小鼠急性CVB3m心肌炎细胞免疫改变及rIL-2免疫干预的研究
作者：寇秀静 叶鸿瑁 崔小岱 呼守生
单位：100083 北京医科大学第三临床医院儿科(寇秀静、叶鸿瑁)；北京首都儿科研究所(崔小岱、呼守生)
关键词：小鼠；心肌炎；T淋巴细胞亚群；白细胞介素2；柯萨奇病毒B组
中华儿科杂志990714 【摘要】 目的 探讨病毒性心肌炎小鼠细胞免疫的发病机理及早期给予重组白细胞介素2(rIL-2)在心肌炎中的作用。方法 以柯萨奇病毒B3亲心肌变异株(CVB3m)诱导的BALB/c心肌炎小鼠为研究对象，观察小鼠脾脏T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞(NK)活性随病程的动态变化以及早期(0～5天)应用rIL-2治疗后上述指标的变化情况；并利用光镜观察了小鼠心脏及其它脏器的损伤情况。结果 小鼠感染CVB3m后脾脏T淋巴细胞各亚群普遍下降，L3T+4/Lyt+2上升，NK细胞活性一过性升高；而rIL-2治疗组L3T+4、Lyt+2、L3T+4/Lyt+2与正常对照组小鼠差异无显著意义，NK细胞活性于感染后24小时迅速达高峰并持续在高水平。未治疗组小鼠病死率为34%，rIL-2治疗组为12%。结论 细胞免疫在心肌炎发病中起重要作用。病毒性心肌炎早期应用rIL-2，可减轻心肌损害，降低感染动物的病死率，从而有效改善预后，为免疫治疗在心肌炎临床的应用提供了可能性。
, 百拇医药
The study of cell immunology and rIL-2 treatment in murine CVB3m myocarditis KOU Xiujing*, YE Hongmao, CUI Xiaodai, et al.* Department of Pediatrics, Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To explore the cell immunologic mechanism of viral myocarditis and determine the effects of rIL-2 on CVB3 infected Balb/c mice.Methods The spleen T lymphocyte subsets and NK cell activities in BALB/c mice with CVB3 myocarditis were observed, and compared with CVB3 myocarditis mice treated with rIL-2.Results After the mice were infected with CVB3 the mice spleen T llymphocyte subsets decreased，L3T+4/Lyt+2 increased and NK cell activitis elevated temporarily. However, the levels of L3T+4, Lyt+2 and L3T+4/Lyt+2 in myocarditis mice treated with rIL-2 were not different from controls. The NK cell activity in mice 24 hrs after infection reached the peak and steady level rapidly. The mortalities of myocarditis mice with and without treatments were 12% and 34%, respectively.Conclusion The cell immunology plays an important role in the pathogeneses of virus-induced myocarditis. The application of rIL-2 in the earle stage could decrease the lesions and mortality of CVB3 myocarditis.
, 百拇医药
【Key words】 Mice Myocarditis T-lymphocyte subsets Interleukin-2 Coxsackieviruses B
