过敏性紫癜外周血单个核细胞CD40 L表达及其干预研究
作者：李秋 杨锡强 李永柏 李欣 刘恩梅 王莉佳
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：紫癜；过敏性；抗原；CD40；环孢菌素；白细胞；单核
中华儿科杂志990605 【摘要】 目的 观察过敏性紫癜(观察组)患儿外周血单个核细胞(PBMC)表达CD40配体(CD40 L)及其干预因素，以期探讨在过敏性紫癜发病机制中的作用并指导临床治疗。方法 用流式细胞技术、ELISA法及单向免疫扩散法检测观察组33例患儿CD40 L阳性细胞率、IL-4、IL-5及IgE、A、G、M,并与对照组(11例)比较。结果 观察组急性性血浆IgA为(1.8±0.5) g/L，IgE为(1 870±1 443) kU/L，PBMC中CD40 L阳性细胞为(8.3±4.2)%，PBMC培养上清中IL-4为(34±24) ng/L，IL-5为(47±40) ng/L；而对照组分别为(1.0±0.5) g/L、(447±323) kU/L、(0.5±0.6)%、(15±5) ng/L、(13±13) ng/L。观察组高于对照组。抗CD4O L单克隆抗体(抗-CD40 L mAb)及环孢菌素A在体外试验中可纠正异常升高的IL-4、IL-5。结论 提示CD40 L的异常表达与过敏性紫癜发病有一定的关系,抗CD40 LmAb及环孢菌素A的体外干预作用预示有潜在的临床治疗前景。
, 百拇医药
The expression of CD40 L in PBMC and the intervention factors in children with Hench-Schnlein purpura LI Qiu, YANG Xiqiang， LI Yongbai, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To observe the CD40 L expression on peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the intervention factors in children with hench-schnlein purpura (HSP), and explore the pathogenesis and possible therapy for HSP.Methods The cells count of CD40 L expression in PBMC were determined by flow cytometry. IgA, IgG, IgM, IgE and IL-4, IL-5 were detected by radial immunodiffusion and ELISA.Results The serum IgA and IgE levels, CD40 L positive cells, and IL-4 and IL-5 levels in the supernatants of cultured PBMC of HSP patients were increased significantly in contrast to the normal controls. The elevated levels of IL-4 and IL-5 in the cultured PBMC could be corrected when anti-CD40 L monoclonal antibody (mAb) or cyclosporin A(CsA) was added in vitro.Conclusion The abnormal expression of CD40 L might relate to the pathogenesis of HSP. Anti-CD40 L mAb and CsA could intervene PBMC of HSP in vitro, which might indicate a possible immunotherapy way for HSP in the future.
, 百拇医药
【Key words】 Purpura, schenlein-hench Antigens, CD40 L Cyclosporin e Leukocytes, mononudeor
CD40配体(CD40 L)属肿瘤坏死因子家族成员之一，主要存在于活化的CD4+T细胞表面，CD40 L与其他细胞表面相应的膜蛋白CD40交联传递信息与T细胞活化、促进抗体生成及炎症反应密切相关。本研究检测了儿童常见血管炎性疾病过敏性紫癜外周血单个核细胞(PBMC)表达CD40 L情况及其相关因素，以期探讨观察组的发病机制并指导临床治疗。
对象和方法
一、研究对象
观察组：确诊急性期过敏性紫癜患儿33例，男20例，女13例；年龄4.8～11.5岁,平均8.5岁。临床上均有典型皮疹，部分有关节和腹部症状及轻微尿检查异常。对照组：选择儿保门诊体检的健康儿童11例，其年龄、性别与观察组相同，无统计学差异。
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二、实验方法
1.血浆IgA、G、M检测:采用单向免疫扩散法检测。IgE检测用ELISA试剂盒(上海第二医科大学附属新华医院提供)，检测值以本室同龄正常儿值为对照。
2.PBMC培养:观察组急性期采血(肝素抗凝)4 ml，立即用淋巴细胞分离液分离PBMC，RPMI 1640(Gibco公司)调细胞浓度为1×106/ml，根据培养液中所加刺激剂和药物不同分以下6组：1组：每1×106/ml细胞加入佛波酯(PMA，Sigma公司)，终浓度10 μg/ml和A23187(Ca2+ ionophore，BM公司)，终浓度1 μg/ml)；2组：在1组的基础上加纯抗人CD40 L单克隆抗体(抗-CD40 LmAb，Pharmingen公司)，终浓度5 μg/ml；3组：在1组的基础上加环孢霉素A(CsA，SaNDOZ公司)终浓度200 ng/ml。上述各组置37℃、5%CO2孵箱培养6～8小时，收集细胞备检CD40 L。对照组方法同1组。4组: 每1×106/ml细胞加植物血凝素(PHA,国产),终浓度100 μg/ml。5组:在4组基础上加抗-CD40 LmAb,终浓度5μg/ml。6组：在4组基础上加CsA，终浓度150μg/ml。
