母乳单个核细胞IL-6、TNF-α分泌水平与新生儿免疫的研究
作者：陈平洋 吴勇 谢宗德
单位：410011 长沙，湖南医科大学第二附属医院儿科(陈平洋、谢宗德)；长沙市妇幼保健院(吴勇)
关键词：乳，人；白细胞，单核；白细胞介素6；肿瘤坏死因子；婴儿，新生
中华儿科杂志990608 【摘要】 目的 探讨母乳单个核细胞IL-6、TNF-α分泌水平及其对新生儿的免疫保护作用。方法 ELISA法测定28例健康产妇不同时期乳汁及其外周静脉血、新生儿脐血活化的单个核细胞培养上清中IL-6、TNF-α浓度。结果 (1)初乳组单个核细胞培养上清IL-6、TNF-α浓度明显高于过渡乳组及脐血组(P<0.05，P<0.01)；(2)母外周静脉血组单个核细胞培养上清IL-6、TNF-α浓度明显高于脐血组和过渡乳组(P<0.05,P<0.001)；(3)初乳组与外周血组，过渡乳组与脐血组IL-6、TNF-α浓度无显著性差异(P>0.05)。结论 母乳单个核细胞经丝裂原激活后可产生IL-6、TNF-α，且以初乳细胞的生成能力最强。新生儿淋巴单核细胞功能低下，如及时给予母乳喂养，可对新生儿产生免疫保护。
, 百拇医药
The expression of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in mononuclear cells of the breast milk and neonatal immune study CHEN Pingyang, WU Yong, XIE Zongde, Department of Pediatrics. The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
【Abstract】 Objective To detect IL-6 and TNF-α productions in mononuclear cells of breast milk and to evaluate the immune protective effects of cytokines in neonates.Methods The productions of IL-6 and TNF-α in cultured mononuclear cells isolated from breast milk of normal puerperants at different times, peripheral blood of postpartum mothers and umbilical cord blood of neonates were measured by ELISA.Results (1) The levels of IL-6 and TNF-α in colostric mononuclear cells (CMNC) were significantly higher than those in transitional milk mononuclear cells (TMMNC, the milk formed after the colostrum) and umbilical cord blood mononuclear cells (UCBMNC, P<0.01). (2) The levels of IL-6 and TNF-α by peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) were significantly higher than those in UCBMNC and TMMNC (P<0.001). (3) There were no differences between the groups of CMNC and PBMNC (P>0.05), as well as TMMNC and UCBMNC (P>0.05).Conclusion Mitogen-stimulated mononuclear cells of the breast milk could produce IL-6 and TNF-α, of which the CMNC was more obvious. Therefore, prompt breast feeding might increase the capacity of immune protection in the neonate of whom usually with poor functions of monocytes and macrophages.
, 百拇医药
【Key words】 Milk, human Leukocytes, mononuclear Interleukin-6 Tumor necrosis factor Infant, newborn