细胞免疫机制是病毒性心肌炎发病机理中的重要部分。本研究对小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)急性心肌炎模型进行相关免疫指标的检测，并应用重组白细胞介素2(rIL-2)进行早期免疫干预。旨在从动物实验方面进一步探讨病毒性心肌炎发病机理的免疫机制，并提出急性病毒性心肌炎早期免疫治疗的可能性。
材料和方法
一、实验动物及病毒
1.实验动物：BALB/c雄鼠，6～8周龄，体重16～18 g。中国医学科学院动物所提供。
2.病毒：柯萨奇B3亲心肌病毒株(CVB3m，Nacy变株)，滴度为2×103 Pfu/ml。
, 百拇医药
3.主要试剂：rIL-2 (批号950725，Sunshine 公司)，大鼠抗小鼠L3T4、Lyt2单抗及兔抗大鼠FITC荧光抗体(北京医科大学免疫室提供)，MTT(Fluka公司)，L929细胞(中国医学科学院病毒所提供)。
二、实验方法
1.小鼠CVB3m急性心肌炎模型的建立：经腹腔注射CVB3m，2×103 Pfu/ml，0.3 ml/只。
2.动物分组及用药：6～8周龄，雄性BALB/c小鼠224只，随机分为A、B、C、D四组。其中A、B两组饲养于感染室；C、D组饲养于洁净室。A组(未治组)：100只。每只经腹腔注射CVB3m 0.3 ml。感染CVB3m后0～5天，每只每日经背部皮下不同点注射注射用水0.1 ml/只。B组(rIL-2治疗组)：100只。经腹腔注射CVB3m 0.3 ml。感染CVB3m后0～5天，每只每日经背部皮下不同点注射以注射用水稀释的rIL-2，0.1 ml[5万U/day]。该剂量实验动物可以耐受，而且也最有效[1]。C组(正常组)：12只正常BALB/c小鼠。D组(正常给药组)：12只正常BALB/c小鼠，与A、B两组同时每只每日经背部皮下注射rIL-2，5万U/d。
, 百拇医药
3.标本的留取：A、B组分别于感染后1、10、14、21天随机各活杀6只，3、5、7天随机各活杀12只，断颈处死，留取标本。其中1、3、5、7天各6只同时检测脾脏自然杀伤细胞(NK)细胞活性；3、5、7、10、14、21天各6只取脾检测T淋巴细胞亚群；死亡动物随时留取脏器做病理。A、B两组动物(各100只)中，除病死小鼠及活杀检测NK细胞活性及T细胞亚群者外，剩余动物继续观察至感染后21天，以观察病死率。C组各6只分别用于检测NK细胞活性及T细胞亚群；D组分别于注射rIL-2后5、10天留取标本。对A、B两组7 ～10天死亡和活杀小鼠的心肌进行病理积分。心肌病理积分标准[1]：1级(mild)，1或2个小病灶；2级(slight)，数个小病灶；3级(moderate)，多个小病灶或严重的大病灶；4级(severe)，多个大病灶，弥漫性浸润或坏死。
4.小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的检测：采用免疫荧光法。
5.小鼠脾脏NK细胞活性的测定：采用MTT法，NK细胞活性以NK细胞毒的%表示：
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NK细胞毒(%)=
×100%。
6.统计学处理：本实验中计量资料结果以均数±标准差表示，采用方差分析；计数资料用卡方检验；病理积分应用非参数秩和检验。
结 果
一、小鼠急性CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组病死率的比较
两组小鼠21天病死率进行统计学比较，治疗组为12%(12/100)，低于未治组的34%(34/100)，差异有非常显著意义(χ2=6.832，P<0.01，图1)。
图1 rIL-2治疗组与未治组病死率比较
, http://www.100md.com
本实验中12例正常对照及作为给药对照的12只给予rIL-2的正常小鼠，在整个观察期内无任何症状，无死亡。
二、心肌病理改变的比较
心肌组织病理：治疗组感染后心肌组织炎性细胞浸润及坏死轻于未治组，对两组7～10天病死和活杀小鼠心肌病理进行积分，治疗组浸润和坏死灶积分均低于未治组(表1)。
表1 rIL-2治疗组与未治疗组心肌病理积分比较(分) 组别
鼠数(只)
炎性细胞浸润灶
坏死灶
中位积分
范围
, 百拇医药
中位积分
范围
治疗组
26
1
0～4
1
0～4
未治组
33
2
0～4
2
0～4
, 百拇医药
秩和检验t值
2.257
2.561
P值
<0.05
<0.05
三、T淋巴细胞亚群在小鼠CVB3m心肌炎的改变及其在rIL-2治疗组与正常组间的比较