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4～6组置37℃,5%CO2孵箱陪养48小时,收集上清备检IL-4、IL-5。
3.FACS检测CD40 L:将培养6小时的PBMC用0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，加鼠抗人CD40 L-PE(Pharmingen公司)染色(直接染色法)，阴性对照用鼠抗人IgG1-PE, 4℃,30分钟,FACS Calibur,BD公司检测15 000细胞中CD40 L阳性细胞率。
4.IL-4,IL-5检测:ELISA法(深圳晶美公司Genzyme USA试剂盒)。
结 果
一、血浆免疫球蛋白检测(表1)
观察组患儿血浆IgA、IgE水平明显增高，而IgG、IgM略低于对照组。
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表1 各组血浆IgG、IgA、IgM、IgE水平(
±s) 组别
例数
IgG(g/L)
IgA(g/L)
IgM(g/L)
IgE(kU/L)
对照组
60
10.4±2.3
1.0±0.5
1.7±0.5
, 百拇医药
447± 323
观察组
28
10.2±2.7
1.8±0.5
1.2±0.5
1 870±1 443
t值
0.465
3.127
0.871
2.350
, 百拇医药 P值
>0.05
<0.01
>0.05
<0.05
二、CD40 L检测结果(表2)
观察组PBMC表达CD40 L约高于对照组16倍。当加入抗-CD40 mAb及CsA后明显下降。
表2 各组CD40 L阳性细胞率 组 别
例数
CD40L阳性细胞率(%)
t值
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P值
对照组
11
0.5±0.6
5.80
<0.001*
观察组
13
8.3±4.2
7.251
<0.001**
抗-CD40 LmAb+观察组
, 百拇医药
9
0.5±0.7
1.515
>0.05△
CsA+观察组
7
0.3±0.4
7.504
<0.001△△
* 观察组与对照组比较；**观察组与抗-CD40 LmAb+观察组比较；△抗-CD40 LmAb+观察组与GsA+观察组比较；△△观察组与CsA+观察组比较；对照组与抗-CD40 LmAb+观察组与CsA+观察组比较均差异无显著意义 三、观察组PBMC上清中IL-4、IL-5水平(表3)
, 百拇医药
观察组的PBMC上清中IL-4、IL-5水平明显高于对照组(P<0.05)，加入抗-CD40 LmAb恢复正常(P>0.05)，而加入CsA后IL-5水平下降(P>0.05)。
表3 各组PBMC上清中IL-4，IL-5水平(±s, pg/ml) 组 别
IL-4
IL-5
对照组
15±5(13)
13±13(14)
观察组
34±24(15)
, 百拇医药
47±40(16)
抗-CD40 LmAb+观察组
13±5(8)
9±5(9)
CsA+观察组
13±12(6)
t值*
2.72
2.85
t值**
2.37
2.52
, http://www.100md.com
t值△
1.93
注：表中括号内为检测例数
* 对照组与观察组比较P<0.01；**抗-CD40 LmAb+观察组与观察组比较，P<0.05，△ GsA+观察组与观察组比较P>0.05
另：抗-CD40 L mAb+观察组与CsA+观察组两组比较，该两组分别与对照组比较差异均无显著意义(P>0.05)讨 论
过敏性紫癜是儿科常见病，主要病理改变为广泛性血管炎。本病病因及发病机制不清楚,近年有学者提出本病可能与T细胞功能紊乱、免疫球蛋白异常合成有关。既往的研究已证实过敏性紫癜存在血清IgA、IgE、IgG4增高。已知IL-4促进IgE和IgG4分泌，IL-5诱导IgA产生，因此，IgE、IgA增高应与IL-4、IL-5等过度生成有关[1，2]。本研究的结果不但证实了过敏性紫癜患儿存在血浆IgA、IgE增高，而且还进一步发现PBMC产生IL-4、IL-5增多，符合上述观点。过敏性紫癜血清IgA、IgE增高及PBMC分泌IL-4、IL-5增多的具体环节尚不清楚，可能与T、B细胞活化过程中某些共刺激信号的异常产生和传递有关。
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CD40 L为活化CD4+T细胞表面的膜蛋白分子，与B细胞膜上表达的膜蛋白分子CD40交联，可促进B细胞增殖、分化和免疫球蛋白的同种型转换；也诱导T细胞自身的活化，分泌淋巴因子[3，4]。文献报道与过敏性紫癜有类似全身性血管炎病理改变的系统性红斑狼疮(SLE)活动期的PBMC表达CD40 L明显增高，缓解期则降至正常，用抗CD40 L单克隆抗体可体外抑制SLE的PBMC产生自身抗体[5]。本研究发现过敏性紫癜急性期PBMC表达CD40 L也明显高于对照组(16倍)，当加入抗CD40 LmAb后,除CD40 L表达明显下降外，PBMC产生IL-4、IL-5也降至正常，示PBMC过度表达CD40 L可能是诱导过敏性紫癜患儿T细胞活化、细胞因子异常产生、进而致B细胞异常活化或Ig转换障碍的原因之一。
T细胞表达CD40mRNA需要活化T细胞核因子(NF-AT)去磷酸化。免疫抑制剂CsA可以通过作用于Ca2+/钙调蛋白依赖的钙神经蛋白磷酸脂酶的活性，干扰NF-AT的去磷酸化，从而抑制T细胞表达CD40 L[6]。本研究也证实CsA在体外能明显抑制过敏性紫癜患儿的PBMC表达CD40 L，并对PBMC产生IL-5有一定的抑制作用(P<0.05)。抗CD40 LmAb及CsA干预过敏性紫癜患儿PBMC体外异常表达CD40 L及产生细胞因子的研究结果,为今后临床防治过敏性紫癜提供了进一步的实验依据。
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参考文献