新生儿免疫系统不成熟，淋巴单核细胞功能低下，细胞因子产生不足，是新生儿易患严重感染性疾病的重要原因之一。研究表明：母乳中含有大量免疫活性细胞，经激活后可产生多种细胞因子。母乳喂养可向新生儿传递细胞免疫[1]，通过释放多种细胞因子而发挥抗感染等各种免疫调节作用，对新生儿产生免疫保护。本研究检测了28例健康产妇的初乳、过渡乳中单个核细胞经丝裂原(LPS、PHA)激活后IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌水平，同时与新生儿脐血、母亲外周静脉血作对照，旨在探讨母乳对新生儿抗感染免疫保护作用，为建立爱婴医院、提倡母乳喂养、增强婴幼儿体质提供实验依据。
对象及方法
一、对象
, 百拇医药
选取1997年11月～1998年2月湖南医科大学附属第二医院、长沙市妇幼保健院足月妊娠平产的健康产妇28例。于分娩后1小时内抽取外周静脉血，胎盘娩出前留脐动脉血，于产后2～5天，7～30天分别收集初乳、过渡乳。设置4组分别为初乳组、过渡乳组、新生儿脐血组、母外周血组。产妇年龄差异无显著性差异，妊娠期未患过感染性疾病，未接受任何免疫抑制剂及其它药物治疗，产前无肝炎、结核、肿瘤或自身免疫性疾病病史。新生儿均为正常足月儿，出生体重差异无显著意义，无宫内窘迫或产时窒息。
二、方法
1.单个核细胞悬液的制备：(1) 用消毒的低压吸乳器吸取新鲜乳汁10 ml，Hank′s液稀释，离心20分钟(3 000 r/min)，去脂和上清，再用Hank′s液洗涤3次，然后用Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液分离母乳单个核细胞。(2)抽取母外周静脉血及脐动脉血各5 ml，Hank′s液稀释一倍，淋巴细胞分离液分离血单个核细胞。
, 百拇医药
2.单个核细胞培养上清的收集：加2×106个单个核细胞于24孔细胞培养板孔内，调整完全培养基容量至1ml,分别加LPS 1μg PHA 200μg激活,置CO2细胞培养箱内(5%CO2，37℃)孵育48小时后收集培养上清置-70℃冰箱贮存待测。
3.ELISA法测定IL-6、TNF-α浓度:将稀释好的抗IL-6、TNF-α单克隆包被抗体加入ELISA板，100 μl/孔，4℃，放置48小时后用洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品，阴性对照及倍比稀释的标准品100 μl/孔，37℃2小时洗板3次，分别加入抗IL-6、抗TNF-α酶标抗体100 μl/孔，37℃1小时。洗板3次，加入ABTS显色液，100 μl/孔，37℃显色15～30分钟，用ELISA测定仪测410nm波长滤光片处A值，根据标准曲线求IL-6、TNF-α浓度。
3.统计学处理：数据用均数±标准差(
±s)表示。4组均数差异比较用单因素方差分析和两两比较q检验。两指标间的相关分析用直线相关与回归分析。在所有比较之前，均进行方差齐性检验。因4组IL-6、TNF-α浓度组间方差均不齐，经倒数变换后，达到方差齐性要求再行比较。以双侧P<0.05为显著性检验水准。
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结 果
一、初乳、过渡乳、脐血、母外周血活化的单个核细胞培养上清IL-6测定结果
初乳组IL-6浓度明显高于过渡乳组(P<0.01)及脐血组(P<0.01)；母外周血组IL-6浓度明显高于脐血组(P<0.01)及过渡乳组(PM)(P<0.001)；初乳组与母外周血组、过渡乳组与脐血组IL-6浓度差异无显著意义 (P>0.05)(表1)。
表1 各组培养上清IL-6及TNF-α水平比较(±s) 组 别
例数
IL-6浓度(pg/ml)
TNF-α浓度(pg/ml)
, 百拇医药
初乳组
28
106±29
371±746
过渡乳组
24
64±19*△
90±90*△
脐血组
28
54±8*△
85±84*△
, 百拇医药
母外周血组
16
100±25
484±747
* 表示初乳组与脐血组、过渡乳组比较，P均<0.001
△表示母外周血组与脐血组、过渡乳组比较，P<0.05，P均<0.001
二、初乳、过渡乳、脐血、母外周血活化的单个核细胞培养上清TNF-α测定结果
初乳组TNF-α浓度明显高于过渡乳组及脐血组(P均<0.01)；母外周血组TNF-α浓度明显高于脐血组(P<0.01)及过渡乳组(P<0.001)；初乳组与母外周血组，过渡乳组与脐血组TNF-α浓度比较差异无显著意义(P>0.05)(表1)。
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三、相关分析