未治组感染后3天，脾脏L3T+4及Lyt+2细胞均明显下降，7天达低谷。此后均有不同程度的回升，L3T+4/Lyt+2于第5天开始升高，第7天达高峰后逐渐回降，至第21天仍高于正常对照，但差异无显著性；rIL-2治疗组CVB3m感染后，L3T+4及Lyt+2细胞下降，L3T+4/Lyt+2升高，但与正常组相比差异均无显著性(表2)。
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表2 小鼠CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组T淋巴细胞亚群的比较(
±s) 感染后
天数
鼠数(只)
T3T+4(%)
t值
Lyt+2(%)
t值
L3T+4/Lyt+2
, http://www.100md.com
t值
未治组
治疗组
未治组
治疗组
未治组
治疗组
未治组
治疗组
0*
6
27.5±3.5
17.1±3.3
, http://www.100md.com
1.6±0.2
3
6
6
17.8±2.7**
30.7±4.1△
6.521
10.5±3.1**
18.0±3.3△
4.039
1.9±0.8
, 百拇医药
1.7±0.2
0.343
5
6
6
16.8±3.0**
28.2±4.3△
5.303
9.3±2.4**
17.7±3.3△
5.148
, 百拇医药 1.9±0.5
1.6±0.2
1.092
7
6
6
20.2±4.9△△
24.7±4.3
1.694
6.9±1.9**
13.7±2.9△
4.848
, 百拇医药
3.1±0.9**
1.9±0.4#
2.913
10
6
6
19.7±3.0**
25.8±4.3#
2.813
14.1±2.7**
2.3±0.7#
, 百拇医药
2.745
2.3±0.7△△
1.8±0.2
1.677
14
6
6
20.5±4.4△△
26.4±4.3#
2.356
8.8±2.0**
, http://www.100md.com 15.1±2.6△
4.660
2.4±0.7△△
1.8±0.3
2.176
21
6
6
24.2±4.8
26.8±4.9
0.950
12.7±2.7△△
, http://www.100md.com
16.3±2.9
2.148
2.0±0.5
1.7±0.1
1.605
F值
5.55
1.26
8.95
1.93
3.19
0.70
P值
, 百拇医药
<0.01
>0.05
<0.01
>0.05
<0.05
>0.05
注：*为未感染CVB3m的正常对照组；与正常组相比：**P<0.01，△△P<0.05；与未治组比：△P<0.01，#P>0.05 四、NK细胞活性在小鼠急性CVB3m心肌炎的变化及其在rIL-2治疗组与正常组的比较
未治疗组小鼠感染后24小时，脾脏NK细胞活性缓慢升高，第3天达高峰后迅速回落，第7天降至感染前水平；治疗组小鼠感染后NK细胞活性迅速升高，24小时即达高峰，并持续高水平，至第7天仍高于正常对照组(P<0.01)(表3)。
, 百拇医药
表3 小鼠急性CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组NK细胞活性的比较 感染后
天数
鼠数(只)
NK细胞活性(±s，%)
t值
未治组
治疗组
未治组
治疗组
0*
, 百拇医药
6
20.4±6.5
1
6
6
22.9±8.5
39.6±1.1**△
4.739
3
6
6
44.3±5.4**
, http://www.100md.com 37.5±7.7**
1.526
5
6
6
26.3±7.0
37.1±7.3**△△
2.627
7
6
6
21.7±8.4
, http://www.100md.com 34.6±6.7**△△
2.943
F值
10.16
8.94
P值
<0.01
<0.01
注：同表2
讨 论
一、小鼠CVB3m急性病毒性心肌炎中免疫状况的分析
本实验结果可能的原因：(1)病毒性心肌炎时，机体将抗原递呈给免疫系统，随着病毒侵入心脏，损害心肌细胞T淋巴细胞向心脏转移，从而外周血各亚群细胞减少[2]；极期心肌炎性部位以Lyt+2细胞浸润为主，也是外周Lyt+2细胞减少更为显著，L3T+4/Lyt+2升高的可能原因之一[3]。(2)CVB3m感染时免疫器官的受累部位主要为T细胞的分布区[4]，因此，机体T淋巴细胞普遍减少，外周血T淋巴细胞各亚群也相应减少。(3)白细胞介素2(IL-2)活性的下降及淋巴细胞膜白细胞介素2受体(IL-2R)表达的减低，可能是导致T淋巴细胞亚群普遍降低的重要因素之一。
, 百拇医药