1 Robson WL. Henoch-Schonlein purpura. Adv Pediat,1994,14： 163-194.
2 Davin JC, Pierard G, Dechenne C. Possible pathogenic role of IgE in henoch-schonlein purpura. Pediatr Nephrol, 1994，8:169-171.
3 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral portions: activation, costimulation, and death. Cell， 1994，76:959-968.
4 Laman LD,Claassen E, Noelle RJ. Function of CD40 and its ligand, gp39 (CD40 L). Critical Rev Immunol, 1996,16:59-108.
, http://www.100md.com
5 Mehta AD, Lu L, Goldman RR, et al. Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cell in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production. J Clin Invest,1996，97:2063-2073.
6 Fuleihan R, Ramesh N, Homer A, et al. Cyclosporin a inhibits CD40 ligand expression in T lymphocytes. J Clin Invest，1994, 93:1315-1320.
(收稿：1999-01-13 修回：1999-03-19), http://www.100md.com
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：紫癜；过敏性；抗原；CD40；环孢菌素；白细胞；单核
中华儿科杂志990605 【摘要】 目的 观察过敏性紫癜(观察组)患儿外周血单个核细胞(PBMC)表达CD40配体(CD40 L)及其干预因素，以期探讨在过敏性紫癜发病机制中的作用并指导临床治疗。方法 用流式细胞技术、ELISA法及单向免疫扩散法检测观察组33例患儿CD40 L阳性细胞率、IL-4、IL-5及IgE、A、G、M,并与对照组(11例)比较。结果 观察组急性性血浆IgA为(1.8±0.5) g/L，IgE为(1 870±1 443) kU/L，PBMC中CD40 L阳性细胞为(8.3±4.2)%，PBMC培养上清中IL-4为(34±24) ng/L，IL-5为(47±40) ng/L；而对照组分别为(1.0±0.5) g/L、(447±323) kU/L、(0.5±0.6)%、(15±5) ng/L、(13±13) ng/L。观察组高于对照组。抗CD4O L单克隆抗体(抗-CD40 L mAb)及环孢菌素A在体外试验中可纠正异常升高的IL-4、IL-5。结论 提示CD40 L的异常表达与过敏性紫癜发病有一定的关系,抗CD40 LmAb及环孢菌素A的体外干预作用预示有潜在的临床治疗前景。
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The expression of CD40 L in PBMC and the intervention factors in children with Hench-Schnlein purpura LI Qiu, YANG Xiqiang， LI Yongbai, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400014
【Abstract】 Objective To observe the CD40 L expression on peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the intervention factors in children with hench-schnlein purpura (HSP), and explore the pathogenesis and possible therapy for HSP.Methods The cells count of CD40 L expression in PBMC were determined by flow cytometry. IgA, IgG, IgM, IgE and IL-4, IL-5 were detected by radial immunodiffusion and ELISA.Results The serum IgA and IgE levels, CD40 L positive cells, and IL-4 and IL-5 levels in the supernatants of cultured PBMC of HSP patients were increased significantly in contrast to the normal controls. The elevated levels of IL-4 and IL-5 in the cultured PBMC could be corrected when anti-CD40 L monoclonal antibody (mAb) or cyclosporin A(CsA) was added in vitro.Conclusion The abnormal expression of CD40 L might relate to the pathogenesis of HSP. Anti-CD40 L mAb and CsA could intervene PBMC of HSP in vitro, which might indicate a possible immunotherapy way for HSP in the future.
