甲基氢化泼尼松对哮喘患儿单核-巨噬细胞产生IL-10/IL-12及其mRNA表达的影响
作者：符州 杨锡强 陈坤华 李成荣 张儒谊
单位：400014 重庆医科大学儿童医院(符州、杨锡强、陈坤华、张儒谊)；深圳市儿童医院(李成荣)
关键词：哮喘；白细胞介素类；抗原提呈细胞；糖皮质激素类；RNA，信使
中华儿科杂志990609 【摘要】 目的 了解激素对哮喘患儿单核-巨噬细胞(Mo-Mφ)产生白细胞介素(IL)-10、IL-12的影响，认识其对哮喘细胞因子网络的调节作用。方法 将临床30例哮喘患儿随机分为甲基氢化泼尼松(MP)治疗组(15例)和对照组(15例)，用ELISA方法测外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-10、IL-12的水平；用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定两因子的mRNA表达。结果 MP在基因转录和蛋白合成两个水平对Mo-Mφ产生IL-10有明显抑制作用，对IL-12的抑制则不明显。结论 皮质激素可能部分通过调节Mo-Mφ分泌IL-10、IL-12的能力而影响哮喘T辅助细胞1/T辅助细胞2功能，以达到抗炎作用。
, http://www.100md.com
Methylprednisolone regulates monocyte-macrophage derived IL-10,IL-12,and their mRNA expression in children with asthma FU Zhou, YANG Xiqiang, CHEN Kunhua, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To observe the effects of methylprednisolone (MP) in production of monocyte-macrophage (Mo-Mφ) derived IL-10, IL-12, and investigate the action of MP in regulating cytokine network in asthma.Methods Thirty asthmatic children were randomly divided into two groups, one as MP-treated group, and the other as control group. All blood samples were collected before and after treatment with MP. IL-10 and IL-12 production in the supernatants of cultured PBMC, stimulated with LPS, and the cytokine mRNA expression were determined by ELISA and RT-PCR methods, respectively.Results There was an obvious decrease in IL-10 production of MP-treated group compared with the controls. No statistical difference was observed in IL-12 production between the two groups. MP inhibited the production and mRNA expression of IL-10 but not IL-12.Conclusion The anti-inflammatory action of MP may be associated with its influence on the function of TH1/TH2 in asthma, which is partially regulated by Mo-Mφ derived IL-10 and IL-12 production.
, 百拇医药
【Key words】 Asthma Interleukins Antigen presenting cells Glucocorticoids RNA, messenger
我们最近的研究发现单核-巨噬细胞(Mo-Mφ)分泌白细胞介素(IL)-10、IL-12异常可能与哮喘异常的免疫功能紊乱密切相关，为探讨皮质激素在哮喘治疗中的作用机制，认识其对哮喘细胞因子网络的调节作用，我们观察了甲基氢化泼尼松(MP)对Mo-Mφ产生IL-10、IL-12的影响，现报告如下。
对象和方法
一、对象
将符合婴幼儿哮喘诊断标准[1]的30例哮喘住院患儿随机分为两组，MP治疗组15例，男9例，女6例，年龄9个月～3岁，平均2.1岁。对照组15例，男8例，女7例，年龄11个月～2.9岁，平均2.3岁。上述患儿均未用过皮质激素。两组均在用药前和用药后4天采血，即刻分离外周血单个核细胞(PBMC)。
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二、方法
1.治疗方法：患儿入院后对照组用抗感染、β2受体兴奋剂雾化治疗；治疗组在此基础上加用MP(砝玛西亚普强亚洲有限公司产)3 mg/(kg.d)，用5%葡萄糖20 ml稀释后静脉滴注，每天2次，共4天。