在病毒感染的早期，NK细胞在杀伤受染细胞、清除病毒等方面起着重要作用。有研究发现，小鼠在感染急性期，外周血和脾脏中NK细胞明显增多，同时在受损心肌中也可见NK细胞浸润[2]。本研究中，未治组NK细胞活性感染后第1天增高，第3天达高峰后开始回落，第7天已降至正常。在感染急性期，NK细胞活性的短暂升高及在心肌组织中的出现，其作用主要是破坏、吞噬受染的心肌细胞，清除病毒，对机体起非特异性保护作用。
二、rIL-2免疫干预后小鼠免疫状况的变化
本实验小鼠的心肌病理改变显示，rIL-2治疗组心肌炎性细胞浸润及坏死均较同期未治组轻；14～21天，心肌纤维化也少于未治组。因此，可以得出结论：在BALB/c小鼠急性CVB3m心肌炎中，早期应用rIL-2可改善心肌受损情况，减少后遗症，有效降低病死率。其可能的机理是：(1)rIL-2加强NK细胞活性。实验中治疗组NK细胞活性升高早，高水平持续时间长，从而能迅速、有效地清除循环中及进入心肌的病毒。一方面可减少病毒对心肌细胞的直接损害；另一方面，病毒快速有效的被清除，可避免与病毒相关的抗原或被改变的自身抗原的持续暴露，并可避免由此而诱导出的针对这些抗原的体液免疫和细胞免疫的产生，从而避免了因此而造成的心肌损害的渐进性发展。(2)在病毒性心肌炎动物模型的心肌组织中，可分离出两类具有不同杀伤特性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)[5]，主要溶解未感染心肌细胞的自身反应性CTL(ACTL，表面抗原为L3T-4、Lyt+2的T杀伤细胞)和以杀伤感染心肌细胞为主的病毒特异性CTL(VCTL，表面抗原为L3T+4、Lyt-2)；VCTL的反应依赖rIL-2，而ACTL的产生与IL-2无关。实验结果显示，rIL-2治疗组脾脏L3T+4和Lyt+2细胞均较未治组升高，但L3T+4/Lyt+2下降，与正常组无明显差异。由此可以推论，rIL-2一方面可矫正机体细胞免疫的紊乱，减少病毒诱导的机体异常免疫反应，改善心肌受损情况；另一方面可诱导CTL前体成熟为VCTL，杀伤感染的心肌细胞，使病毒失去复制环境，从而终止病毒感染。(3)rIL-2还可诱生干扰素(IFN)，协同杀伤病毒。(4)心肌组织的再生能力弱，坏死病灶最终几乎为纤维化及瘢痕组织所取代。因此病毒性心肌炎的预后在很大程度上与急性期坏死病灶的广泛程度有关。rIL-2治疗组在病毒感染极期，小鼠心肌坏死灶及炎性细胞浸润均明显轻于未治组，后期心肌纤维化也少于未治组。可以认为，由于早期应用rIL-2可减轻心肌病理改变，因而可有效改善预后。
, 百拇医药
总之，在病毒性心肌炎早期应用rIL-2可改善心肌病理改变，减少炎性细胞浸润，降低病死率，对心肌细胞有保护作用。
近年来，国外一些学者尝试运用rIL-2治疗某些病毒感染性疾病，并已成功地用于治疗慢性活动性EB病毒感染。本研究结果提出了rIL-2在心肌炎病毒流行时，心肌炎预防及早期治疗的可能性。但由于rIL-2有一定的副作用，大剂量应用可产生毛细血管渗漏综合征等[6]，而使其临床应用受到了一定的限制。但本研究中CVB3感染的rIL-2治疗组及12只给药的正常小鼠均无上述副作用。我们认为，只要给药的剂量及时机适当，可较好地避免rIL-2的副作用，有望更好地服务于临床。但在病毒性心肌炎中如何适时、适量地应用rIL-2，尚需进一步探讨。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39570744)
参考文献
, 百拇医药
1 Chiharu K, Yoshito K, Hiraoka YJ, et al. Cytokine and murine coxsackievirus B3 myocarditis:interleukine-2 suppressed myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the subsequent stage. Circulation,1994,89:2836-2842.
2 Chiharu K, Takashi M, Clyde S, et al. Serial immunologic identification of lymphocyte subsets in murine coxsackievirus B3 myocarditis: different kinetics and significance of lymphocyts in the heart and in peripheral blood. Circulation, 1988,77:643-653.