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【Key words】 Purpura, schenlein-hench Antigens, CD40 L Cyclosporin e Leukocytes, mononudeor
CD40配体(CD40 L)属肿瘤坏死因子家族成员之一，主要存在于活化的CD4+T细胞表面，CD40 L与其他细胞表面相应的膜蛋白CD40交联传递信息与T细胞活化、促进抗体生成及炎症反应密切相关。本研究检测了儿童常见血管炎性疾病过敏性紫癜外周血单个核细胞(PBMC)表达CD40 L情况及其相关因素，以期探讨观察组的发病机制并指导临床治疗。
对象和方法
一、研究对象
观察组：确诊急性期过敏性紫癜患儿33例，男20例，女13例；年龄4.8～11.5岁,平均8.5岁。临床上均有典型皮疹，部分有关节和腹部症状及轻微尿检查异常。对照组：选择儿保门诊体检的健康儿童11例，其年龄、性别与观察组相同，无统计学差异。
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二、实验方法
1.血浆IgA、G、M检测:采用单向免疫扩散法检测。IgE检测用ELISA试剂盒(上海第二医科大学附属新华医院提供)，检测值以本室同龄正常儿值为对照。
2.PBMC培养:观察组急性期采血(肝素抗凝)4 ml，立即用淋巴细胞分离液分离PBMC，RPMI 1640(Gibco公司)调细胞浓度为1×106/ml，根据培养液中所加刺激剂和药物不同分以下6组：1组：每1×106/ml细胞加入佛波酯(PMA，Sigma公司)，终浓度10 μg/ml和A23187(Ca2+ ionophore，BM公司)，终浓度1 μg/ml)；2组：在1组的基础上加纯抗人CD40 L单克隆抗体(抗-CD40 LmAb，Pharmingen公司)，终浓度5 μg/ml；3组：在1组的基础上加环孢霉素A(CsA，SaNDOZ公司)终浓度200 ng/ml。上述各组置37℃、5%CO2孵箱培养6～8小时，收集细胞备检CD40 L。对照组方法同1组。4组: 每1×106/ml细胞加植物血凝素(PHA,国产),终浓度100 μg/ml。5组:在4组基础上加抗-CD40 LmAb,终浓度5μg/ml。6组：在4组基础上加CsA，终浓度150μg/ml。
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4～6组置37℃,5%CO2孵箱陪养48小时,收集上清备检IL-4、IL-5。
3.FACS检测CD40 L:将培养6小时的PBMC用0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，加鼠抗人CD40 L-PE(Pharmingen公司)染色(直接染色法)，阴性对照用鼠抗人IgG1-PE, 4℃,30分钟,FACS Calibur,BD公司检测15 000细胞中CD40 L阳性细胞率。
4.IL-4,IL-5检测:ELISA法(深圳晶美公司Genzyme USA试剂盒)。
结 果
一、血浆免疫球蛋白检测(表1)
观察组患儿血浆IgA、IgE水平明显增高，而IgG、IgM略低于对照组。
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表1 各组血浆IgG、IgA、IgM、IgE水平(
±s) 组别例数
IgG(g/L)
IgA(g/L)
IgM(g/L)
IgE(kU/L)
对照组
60
10.4±2.3
1.0±0.5
1.7±0.5
, 百拇医药
447± 323
观察组
28
10.2±2.7
1.8±0.5
1.2±0.5
1 870±1 443
t值
0.465
3.127
0.871
2.350
, 百拇医药 P值
>0.05
<0.01
>0.05
<0.05
二、CD40 L检测结果(表2)
观察组PBMC表达CD40 L约高于对照组16倍。当加入抗-CD40 mAb及CsA后明显下降。
表2 各组CD40 L阳性细胞率 组 别
例数
CD40L阳性细胞率(%)
t值
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P值
对照组
11
0.5±0.6
5.80
<0.001*
观察组
13
8.3±4.2
7.251
<0.001**
抗-CD40 LmAb+观察组
, 百拇医药
9
0.5±0.7
1.515
>0.05△
CsA+观察组
7
0.3±0.4
7.504
<0.001△△
* 观察组与对照组比较；**观察组与抗-CD40 LmAb+观察组比较；△抗-CD40 LmAb+观察组与GsA+观察组比较；△△观察组与CsA+观察组比较；对照组与抗-CD40 LmAb+观察组与CsA+观察组比较均差异无显著意义 三、观察组PBMC上清中IL-4、IL-5水平(表3)
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观察组的PBMC上清中IL-4、IL-5水平明显高于对照组(P<0.05)，加入抗-CD40 LmAb恢复正常(P>0.05)，而加入CsA后IL-5水平下降(P>0.05)。
表3 各组PBMC上清中IL-4，IL-5水平(
±s, pg/ml) 组 别IL-4