2.实验方法：(1)PBMC培养及上清液制备：清晨静脉采血，肝素抗凝，常规无菌分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640调细胞至1.0×106/ml，设自身对照，脂多糖组(LPS 5 μg/ml)，37℃ 5% CO2温箱中培养12小时用于提取总RNA；培养48小时收上清液，贮于-20℃备测。(2)细胞因子检测：采用ELISA方法，所有操作步骤均按说明书进行。IL-10、IL-12检测试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司。(3)提取培养细胞总RNA：采用改良异硫氰酸胍-酚仿一步法[2]，用TRITM试剂盒(Gibco, USA)提取。(4)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：参照文献[3]方法分别测定IL-10和IL-12 mRNA逆转录后的扩增产物量。产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，在紫外光下观察并照像。
, 百拇医药
3.统计学方法：实验结果以
±s表示，组间比较用t检验，组内用药前后比较用配对t检验。
结 果
一、MP治疗前后PBMC产生IL-10、IL-12的水平
1.组内比较：MP组用药后PBMC产生IL-10明显减少(P<0.01)；IL-12水平有所降低，但差异无显著意义。对照组治疗前后IL-10、IL-12水平差异无显著意义(表1)。
表1 两组患儿治疗前后PBMC产生IL-10、IL-12
的水平比较(±s，ng/L) 组别
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例数
IL-10
IL-12
治疗前
治疗后
t值
治疗前
治疗后
t值
对照组
15
637±151
621±134
, 百拇医药
0.79
58±15
61±16
0.84
治疗组
15
642±149
452±143
6.67*
60±12
56±11
1.86
两组比较t值
, http://www.100md.com
0.09
3.33*
0.40
0.88
注：* P<0.01
2.组间比较：治疗前两组IL-10、IL-12水平差异无显著意义(P>0.05)，治疗后MP组IL-10水平显著低于对照组，IL-12与对照组差异无显著意义(表1)。
二、MP治疗前后IL-10、IL-12 mRNA表达
在基因转录水平，MP对IL-10、IL-12 mRNA的表达均有一定抑制作用(图1，2),图中左边3条电泳带为MP治疗前3个标本PBMC表达IL-10、IL-12mRNA逆转录扩增的产物,右边3条带为经治疗后相同个体PBMC两因子mRNA表达产物,由图可见,右边扩增产物量较左边减少。
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1.自身对照(无丝裂原)；2.加LPS的IL-10电泳带；3.分子量标准ΦX174HaeⅢ；以3为界，与左边3条IL-10的电泳带比较，右边(治疗后)对应的3条带亮度减弱，中间条带消失
图1 LPS刺激后患儿PBMC IL-10 mRNA的表达(RT-PCR)
1.自身对照(无丝裂原)；2.加LPS的IL-12P40电泳带；3.分子量标准ΦX174HaeⅢ；以3为界，与左边3条IL-12P40的电泳带比较，右边(治疗后)对应的3条带亮度不同程度减弱
图2 LPS刺激后患儿PBMC IL-12P40 mRNA的表达(RT-PCR)
讨 论
有研究表明，T辅助细胞(TH)亚群功能失衡是哮喘免疫发病机理中的重要环节[4]，表现为TH2(以产生IL-4、IL-5、IL-10为主)功能亢进和TH1(产生IFN-γ、IL-2为主)功能不足。由此导致相应细胞因子产生紊乱，参与哮喘速发和迟发相气道变应性炎症。近来研究显示，抗原提呈细胞在TH亚群分化中起重要作用，作为抗原提呈细胞重要成员的Mo-Mφ可能通过分泌IL-10、IL-12而调节TH1/TH2功能[5]。IL-12可诱导T细胞增殖并产生大量IFN-γ[6]，促进TH1型转化，抑制IL-4产生。而IL-10则抑制TH1类细胞因子生成，促进TH2型转化[7]。
, 百拇医药
我们曾通过体外LPS刺激PBMC，发现哮喘发作时Mo-Mφ产生IL-12水平低下，而IL-10则显著增高[8]，推测哮喘TH1/TH2失衡可能部分与Mo-Mφ功能异常有关。由于IL-12不足，对TH1的支持减弱，而IL-10增多，诱导TH2功能亢进，最终加剧了TH1/TH2功能失衡。
糖皮质激素是迄今为止治疗哮喘最有效的药物，其抗炎机理尚不十分清楚。 Bentley等[9]用氢化泼尼松治疗哮喘后，患者支气管肺泡灌洗液中表达IL-4、IL-5mRNA的细胞数较对照组明显减少，而表达IFN-γmRNA的细胞数明显增加，与病情改善一致。提示激素可能在TH亚群水平调节TH1/TH2平衡。
为了解激素对Mo-Mφ产生细胞因子的影响，我们观察了MP治疗后哮喘患儿Mo-Mφ分泌IL-10、IL-12的水平及其mRNA表达，发现治疗组用药后，MP在基因转录和蛋白合成两水平对Mo-Mφ产生IL-10有明显的抑制效应，对IL-12的抑制则不明显。由于IL-10受到抑制，促进TH2的作用随之减弱，使哮喘TH1/TH2失衡得到部分纠正。
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上述结果提示激素在抗原提呈细胞水平对哮喘失衡的细胞因子网络有调节作用。由于参与哮喘炎症的细胞因子众多，激素的治疗作用可能还表现在多种靶细胞，不同的免疫调节层次及细胞因子产生的不同环节上。进一步对激素抗炎机理的系统研究，将有助于认识哮喘复杂的炎症本质，对研制更特异有效的药物防治哮喘，将起到积极的促进作用。
参考文献
1 全国儿科哮喘协作组.儿童哮喘诊断标准和治疗常规.中华儿科杂志，1993,31:222-224.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-164.