, 百拇医药
3 沈茜，汪美先，章同体.小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎淋巴细胞亚群与NK细胞活性免疫组化研究.中华微生物和免疫学杂志，1992，12:329-332.
4 林久治，冯雪莲，吴莎，等.小鼠柯萨奇B3病毒感染对胸腺等免疫器官的影响.中华病理学杂志，1988，17：63.
5 Huber SA, Patricia A. Coxsackievirus B3 myocarditis in BALB/c mice: evidence for autoimmunity to myocyte antigens. Am J Pathol, 1984,116:21-25.
6 Zhang J，Yu Z，Stephen L, et al. Cardiotocity of human recombinant interleukin-2 in rats. A morphological study. Circulation，1993,87:1340-1353.
(收稿：1998-05-25 修回：1998-12-08), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三临床医院儿科(寇秀静、叶鸿瑁)；北京首都儿科研究所(崔小岱、呼守生)
关键词：小鼠；心肌炎；T淋巴细胞亚群；白细胞介素2；柯萨奇病毒B组
中华儿科杂志990714 【摘要】 目的 探讨病毒性心肌炎小鼠细胞免疫的发病机理及早期给予重组白细胞介素2(rIL-2)在心肌炎中的作用。方法 以柯萨奇病毒B3亲心肌变异株(CVB3m)诱导的BALB/c心肌炎小鼠为研究对象，观察小鼠脾脏T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞(NK)活性随病程的动态变化以及早期(0～5天)应用rIL-2治疗后上述指标的变化情况；并利用光镜观察了小鼠心脏及其它脏器的损伤情况。结果 小鼠感染CVB3m后脾脏T淋巴细胞各亚群普遍下降，L3T+4/Lyt+2上升，NK细胞活性一过性升高；而rIL-2治疗组L3T+4、Lyt+2、L3T+4/Lyt+2与正常对照组小鼠差异无显著意义，NK细胞活性于感染后24小时迅速达高峰并持续在高水平。未治疗组小鼠病死率为34%，rIL-2治疗组为12%。结论 细胞免疫在心肌炎发病中起重要作用。病毒性心肌炎早期应用rIL-2，可减轻心肌损害，降低感染动物的病死率，从而有效改善预后，为免疫治疗在心肌炎临床的应用提供了可能性。
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The study of cell immunology and rIL-2 treatment in murine CVB3m myocarditis KOU Xiujing*, YE Hongmao, CUI Xiaodai, et al.* Department of Pediatrics, Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To explore the cell immunologic mechanism of viral myocarditis and determine the effects of rIL-2 on CVB3 infected Balb/c mice.Methods The spleen T lymphocyte subsets and NK cell activities in BALB/c mice with CVB3 myocarditis were observed, and compared with CVB3 myocarditis mice treated with rIL-2.Results After the mice were infected with CVB3 the mice spleen T llymphocyte subsets decreased，L3T+4/Lyt+2 increased and NK cell activitis elevated temporarily. However, the levels of L3T+4, Lyt+2 and L3T+4/Lyt+2 in myocarditis mice treated with rIL-2 were not different from controls. The NK cell activity in mice 24 hrs after infection reached the peak and steady level rapidly. The mortalities of myocarditis mice with and without treatments were 12% and 34%, respectively.Conclusion The cell immunology plays an important role in the pathogeneses of virus-induced myocarditis. The application of rIL-2 in the earle stage could decrease the lesions and mortality of CVB3 myocarditis.