直线相关与回归分析示各组IL-6与TNF-α均无相关性(P均>0.05)。初乳组与脐血组IL-6、TNF-α亦无相关性(P均>0.05)。
讨 论
母乳，尤其是初乳中含有大量免疫活性细胞，主要为巨噬细胞(占75%)和淋巴细胞(占25%)[2]。动物实验证明：一次哺乳后,母乳细胞可粘附于肠粘膜上皮达60多小时[3]。推测这些母乳细胞进入新生儿肠道后有足够时间停留，可被肠道中细菌内毒素激活、增殖、分化，释放多种细胞因子如IL-6[4，5]、TNF-α[6]、干扰素(IFN)-γ[7]、Csf[8]等。由于新生儿肠道近端缺乏内源性蛋白水解酶，母乳中又有丰富的抗蛋白酶，α1-抗糜蛋白酶,α1-抗胰蛋白酶等,均可阻止细胞因子水解,利于细胞因子通过多种途径参予新生儿的免疫效应和免疫调节,从而对新生儿产生免疫保护。
, http://www.100md.com
本实验通过ELISA法证实：母乳细胞经脂多糖、植物血凝素激活后可增殖、分化并产生TNF-α,IL-6,且初乳组的诱生水平明显高于过渡乳组,新生儿脐血组的诱生水平仅为母外周血组的1/2,明显降低,提示新生儿淋巴单核细胞功能明显不成熟,免疫能力低下,是新生儿易受各种病原微生物感染的重要原因。TNF-α具有广泛的生物学活性,是机体主要的免疫调节因子[9],IL-6是多功能细胞因子,且与新生儿抗细菌感染免疫密切相关[10]。通过母乳喂养,新生儿可获得足量的免疫活性细胞及其分泌的TNF-α,IL-6，这两种细胞因子能对新生儿免疫系统发挥生物活性作用，多向性调节新生儿机体免疫功能,促进新生儿免疫系统的成熟,从而可预防新生儿严重的病毒、细菌感染。
本研究是检测各组活化的单个核细胞TNF-α,IL-6的分泌水平，而不是直接测定血浆及乳汁中的浓度，这就更直接地反映了IL-6、TNF-α的分泌情况。将不同时期母乳与新生儿脐血、母外周血单个核细胞两种细胞因子的分泌情况同时进行对照比较，这在国内外相关文献中均未见报道。本实验结果从分子免疫学水平强调建立爱婴医院，提倡早期母乳喂养对提高围产儿生存率，增强婴幼儿抗感染抵抗力的重要性，并提供实验依据。但母乳与母外周血细胞因子的关系，母乳细胞因子在新生儿体内发挥免疫保护作用的明确机制尚有待进一步研究。
, http://www.100md.com
志谢 本课题由美赞臣(中国)基金提供赞助，深表谢意
参考文献
1 Hansonl A.Non-breastfeeding the most commor immunodeficiency.Hong Kong J Pediatr,1998,3:5-6.
2 Skansen U, Lindfor A, Andresson U.Cytokine production in mononuclear cells of human milk studied at the single-cell level. Pediatr Res, 1993, 32: 213-215.
3 Jain L, Vidyasagar D, Xanthou M, et al.In vivo distribution of human milk leukocytes after ingestion by newborn baboons. Arch Dis Child, 1989, 64: 930-932.
, 百拇医药
4 Saito S, Maruyama M, Kato Y, et al. Detection of IL-6 in human milk and its involvement in IgA production, J Reprod Immunol, 1991, 20: 261-276.
5 Rudloff HE, Schmalstieg FC, Palkowetz KH, et al. IL-6 in human milk. J Reprod Immunol, 1993, 23: 13-20.
6 Rudloff HE, Schmalstieg FC, Mushtaha AA, et al. Tumor necrosis factor-alpha in human milk. Pediatr Res, 1992; 31: 29-33.
7 崔焱,陈荣华.母乳T淋巴细胞亚群及IFN-γ,IL-8分泌水平的研究.中华儿科杂志,1997,35:424-426.
, 百拇医药
8 Csf G, Mckelvey-martin VJ, Rutherford S,et al. Human milk contains granucocyte colony stimulating factor. Eur J Chin Nutr, 1994, 48: 222-224.
9 夏正坤综述，陈荣华审校.母乳中α-TNF及其临床意义.国外医学儿科学分册，1994, 21： 145-147.
