含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果
作者：苏瑞军 黄绍良 周敦华 李树浓 梁晓燕
单位：510120 广州，中山医科大学附属孙逸仙纪念医院[苏瑞军、黄绍良、周敦华(第一作者现在 510120，广州医学院第一附属医院工作)]；中山医科大学病理生理教研室(李树浓、梁晓燕)
关键词：骨髓细胞；造血细胞生长因子；造血干细胞
中华儿科杂志990712 【摘要】 目的 研究含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果。方法分别建立人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)和成人骨髓基质细胞层(ABMSCL)，观察他们单独及其与造血生长因子(HGFs)联合，在不同时间(第10、21、30、38天)对脐血CD+34细胞、CD+34CD-38细胞、粒单系祖细胞(CFU-GM)，多向祖细胞(CFU-GEMM)，早期红系祖细胞(BFU-E)的扩增作用。结果 (1)人胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)单独作用及其与HGFs[包括脐血浆、干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6、白细胞介素1β(IL-1β)，促红细胞生成素(EPO)、粒细胞刺激因子(G-CSF)]联合作用于CD+34细胞、集落形成细胞(CFCs)，其扩增效果均优于成人骨髓基质细胞(ABMSC)。(2)FBMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞的百分含量明显高于ABMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞百分含量。(3)FBMSC+HGFs扩增CD+34CD-38细胞达3倍，ABMSC+HGFs对CD+34CD-38细胞数量起维持作用，当扩增到第5～6周，CD+34CD-38细胞并没有被耗竭，仍分别占75%和25%。结论 含人胚胎骨髓基质细胞层体系是较理想的脐血造血干/祖细胞仿体内扩增体系之一。
, 百拇医药
The effect of human fetal bone marrow stromal cells on the expansion of hematopoietic stem cells/progenitor cells in umbilical cord blood SU Ruijun, HUANG Shaoliang, ZHOU Dunhua, et al. SUN Yet-sen Memorial Hospital, Zhongshan University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To study the expansion effect of human fetal bone marrow cells system on the hematopoietic stem cells in umbilical cord blood.Methods Fetal bone marrow stromal cell layers (FBMSCL) and adult bone marrow stromal cell layers (ABMSCL) were established and their single and combined effects with hematopoietic growth factors (HGFs) on expansion of colony forming cells (CFCs), CD+34 cells and CD+34CD-38 cells in umbilical cord blood were observed at different time (day 10,21,30,38).Results (1) The expansion effect of FBMSCL on the CD+34 Cells and CFCs was better than ABMSCL′s and was also better than ABMSC′s when they were combined with HGFs (including umbilical cord blood plasma, SCF, IL-3, IL-6, IL-1 β, EPO, G-CSF), respectively. (2) During the CFCs peak on day 30, the percentage of early and mid-term progenitors expanded by FBMSCL+HGFs was higher than that expanded by ABMSCL+HGFs. (3) The CD+34CD-38 cells were three folds expanded by FBMSCL+HGFs and were not changed significantly by ABMSCL+HGFs. When they were expanded on the fifth to sixth week, CD+34CD-38 cells were not wasted up. There were 75% and 25% CD+34CD-38 cells supported by FBMSCL+HGFs and ABMSCL+HGFs, respectively.Conclusion Human fetal bone marrow stromal cells system is one of the ideal expansion systems of hematopoietic stem/progenitor cells in umbilical cord blood.
