑
t值
P值
NGF组
11
89.2±1.5
86.9±0.6
4.556
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<0.001
对照组
8
89.9±1.3
86.8±0.9
5.548
<0.001
t值
1.068
0.385
P值
>0.05
>0.05
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三、脑大体检查
缺氧缺血后4周检查，两组大鼠的左侧视神经全部萎缩。脑大体改变主要表现为左脑半球缩小，左侧顶颞部脑皮层凹陷或脑室明显扩大，类似囊肿样改变。NGF组类似囊肿样改变4只(25%)，对照组5只(62.5%, P>0.05)。假手术组视神经和脑大体观均未见明显改变。
四、脑组织重量
NGF组左脑重量占右脑重量的比例为(86.7±12.1)%，对照组为(67.8±15.4)%(表2)，NGF组脑萎缩比对照组减轻58.7%(32.2～13.3)/32.2%)。假手术组左脑重量与右脑重量之比为(100.5±2.6)%。
表2 两组鼠脑组织重量比较(
±s, mg) 组别, http://www.100md.com
鼠数(只)
左脑
右脑
NGF组
16
510±81
589±48
对照组
8
405±96
598±38
t值
2.829
, 百拇医药
0.443
P值
<0.01
>0.05
五、组织学检查
从切面上观察，假手术组大体观和显微镜下检查未见明显异常。NGF组与假手术组比较皮层重度减薄1只、轻度减薄3只、无减薄2只，对照组3只全部重度减薄。假手术组、NGF组和对照组的前脑皮层厚度之比为1∶0.64∶0.29。三组前脑区域全层神经细胞数之比为1∶0.63∶0.33。三组神经胶质细胞数的比例为1∶0.99∶1.80(表3)。
表3 前脑皮层厚度及细胞数(
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
(只)
皮层厚度
(mm)
神经细胞
(个)
神经胶质细胞
(个)
NGF组
6
0.92±0.32
81±13
35±5
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对照组
3
0.41±0.22*
43±14**
64±27*
假手术组
3
1.39±0.10*
129±27**
36±5
* 与NGF组比较P<0.05 **与NGF组比较P<0.01
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讨 论
国外研究，证实人NGF的β亚基是由两条含有118个氨基酸残基的相同肽链组成，其基因位于第一条染色体短臂上[6]。1996年Holtzman[3]报道了NGF对7日龄新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用。他们的实验显示新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后14天，纹状体和大脑皮层的切面面积减少了30%～35%，而NGF治疗组仅减少10%。我们采用测定脑组织重量的方法，结果对照组左脑萎缩32.2%，NGF组萎缩13.3%，与之相似。为观察NGF组脑组织中神经细胞的存活情况，我们随机选择了2窝大鼠进行了组织学检查，结果显示NGF组神经细胞存活数量明显比对照组多，而神经胶质细胞比对照组少，与Yamamoto等[2]对成年沙土鼠的观察结果类似。我们的观察说明NGF确实能促进中枢神经细胞修复，减少新生大鼠缺氧缺血后的远期脑损伤。我们的实验同时也显示治疗组左脑含水量比对照组仅降低0.7%，而比两组右脑的含水量高3%左右，提示NGF不能明显减轻新生大鼠缺氧缺血性脑水肿。
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NGF减少神经细胞损伤的确切机理目前还不清楚，一般认为NGF由效应神经元支配的靶组织合成和分泌，与神经末梢上的相应受体结合后进入轴突，逆行至胞体，在此过程中影响某些基因的转录以及转录后的翻译和蛋白修饰，从而引起一系列的生物效应，如支持神经元存活并促进神经纤维的生长等[1]。
我们的实验有两个特点，(1)采用缺氧缺血后给药，国外几个实验均采用缺氧缺血前或缺氧缺血前后给药的方法[2，3]。缺氧缺血后给药更接近新生儿HIE的临床状况，我们的实验也同样显示了良好的脑保护作用。(2)采用腹腔内注射给药，以往的实验是脑室内注射给药或脑组织内植入药丸的方法，临床上使用比较繁琐。Nozaki等[7]的实验给我们以提示，他把另一种神经营养因子—碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)注射到7日龄新生大鼠腹腔内，证实腹腔注射也能减轻缺氧缺血性脑损伤。NGF是一种大分子多肽，能够通过血脑屏障的原因可能是由于新生动物血脑屏障发育不完善，同时缺氧缺血本身进一步损伤了血脑屏障，从而使大分子NGF能作用于脑组织。本次实验结果为今后NGF的用药时机和用药途径提供了实验依据。
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参考文献
1 Snider WD, Johnson EM. Neurotrophic molecules. Ann Neurol, 1989, 26:489-506.
2 Yamamoto S, Yoshimine T, Fujita T, et al. Protective effect of NGF atelocollagen mini-pellet on the hippocampal delayed neuronal death in gerbils. Neurosci Lett, 1992, 141:161-165.
3 Holtzman DM, Sheldon RA, Jaffe W, et al. Nerve growth factor protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury. Ann Neurol, 1996, 39:114-122.
, 百拇医药
4 吴婉芳, 徐放生, 张莉莉, 等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型.新生儿科杂志, 1992, 7, 265-267.
5 张伟, 吴婉芳, 李松, 等.高压氧治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病疗效及毒副作用观察.中华儿科杂志, 1996, 34:330-332.
6 Zabel BU, Eddy RL, Lalley PA, et al. Chromosomal locations of the human and mouse genes for precursors of epidermal growth factor and the β subunit of nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:469-473.
7 Nozaki K, Finklestein SP, Beal MF. Basic fibroblast growth factor protects against hypoxia-ischemia and NMDA neurotoxicity in neonatal rats. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13:221-228.
(收稿：1998-02-06 修回：1998-10-06), 百拇医药