10 Schibler EK, Liechty EW, White Wl, et al.Defective production of interleukin-6 by monocytes:a possible mechanism underlying severed host defes deficiencies of neonates. Pediatr Res,1992,31:18-21.
(收稿：1998-07-23 修回：1999-02-08), 百拇医药
单位：410011 长沙，湖南医科大学第二附属医院儿科(陈平洋、谢宗德)；长沙市妇幼保健院(吴勇)
关键词：乳，人；白细胞，单核；白细胞介素6；肿瘤坏死因子；婴儿，新生
中华儿科杂志990608 【摘要】 目的 探讨母乳单个核细胞IL-6、TNF-α分泌水平及其对新生儿的免疫保护作用。方法 ELISA法测定28例健康产妇不同时期乳汁及其外周静脉血、新生儿脐血活化的单个核细胞培养上清中IL-6、TNF-α浓度。结果 (1)初乳组单个核细胞培养上清IL-6、TNF-α浓度明显高于过渡乳组及脐血组(P<0.05，P<0.01)；(2)母外周静脉血组单个核细胞培养上清IL-6、TNF-α浓度明显高于脐血组和过渡乳组(P<0.05,P<0.001)；(3)初乳组与外周血组，过渡乳组与脐血组IL-6、TNF-α浓度无显著性差异(P>0.05)。结论 母乳单个核细胞经丝裂原激活后可产生IL-6、TNF-α，且以初乳细胞的生成能力最强。新生儿淋巴单核细胞功能低下，如及时给予母乳喂养，可对新生儿产生免疫保护。
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The expression of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in mononuclear cells of the breast milk and neonatal immune study CHEN Pingyang, WU Yong, XIE Zongde, Department of Pediatrics. The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
【Abstract】 Objective To detect IL-6 and TNF-α productions in mononuclear cells of breast milk and to evaluate the immune protective effects of cytokines in neonates.Methods The productions of IL-6 and TNF-α in cultured mononuclear cells isolated from breast milk of normal puerperants at different times, peripheral blood of postpartum mothers and umbilical cord blood of neonates were measured by ELISA.Results (1) The levels of IL-6 and TNF-α in colostric mononuclear cells (CMNC) were significantly higher than those in transitional milk mononuclear cells (TMMNC, the milk formed after the colostrum) and umbilical cord blood mononuclear cells (UCBMNC, P<0.01). (2) The levels of IL-6 and TNF-α by peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) were significantly higher than those in UCBMNC and TMMNC (P<0.001). (3) There were no differences between the groups of CMNC and PBMNC (P>0.05), as well as TMMNC and UCBMNC (P>0.05).Conclusion Mitogen-stimulated mononuclear cells of the breast milk could produce IL-6 and TNF-α, of which the CMNC was more obvious. Therefore, prompt breast feeding might increase the capacity of immune protection in the neonate of whom usually with poor functions of monocytes and macrophages.