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【Key words】 Mice Myocarditis T-lymphocyte subsets Interleukin-2 Coxsackieviruses B
细胞免疫机制是病毒性心肌炎发病机理中的重要部分。本研究对小鼠柯萨奇病毒B3(CVB3)急性心肌炎模型进行相关免疫指标的检测，并应用重组白细胞介素2(rIL-2)进行早期免疫干预。旨在从动物实验方面进一步探讨病毒性心肌炎发病机理的免疫机制，并提出急性病毒性心肌炎早期免疫治疗的可能性。
材料和方法
一、实验动物及病毒
1.实验动物：BALB/c雄鼠，6～8周龄，体重16～18 g。中国医学科学院动物所提供。
2.病毒：柯萨奇B3亲心肌病毒株(CVB3m，Nacy变株)，滴度为2×103 Pfu/ml。
, 百拇医药
3.主要试剂：rIL-2 (批号950725，Sunshine 公司)，大鼠抗小鼠L3T4、Lyt2单抗及兔抗大鼠FITC荧光抗体(北京医科大学免疫室提供)，MTT(Fluka公司)，L929细胞(中国医学科学院病毒所提供)。
二、实验方法
1.小鼠CVB3m急性心肌炎模型的建立：经腹腔注射CVB3m，2×103 Pfu/ml，0.3 ml/只。
2.动物分组及用药：6～8周龄，雄性BALB/c小鼠224只，随机分为A、B、C、D四组。其中A、B两组饲养于感染室；C、D组饲养于洁净室。A组(未治组)：100只。每只经腹腔注射CVB3m 0.3 ml。感染CVB3m后0～5天，每只每日经背部皮下不同点注射注射用水0.1 ml/只。B组(rIL-2治疗组)：100只。经腹腔注射CVB3m 0.3 ml。感染CVB3m后0～5天，每只每日经背部皮下不同点注射以注射用水稀释的rIL-2，0.1 ml[5万U/day]。该剂量实验动物可以耐受，而且也最有效[1]。C组(正常组)：12只正常BALB/c小鼠。D组(正常给药组)：12只正常BALB/c小鼠，与A、B两组同时每只每日经背部皮下注射rIL-2，5万U/d。
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3.标本的留取：A、B组分别于感染后1、10、14、21天随机各活杀6只，3、5、7天随机各活杀12只，断颈处死，留取标本。其中1、3、5、7天各6只同时检测脾脏自然杀伤细胞(NK)细胞活性；3、5、7、10、14、21天各6只取脾检测T淋巴细胞亚群；死亡动物随时留取脏器做病理。A、B两组动物(各100只)中，除病死小鼠及活杀检测NK细胞活性及T细胞亚群者外，剩余动物继续观察至感染后21天，以观察病死率。C组各6只分别用于检测NK细胞活性及T细胞亚群；D组分别于注射rIL-2后5、10天留取标本。对A、B两组7 ～10天死亡和活杀小鼠的心肌进行病理积分。心肌病理积分标准[1]：1级(mild)，1或2个小病灶；2级(slight)，数个小病灶；3级(moderate)，多个小病灶或严重的大病灶；4级(severe)，多个大病灶，弥漫性浸润或坏死。
4.小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的检测：采用免疫荧光法。
5.小鼠脾脏NK细胞活性的测定：采用MTT法，NK细胞活性以NK细胞毒的%表示：
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NK细胞毒(%)=
×100%。6.统计学处理：本实验中计量资料结果以均数±标准差表示，采用方差分析；计数资料用卡方检验；病理积分应用非参数秩和检验。
结 果
一、小鼠急性CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组病死率的比较
两组小鼠21天病死率进行统计学比较，治疗组为12%(12/100)，低于未治组的34%(34/100)，差异有非常显著意义(χ2=6.832，P<0.01，图1)。
图1 rIL-2治疗组与未治组病死率比较
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本实验中12例正常对照及作为给药对照的12只给予rIL-2的正常小鼠，在整个观察期内无任何症状，无死亡。
二、心肌病理改变的比较
心肌组织病理：治疗组感染后心肌组织炎性细胞浸润及坏死轻于未治组，对两组7～10天病死和活杀小鼠心肌病理进行积分，治疗组浸润和坏死灶积分均低于未治组(表1)。