, 百拇医药
3 Sandhya LD, Lagoo AS. A standardized approach to PCR-based semiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples. Lymphokine Cytokine Res, 1993,12:59-65.
4 Kline JN, Hunninghake GW. T-lymphocyte dysregulation in asthma. Proc Soc Exp Biol Med, 1994,207:243-253.
5 Hilkens CMV, Snijders A, Snijedwint FGM, et al. Modulation of T-cell cytokine secretion by accessory cell-derived products. Eur Respir J, 1996,9 (Suppl 22):90-95.
, 百拇医药
6 Trinchieri G, Scott P. The role of interleukin 12 in the immune response, disease and therapy. Immunol Today, 1994,15:460-463.
7 D′Andrea BA, Amezaga MA, Valiante NM, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon-γ production by suppressing natural killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells. J Exp Med, 1993,178:1041-1048.
8 符州，杨锡强，李成荣，等.婴幼儿哮喘与T辅助细胞亚群功能失衡研究.中华儿科杂志，1998,36:237-239.
, 百拇医药
9 Bentley AM, Hamid Q, Robinson DS, et al. Prdnisolone treatment in asthma: reduction in the numbers of eosinophils, T cells, tryptase-only positive mast cells, and modulation of IL-4, IL-5, and interferon-gamma cytokine gene expression within the bronchial mucosa. Am J Respir Crit Care Med, 1996,153:551-556.
(收稿：1998-07-01 修回：1999-02-24), 百拇医药
单位：400014 重庆医科大学儿童医院(符州、杨锡强、陈坤华、张儒谊)；深圳市儿童医院(李成荣)
关键词：哮喘；白细胞介素类；抗原提呈细胞；糖皮质激素类；RNA，信使
中华儿科杂志990609 【摘要】 目的 了解激素对哮喘患儿单核-巨噬细胞(Mo-Mφ)产生白细胞介素(IL)-10、IL-12的影响，认识其对哮喘细胞因子网络的调节作用。方法 将临床30例哮喘患儿随机分为甲基氢化泼尼松(MP)治疗组(15例)和对照组(15例)，用ELISA方法测外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-10、IL-12的水平；用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定两因子的mRNA表达。结果 MP在基因转录和蛋白合成两个水平对Mo-Mφ产生IL-10有明显抑制作用，对IL-12的抑制则不明显。结论 皮质激素可能部分通过调节Mo-Mφ分泌IL-10、IL-12的能力而影响哮喘T辅助细胞1/T辅助细胞2功能，以达到抗炎作用。
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Methylprednisolone regulates monocyte-macrophage derived IL-10,IL-12,and their mRNA expression in children with asthma FU Zhou, YANG Xiqiang, CHEN Kunhua, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To observe the effects of methylprednisolone (MP) in production of monocyte-macrophage (Mo-Mφ) derived IL-10, IL-12, and investigate the action of MP in regulating cytokine network in asthma.Methods Thirty asthmatic children were randomly divided into two groups, one as MP-treated group, and the other as control group. All blood samples were collected before and after treatment with MP. IL-10 and IL-12 production in the supernatants of cultured PBMC, stimulated with LPS, and the cytokine mRNA expression were determined by ELISA and RT-PCR methods, respectively.Results There was an obvious decrease in IL-10 production of MP-treated group compared with the controls. No statistical difference was observed in IL-12 production between the two groups. MP inhibited the production and mRNA expression of IL-10 but not IL-12.Conclusion The anti-inflammatory action of MP may be associated with its influence on the function of TH1/TH2 in asthma, which is partially regulated by Mo-Mφ derived IL-10 and IL-12 production.