IL-5
对照组
15±5(13)
13±13(14)
观察组
34±24(15)
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47±40(16)
抗-CD40 LmAb+观察组
13±5(8)
9±5(9)
CsA+观察组
13±12(6)
t值*
2.72
2.85
t值**
2.37
2.52
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t值△
1.93
注：表中括号内为检测例数
* 对照组与观察组比较P<0.01；**抗-CD40 LmAb+观察组与观察组比较，P<0.05，△ GsA+观察组与观察组比较P>0.05
另：抗-CD40 L mAb+观察组与CsA+观察组两组比较，该两组分别与对照组比较差异均无显著意义(P>0.05)讨 论
过敏性紫癜是儿科常见病，主要病理改变为广泛性血管炎。本病病因及发病机制不清楚,近年有学者提出本病可能与T细胞功能紊乱、免疫球蛋白异常合成有关。既往的研究已证实过敏性紫癜存在血清IgA、IgE、IgG4增高。已知IL-4促进IgE和IgG4分泌，IL-5诱导IgA产生，因此，IgE、IgA增高应与IL-4、IL-5等过度生成有关[1，2]。本研究的结果不但证实了过敏性紫癜患儿存在血浆IgA、IgE增高，而且还进一步发现PBMC产生IL-4、IL-5增多，符合上述观点。过敏性紫癜血清IgA、IgE增高及PBMC分泌IL-4、IL-5增多的具体环节尚不清楚，可能与T、B细胞活化过程中某些共刺激信号的异常产生和传递有关。
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CD40 L为活化CD4+T细胞表面的膜蛋白分子，与B细胞膜上表达的膜蛋白分子CD40交联，可促进B细胞增殖、分化和免疫球蛋白的同种型转换；也诱导T细胞自身的活化，分泌淋巴因子[3，4]。文献报道与过敏性紫癜有类似全身性血管炎病理改变的系统性红斑狼疮(SLE)活动期的PBMC表达CD40 L明显增高，缓解期则降至正常，用抗CD40 L单克隆抗体可体外抑制SLE的PBMC产生自身抗体[5]。本研究发现过敏性紫癜急性期PBMC表达CD40 L也明显高于对照组(16倍)，当加入抗CD40 LmAb后,除CD40 L表达明显下降外，PBMC产生IL-4、IL-5也降至正常，示PBMC过度表达CD40 L可能是诱导过敏性紫癜患儿T细胞活化、细胞因子异常产生、进而致B细胞异常活化或Ig转换障碍的原因之一。
T细胞表达CD40mRNA需要活化T细胞核因子(NF-AT)去磷酸化。免疫抑制剂CsA可以通过作用于Ca2+/钙调蛋白依赖的钙神经蛋白磷酸脂酶的活性，干扰NF-AT的去磷酸化，从而抑制T细胞表达CD40 L[6]。本研究也证实CsA在体外能明显抑制过敏性紫癜患儿的PBMC表达CD40 L，并对PBMC产生IL-5有一定的抑制作用(P<0.05)。抗CD40 LmAb及CsA干预过敏性紫癜患儿PBMC体外异常表达CD40 L及产生细胞因子的研究结果,为今后临床防治过敏性紫癜提供了进一步的实验依据。
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参考文献
1 Robson WL. Henoch-Schonlein purpura. Adv Pediat,1994,14： 163-194.
2 Davin JC, Pierard G, Dechenne C. Possible pathogenic role of IgE in henoch-schonlein purpura. Pediatr Nephrol, 1994，8:169-171.
3 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral portions: activation, costimulation, and death. Cell， 1994，76:959-968.
4 Laman LD,Claassen E, Noelle RJ. Function of CD40 and its ligand, gp39 (CD40 L). Critical Rev Immunol, 1996,16:59-108.
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5 Mehta AD, Lu L, Goldman RR, et al. Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cell in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production. J Clin Invest,1996，97:2063-2073.
6 Fuleihan R, Ramesh N, Homer A, et al. Cyclosporin a inhibits CD40 ligand expression in T lymphocytes. J Clin Invest，1994, 93:1315-1320.
(收稿：1999-01-13 修回：1999-03-19), http://www.100md.com