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【Key words】 Milk, human Leukocytes, mononuclear Interleukin-6 Tumor necrosis factor Infant, newborn
新生儿免疫系统不成熟，淋巴单核细胞功能低下，细胞因子产生不足，是新生儿易患严重感染性疾病的重要原因之一。研究表明：母乳中含有大量免疫活性细胞，经激活后可产生多种细胞因子。母乳喂养可向新生儿传递细胞免疫[1]，通过释放多种细胞因子而发挥抗感染等各种免疫调节作用，对新生儿产生免疫保护。本研究检测了28例健康产妇的初乳、过渡乳中单个核细胞经丝裂原(LPS、PHA)激活后IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌水平，同时与新生儿脐血、母亲外周静脉血作对照，旨在探讨母乳对新生儿抗感染免疫保护作用，为建立爱婴医院、提倡母乳喂养、增强婴幼儿体质提供实验依据。
对象及方法
一、对象
, 百拇医药
选取1997年11月～1998年2月湖南医科大学附属第二医院、长沙市妇幼保健院足月妊娠平产的健康产妇28例。于分娩后1小时内抽取外周静脉血，胎盘娩出前留脐动脉血，于产后2～5天，7～30天分别收集初乳、过渡乳。设置4组分别为初乳组、过渡乳组、新生儿脐血组、母外周血组。产妇年龄差异无显著性差异，妊娠期未患过感染性疾病，未接受任何免疫抑制剂及其它药物治疗，产前无肝炎、结核、肿瘤或自身免疫性疾病病史。新生儿均为正常足月儿，出生体重差异无显著意义，无宫内窘迫或产时窒息。
二、方法
1.单个核细胞悬液的制备：(1) 用消毒的低压吸乳器吸取新鲜乳汁10 ml，Hank′s液稀释，离心20分钟(3 000 r/min)，去脂和上清，再用Hank′s液洗涤3次，然后用Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液分离母乳单个核细胞。(2)抽取母外周静脉血及脐动脉血各5 ml，Hank′s液稀释一倍，淋巴细胞分离液分离血单个核细胞。
, 百拇医药
2.单个核细胞培养上清的收集：加2×106个单个核细胞于24孔细胞培养板孔内，调整完全培养基容量至1ml,分别加LPS 1μg PHA 200μg激活,置CO2细胞培养箱内(5%CO2，37℃)孵育48小时后收集培养上清置-70℃冰箱贮存待测。
3.ELISA法测定IL-6、TNF-α浓度:将稀释好的抗IL-6、TNF-α单克隆包被抗体加入ELISA板，100 μl/孔，4℃，放置48小时后用洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品，阴性对照及倍比稀释的标准品100 μl/孔，37℃2小时洗板3次，分别加入抗IL-6、抗TNF-α酶标抗体100 μl/孔，37℃1小时。洗板3次，加入ABTS显色液，100 μl/孔，37℃显色15～30分钟，用ELISA测定仪测410nm波长滤光片处A值，根据标准曲线求IL-6、TNF-α浓度。
3.统计学处理：数据用均数±标准差(
±s)表示。4组均数差异比较用单因素方差分析和两两比较q检验。两指标间的相关分析用直线相关与回归分析。在所有比较之前，均进行方差齐性检验。因4组IL-6、TNF-α浓度组间方差均不齐，经倒数变换后，达到方差齐性要求再行比较。以双侧P<0.05为显著性检验水准。, http://www.100md.com
结 果
一、初乳、过渡乳、脐血、母外周血活化的单个核细胞培养上清IL-6测定结果
初乳组IL-6浓度明显高于过渡乳组(P<0.01)及脐血组(P<0.01)；母外周血组IL-6浓度明显高于脐血组(P<0.01)及过渡乳组(PM)(P<0.001)；初乳组与母外周血组、过渡乳组与脐血组IL-6浓度差异无显著意义 (P>0.05)(表1)。
表1 各组培养上清IL-6及TNF-α水平比较(
±s) 组 别例数
IL-6浓度(pg/ml)
TNF-α浓度(pg/ml)
, 百拇医药
初乳组
28
106±29
371±746
过渡乳组
24
64±19*△
90±90*△
脐血组
28
54±8*△
85±84*△
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母外周血组
16
100±25
484±747
* 表示初乳组与脐血组、过渡乳组比较，P均<0.001
△表示母外周血组与脐血组、过渡乳组比较，P<0.05，P均<0.001
二、初乳、过渡乳、脐血、母外周血活化的单个核细胞培养上清TNF-α测定结果
初乳组TNF-α浓度明显高于过渡乳组及脐血组(P均<0.01)；母外周血组TNF-α浓度明显高于脐血组(P<0.01)及过渡乳组(P<0.001)；初乳组与母外周血组，过渡乳组与脐血组TNF-α浓度比较差异无显著意义(P>0.05)(表1)。
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三、相关分析