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【Key words】 Asthma Interleukins Antigen presenting cells Glucocorticoids RNA, messenger
我们最近的研究发现单核-巨噬细胞(Mo-Mφ)分泌白细胞介素(IL)-10、IL-12异常可能与哮喘异常的免疫功能紊乱密切相关，为探讨皮质激素在哮喘治疗中的作用机制，认识其对哮喘细胞因子网络的调节作用，我们观察了甲基氢化泼尼松(MP)对Mo-Mφ产生IL-10、IL-12的影响，现报告如下。
对象和方法
一、对象
将符合婴幼儿哮喘诊断标准[1]的30例哮喘住院患儿随机分为两组，MP治疗组15例，男9例，女6例，年龄9个月～3岁，平均2.1岁。对照组15例，男8例，女7例，年龄11个月～2.9岁，平均2.3岁。上述患儿均未用过皮质激素。两组均在用药前和用药后4天采血，即刻分离外周血单个核细胞(PBMC)。
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二、方法
1.治疗方法：患儿入院后对照组用抗感染、β2受体兴奋剂雾化治疗；治疗组在此基础上加用MP(砝玛西亚普强亚洲有限公司产)3 mg/(kg.d)，用5%葡萄糖20 ml稀释后静脉滴注，每天2次，共4天。
2.实验方法：(1)PBMC培养及上清液制备：清晨静脉采血，肝素抗凝，常规无菌分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640调细胞至1.0×106/ml，设自身对照，脂多糖组(LPS 5 μg/ml)，37℃ 5% CO2温箱中培养12小时用于提取总RNA；培养48小时收上清液，贮于-20℃备测。(2)细胞因子检测：采用ELISA方法，所有操作步骤均按说明书进行。IL-10、IL-12检测试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司。(3)提取培养细胞总RNA：采用改良异硫氰酸胍-酚仿一步法[2]，用TRITM试剂盒(Gibco, USA)提取。(4)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：参照文献[3]方法分别测定IL-10和IL-12 mRNA逆转录后的扩增产物量。产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，在紫外光下观察并照像。
, 百拇医药
3.统计学方法：实验结果以
±s表示，组间比较用t检验，组内用药前后比较用配对t检验。结 果
一、MP治疗前后PBMC产生IL-10、IL-12的水平
1.组内比较：MP组用药后PBMC产生IL-10明显减少(P<0.01)；IL-12水平有所降低，但差异无显著意义。对照组治疗前后IL-10、IL-12水平差异无显著意义(表1)。
表1 两组患儿治疗前后PBMC产生IL-10、IL-12
的水平比较(
±s，ng/L) 组别, http://www.100md.com
例数
IL-10
IL-12
治疗前
治疗后
t值
治疗前
治疗后
t值
对照组
15
637±151
621±134
, 百拇医药
0.79
58±15
61±16
0.84
治疗组
15
642±149
452±143
6.67*
60±12
56±11
1.86
两组比较t值
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0.09
3.33*
0.40
0.88
注：* P<0.01
2.组间比较：治疗前两组IL-10、IL-12水平差异无显著意义(P>0.05)，治疗后MP组IL-10水平显著低于对照组，IL-12与对照组差异无显著意义(表1)。
二、MP治疗前后IL-10、IL-12 mRNA表达
在基因转录水平，MP对IL-10、IL-12 mRNA的表达均有一定抑制作用(图1，2),图中左边3条电泳带为MP治疗前3个标本PBMC表达IL-10、IL-12mRNA逆转录扩增的产物,右边3条带为经治疗后相同个体PBMC两因子mRNA表达产物,由图可见,右边扩增产物量较左边减少。
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1.自身对照(无丝裂原)；2.加LPS的IL-10电泳带；3.分子量标准ΦX174HaeⅢ；以3为界，与左边3条IL-10的电泳带比较，右边(治疗后)对应的3条带亮度减弱，中间条带消失
图1 LPS刺激后患儿PBMC IL-10 mRNA的表达(RT-PCR)
1.自身对照(无丝裂原)；2.加LPS的IL-12P40电泳带；3.分子量标准ΦX174HaeⅢ；以3为界，与左边3条IL-12P40的电泳带比较，右边(治疗后)对应的3条带亮度不同程度减弱
图2 LPS刺激后患儿PBMC IL-12P40 mRNA的表达(RT-PCR)
讨 论