表1 rIL-2治疗组与未治疗组心肌病理积分比较(分) 组别
鼠数(只)
炎性细胞浸润灶
坏死灶
中位积分
范围
, 百拇医药
中位积分
范围
治疗组
26
1
0～4
1
0～4
未治组
33
2
0～4
2
0～4
, 百拇医药
秩和检验t值
2.257
2.561
P值
<0.05
<0.05
三、T淋巴细胞亚群在小鼠CVB3m心肌炎的改变及其在rIL-2治疗组与正常组间的比较
未治组感染后3天，脾脏L3T+4及Lyt+2细胞均明显下降，7天达低谷。此后均有不同程度的回升，L3T+4/Lyt+2于第5天开始升高，第7天达高峰后逐渐回降，至第21天仍高于正常对照，但差异无显著性；rIL-2治疗组CVB3m感染后，L3T+4及Lyt+2细胞下降，L3T+4/Lyt+2升高，但与正常组相比差异均无显著性(表2)。
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表2 小鼠CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组T淋巴细胞亚群的比较(
±s) 感染后天数
鼠数(只)
T3T+4(%)
t值
Lyt+2(%)
t值
L3T+4/Lyt+2
, http://www.100md.com
t值
未治组
治疗组
未治组
治疗组
未治组
治疗组
未治组
治疗组
0*
6
27.5±3.5
17.1±3.3
, http://www.100md.com
1.6±0.2
3
6
6
17.8±2.7**
30.7±4.1△
6.521
10.5±3.1**
18.0±3.3△
4.039
1.9±0.8
, 百拇医药
1.7±0.2
0.343
5
6
6
16.8±3.0**
28.2±4.3△
5.303
9.3±2.4**
17.7±3.3△
5.148
, 百拇医药 1.9±0.5
1.6±0.2
1.092
7
6
6
20.2±4.9△△
24.7±4.3
1.694
6.9±1.9**
13.7±2.9△
4.848
, 百拇医药
3.1±0.9**
1.9±0.4#
2.913
10
6
6
19.7±3.0**
25.8±4.3#
2.813
14.1±2.7**
2.3±0.7#
, 百拇医药
2.745
2.3±0.7△△
1.8±0.2
1.677
14
6
6
20.5±4.4△△
26.4±4.3#
2.356
8.8±2.0**
, http://www.100md.com 15.1±2.6△
4.660
2.4±0.7△△
1.8±0.3
2.176
21
6
6
24.2±4.8
26.8±4.9
0.950
12.7±2.7△△
, http://www.100md.com
16.3±2.9
2.148
2.0±0.5
1.7±0.1
1.605
F值
5.55
1.26
8.95
1.93
3.19
0.70
P值
, 百拇医药
<0.01
>0.05
<0.01
>0.05
<0.05
>0.05
注：*为未感染CVB3m的正常对照组；与正常组相比：**P<0.01，△△P<0.05；与未治组比：△P<0.01，#P>0.05 四、NK细胞活性在小鼠急性CVB3m心肌炎的变化及其在rIL-2治疗组与正常组的比较
未治疗组小鼠感染后24小时，脾脏NK细胞活性缓慢升高，第3天达高峰后迅速回落，第7天降至感染前水平；治疗组小鼠感染后NK细胞活性迅速升高，24小时即达高峰，并持续高水平，至第7天仍高于正常对照组(P<0.01)(表3)。
, 百拇医药
表3 小鼠急性CVB3m心肌炎rIL-2治疗组与未治组NK细胞活性的比较 感染后
天数
鼠数(只)
NK细胞活性(
±s，%)t值
未治组
治疗组
未治组
治疗组
0*
, 百拇医药
6
20.4±6.5
1
6
6
22.9±8.5
39.6±1.1**△
4.739
3
6
6
44.3±5.4**
, http://www.100md.com 37.5±7.7**
1.526
5
6
6
26.3±7.0
37.1±7.3**△△
2.627
7
6
6
21.7±8.4
, http://www.100md.com 34.6±6.7**△△
2.943
F值
10.16
8.94
P值
<0.01
<0.01
注：同表2
讨 论
一、小鼠CVB3m急性病毒性心肌炎中免疫状况的分析