直线相关与回归分析示各组IL-6与TNF-α均无相关性(P均>0.05)。初乳组与脐血组IL-6、TNF-α亦无相关性(P均>0.05)。
讨 论
母乳，尤其是初乳中含有大量免疫活性细胞，主要为巨噬细胞(占75%)和淋巴细胞(占25%)[2]。动物实验证明：一次哺乳后,母乳细胞可粘附于肠粘膜上皮达60多小时[3]。推测这些母乳细胞进入新生儿肠道后有足够时间停留，可被肠道中细菌内毒素激活、增殖、分化，释放多种细胞因子如IL-6[4，5]、TNF-α[6]、干扰素(IFN)-γ[7]、Csf[8]等。由于新生儿肠道近端缺乏内源性蛋白水解酶，母乳中又有丰富的抗蛋白酶，α1-抗糜蛋白酶,α1-抗胰蛋白酶等,均可阻止细胞因子水解,利于细胞因子通过多种途径参予新生儿的免疫效应和免疫调节,从而对新生儿产生免疫保护。
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本实验通过ELISA法证实：母乳细胞经脂多糖、植物血凝素激活后可增殖、分化并产生TNF-α,IL-6,且初乳组的诱生水平明显高于过渡乳组,新生儿脐血组的诱生水平仅为母外周血组的1/2,明显降低,提示新生儿淋巴单核细胞功能明显不成熟,免疫能力低下,是新生儿易受各种病原微生物感染的重要原因。TNF-α具有广泛的生物学活性,是机体主要的免疫调节因子[9],IL-6是多功能细胞因子,且与新生儿抗细菌感染免疫密切相关[10]。通过母乳喂养,新生儿可获得足量的免疫活性细胞及其分泌的TNF-α,IL-6，这两种细胞因子能对新生儿免疫系统发挥生物活性作用，多向性调节新生儿机体免疫功能,促进新生儿免疫系统的成熟,从而可预防新生儿严重的病毒、细菌感染。
本研究是检测各组活化的单个核细胞TNF-α,IL-6的分泌水平，而不是直接测定血浆及乳汁中的浓度，这就更直接地反映了IL-6、TNF-α的分泌情况。将不同时期母乳与新生儿脐血、母外周血单个核细胞两种细胞因子的分泌情况同时进行对照比较，这在国内外相关文献中均未见报道。本实验结果从分子免疫学水平强调建立爱婴医院，提倡早期母乳喂养对提高围产儿生存率，增强婴幼儿抗感染抵抗力的重要性，并提供实验依据。但母乳与母外周血细胞因子的关系，母乳细胞因子在新生儿体内发挥免疫保护作用的明确机制尚有待进一步研究。
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志谢 本课题由美赞臣(中国)基金提供赞助，深表谢意
参考文献
1 Hansonl A.Non-breastfeeding the most commor immunodeficiency.Hong Kong J Pediatr,1998,3:5-6.
2 Skansen U, Lindfor A, Andresson U.Cytokine production in mononuclear cells of human milk studied at the single-cell level. Pediatr Res, 1993, 32: 213-215.
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, 百拇医药
4 Saito S, Maruyama M, Kato Y, et al. Detection of IL-6 in human milk and its involvement in IgA production, J Reprod Immunol, 1991, 20: 261-276.
5 Rudloff HE, Schmalstieg FC, Palkowetz KH, et al. IL-6 in human milk. J Reprod Immunol, 1993, 23: 13-20.
6 Rudloff HE, Schmalstieg FC, Mushtaha AA, et al. Tumor necrosis factor-alpha in human milk. Pediatr Res, 1992; 31: 29-33.
7 崔焱,陈荣华.母乳T淋巴细胞亚群及IFN-γ,IL-8分泌水平的研究.中华儿科杂志,1997,35:424-426.
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9 夏正坤综述，陈荣华审校.母乳中α-TNF及其临床意义.国外医学儿科学分册，1994, 21： 145-147.
10 Schibler EK, Liechty EW, White Wl, et al.Defective production of interleukin-6 by monocytes:a possible mechanism underlying severed host defes deficiencies of neonates. Pediatr Res,1992,31:18-21.
(收稿：1998-07-23 修回：1999-02-08), 百拇医药