有研究表明，T辅助细胞(TH)亚群功能失衡是哮喘免疫发病机理中的重要环节[4]，表现为TH2(以产生IL-4、IL-5、IL-10为主)功能亢进和TH1(产生IFN-γ、IL-2为主)功能不足。由此导致相应细胞因子产生紊乱，参与哮喘速发和迟发相气道变应性炎症。近来研究显示，抗原提呈细胞在TH亚群分化中起重要作用，作为抗原提呈细胞重要成员的Mo-Mφ可能通过分泌IL-10、IL-12而调节TH1/TH2功能[5]。IL-12可诱导T细胞增殖并产生大量IFN-γ[6]，促进TH1型转化，抑制IL-4产生。而IL-10则抑制TH1类细胞因子生成，促进TH2型转化[7]。
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我们曾通过体外LPS刺激PBMC，发现哮喘发作时Mo-Mφ产生IL-12水平低下，而IL-10则显著增高[8]，推测哮喘TH1/TH2失衡可能部分与Mo-Mφ功能异常有关。由于IL-12不足，对TH1的支持减弱，而IL-10增多，诱导TH2功能亢进，最终加剧了TH1/TH2功能失衡。
糖皮质激素是迄今为止治疗哮喘最有效的药物，其抗炎机理尚不十分清楚。 Bentley等[9]用氢化泼尼松治疗哮喘后，患者支气管肺泡灌洗液中表达IL-4、IL-5mRNA的细胞数较对照组明显减少，而表达IFN-γmRNA的细胞数明显增加，与病情改善一致。提示激素可能在TH亚群水平调节TH1/TH2平衡。
为了解激素对Mo-Mφ产生细胞因子的影响，我们观察了MP治疗后哮喘患儿Mo-Mφ分泌IL-10、IL-12的水平及其mRNA表达，发现治疗组用药后，MP在基因转录和蛋白合成两水平对Mo-Mφ产生IL-10有明显的抑制效应，对IL-12的抑制则不明显。由于IL-10受到抑制，促进TH2的作用随之减弱，使哮喘TH1/TH2失衡得到部分纠正。
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上述结果提示激素在抗原提呈细胞水平对哮喘失衡的细胞因子网络有调节作用。由于参与哮喘炎症的细胞因子众多，激素的治疗作用可能还表现在多种靶细胞，不同的免疫调节层次及细胞因子产生的不同环节上。进一步对激素抗炎机理的系统研究，将有助于认识哮喘复杂的炎症本质，对研制更特异有效的药物防治哮喘，将起到积极的促进作用。
参考文献
1 全国儿科哮喘协作组.儿童哮喘诊断标准和治疗常规.中华儿科杂志，1993,31:222-224.
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3 Sandhya LD, Lagoo AS. A standardized approach to PCR-based semiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples. Lymphokine Cytokine Res, 1993,12:59-65.
4 Kline JN, Hunninghake GW. T-lymphocyte dysregulation in asthma. Proc Soc Exp Biol Med, 1994,207:243-253.
5 Hilkens CMV, Snijders A, Snijedwint FGM, et al. Modulation of T-cell cytokine secretion by accessory cell-derived products. Eur Respir J, 1996,9 (Suppl 22):90-95.
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6 Trinchieri G, Scott P. The role of interleukin 12 in the immune response, disease and therapy. Immunol Today, 1994,15:460-463.
7 D′Andrea BA, Amezaga MA, Valiante NM, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon-γ production by suppressing natural killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells. J Exp Med, 1993,178:1041-1048.
8 符州，杨锡强，李成荣，等.婴幼儿哮喘与T辅助细胞亚群功能失衡研究.中华儿科杂志，1998,36:237-239.
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9 Bentley AM, Hamid Q, Robinson DS, et al. Prdnisolone treatment in asthma: reduction in the numbers of eosinophils, T cells, tryptase-only positive mast cells, and modulation of IL-4, IL-5, and interferon-gamma cytokine gene expression within the bronchial mucosa. Am J Respir Crit Care Med, 1996,153:551-556.
(收稿：1998-07-01 修回：1999-02-24), 百拇医药