本实验结果可能的原因：(1)病毒性心肌炎时，机体将抗原递呈给免疫系统，随着病毒侵入心脏，损害心肌细胞T淋巴细胞向心脏转移，从而外周血各亚群细胞减少[2]；极期心肌炎性部位以Lyt+2细胞浸润为主，也是外周Lyt+2细胞减少更为显著，L3T+4/Lyt+2升高的可能原因之一[3]。(2)CVB3m感染时免疫器官的受累部位主要为T细胞的分布区[4]，因此，机体T淋巴细胞普遍减少，外周血T淋巴细胞各亚群也相应减少。(3)白细胞介素2(IL-2)活性的下降及淋巴细胞膜白细胞介素2受体(IL-2R)表达的减低，可能是导致T淋巴细胞亚群普遍降低的重要因素之一。
, 百拇医药
在病毒感染的早期，NK细胞在杀伤受染细胞、清除病毒等方面起着重要作用。有研究发现，小鼠在感染急性期，外周血和脾脏中NK细胞明显增多，同时在受损心肌中也可见NK细胞浸润[2]。本研究中，未治组NK细胞活性感染后第1天增高，第3天达高峰后开始回落，第7天已降至正常。在感染急性期，NK细胞活性的短暂升高及在心肌组织中的出现，其作用主要是破坏、吞噬受染的心肌细胞，清除病毒，对机体起非特异性保护作用。
二、rIL-2免疫干预后小鼠免疫状况的变化
本实验小鼠的心肌病理改变显示，rIL-2治疗组心肌炎性细胞浸润及坏死均较同期未治组轻；14～21天，心肌纤维化也少于未治组。因此，可以得出结论：在BALB/c小鼠急性CVB3m心肌炎中，早期应用rIL-2可改善心肌受损情况，减少后遗症，有效降低病死率。其可能的机理是：(1)rIL-2加强NK细胞活性。实验中治疗组NK细胞活性升高早，高水平持续时间长，从而能迅速、有效地清除循环中及进入心肌的病毒。一方面可减少病毒对心肌细胞的直接损害；另一方面，病毒快速有效的被清除，可避免与病毒相关的抗原或被改变的自身抗原的持续暴露，并可避免由此而诱导出的针对这些抗原的体液免疫和细胞免疫的产生，从而避免了因此而造成的心肌损害的渐进性发展。(2)在病毒性心肌炎动物模型的心肌组织中，可分离出两类具有不同杀伤特性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)[5]，主要溶解未感染心肌细胞的自身反应性CTL(ACTL，表面抗原为L3T-4、Lyt+2的T杀伤细胞)和以杀伤感染心肌细胞为主的病毒特异性CTL(VCTL，表面抗原为L3T+4、Lyt-2)；VCTL的反应依赖rIL-2，而ACTL的产生与IL-2无关。实验结果显示，rIL-2治疗组脾脏L3T+4和Lyt+2细胞均较未治组升高，但L3T+4/Lyt+2下降，与正常组无明显差异。由此可以推论，rIL-2一方面可矫正机体细胞免疫的紊乱，减少病毒诱导的机体异常免疫反应，改善心肌受损情况；另一方面可诱导CTL前体成熟为VCTL，杀伤感染的心肌细胞，使病毒失去复制环境，从而终止病毒感染。(3)rIL-2还可诱生干扰素(IFN)，协同杀伤病毒。(4)心肌组织的再生能力弱，坏死病灶最终几乎为纤维化及瘢痕组织所取代。因此病毒性心肌炎的预后在很大程度上与急性期坏死病灶的广泛程度有关。rIL-2治疗组在病毒感染极期，小鼠心肌坏死灶及炎性细胞浸润均明显轻于未治组，后期心肌纤维化也少于未治组。可以认为，由于早期应用rIL-2可减轻心肌病理改变，因而可有效改善预后。
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总之，在病毒性心肌炎早期应用rIL-2可改善心肌病理改变，减少炎性细胞浸润，降低病死率，对心肌细胞有保护作用。
近年来，国外一些学者尝试运用rIL-2治疗某些病毒感染性疾病，并已成功地用于治疗慢性活动性EB病毒感染。本研究结果提出了rIL-2在心肌炎病毒流行时，心肌炎预防及早期治疗的可能性。但由于rIL-2有一定的副作用，大剂量应用可产生毛细血管渗漏综合征等[6]，而使其临床应用受到了一定的限制。但本研究中CVB3感染的rIL-2治疗组及12只给药的正常小鼠均无上述副作用。我们认为，只要给药的剂量及时机适当，可较好地避免rIL-2的副作用，有望更好地服务于临床。但在病毒性心肌炎中如何适时、适量地应用rIL-2，尚需进一步探讨。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39570744)
参考文献
, 百拇医药
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, 百拇医药
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(收稿：1998-05-25 修回：1998-12-08), http://www.100md.com