, 百拇医药
【Key words】 Bone marrow cells Hematopoietic cell growth factors Hematopoietic stem cells
自1989年第一例脐血移植治疗Fanconi贫血患儿获得成功以来，至今已有500多例脐血移植治疗恶性肿瘤及恶性血液病，80%获得成功，所涉及的疾病有30余种。由于单份脐血采集量和(或)干/祖细胞数不足以应用于成人移植和基因治疗，脐血干/祖细胞的扩增研究日益受到重视。其中，寻找一种扩增效率高，且异基因免疫原表达弱的基质细胞具有重要的实用价值。最近作者等发现人胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)无血清培养上清对成人骨髓中集落形成细胞(CFCs)生长的刺激作用明显优于成人骨髓基质细胞(ABMSC)无血清培养上清的作用，胚胎细胞免疫原性弱。因此，我们拟利用 FBMSC建立一种仿体内扩增培养体系，对脐血CD+34细胞、CD+34CD-38细胞及粒单系祖细胞(CFU-GM)、多向祖细胞(CFU-GEMM)、早期红系祖细胞(BFU-E)等进行体外扩增，以探讨含人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)对脐血干/祖细胞的扩增效果。
, 百拇医药
材料及方法
一、实验材料
1.胚胎骨髓：胚胎骨髓取自本院妇产科。取水囊引产无病理情况的胚胎的股骨和胫骨。
2.成人骨髓：成人骨髓取自本院胸外科手术切除的肋骨(无血液病及其他原发病累及者的骨髓)。
3.脐血：脐血取自本院产房及中山医科大学附属第一医院产房。母亲及新生儿均无疾病的足月顺产儿的脐血。用装有ACD-A抗凝剂的采血袋收集。
胚胎、成人骨髓及脐血在采集12小时内均按本室方法制成单个核细胞(MNC)悬液备用[1]。
二、实验方法
1.胚胎/成人骨髓基质细胞层的培养：以成纤维细胞为主的混合基质细胞体外培养体系(4 ml)：伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)培养液(Sigma公司)中加入20%胎牛血清(FCS，GIBCO公司)(V/V)，氢化可的松(扬州制药厂)0.04 ml(终浓度10-6mol/L)，α-ME(德国Merk公司)(10-4mol/L) 20 μl，MNC浓度2×106/ml。将上述体系接种于25 ml容积培养瓶(Falcon)中，放置于37℃含5%CO2的培养箱内孵育，每周半量换液1次。贴壁细胞铺满90%～95%的培养瓶底面时，用0.05%胰酶(Gibco公司)1 ml加入培养瓶中，将贴壁细胞移种于24 孔板，留空4～6孔，24～48小时后，当成纤维细胞在24孔板重新铺满时，用10 Gy X线照射细胞，第2天即可接种脐血造血细胞(预实验中，给骨髓基质细胞以10 Gy X线照射，取出基质细胞做集落培养，未发现造血细胞集落生长)。
, http://www.100md.com
2.接种脐血造血细胞及建立仿体内扩增体系：将不同个体的2～3份脐血混合，制成MNC悬液后，在铺满基质细胞并经X线照射的孔板上划分4个实验组(各4孔)，每孔加入1×105/ml的脐血MNC。4个实验组的扩增体系如下：(1)胚胎骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)；⑵成人骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×105/ml 和以成纤维细胞为主混合基质细胞体外培养体系；(3)胚胎骨髓基质层+细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)；(4)成人骨髓基质层+细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×105/ml、FCS 10%、白细胞介素1β(IL-1β，美国Santa Cruz Biotech公司)40 ng/ml、IL-3 20 ng/ml、IL-6 50 ng/ml、干细胞因子(SCF)50 ng/ml、粒细胞刺激因子(G-CSF)100 ng/ml(日本Kirin公司)生产。促红细胞生成素(EPO，美国Amgem生产)2 U/ml、脐血浆20%，用IMDM补足至1 ml/孔。将上述各扩增体系置入37℃、5%CO2条件下培养，每2～3天给扩增体系半量换液。
, http://www.100md.com
3.CD+34细胞以及CD+34细胞亚群(CD+34CD-38)的分析：于扩增前(即0天)及扩增后第10、21、30、38天， 在4个扩增组中各取出1孔细胞，用流式细胞术(FACS)检测细胞表面抗原CD+34、CD+34CD-38的含量。收获有基质层的孔内细胞，先将非贴壁细胞吸出，用0.05%胰酶(GIBCO)0.25 ml将贴壁层消化，吹打为MNC悬液。再将此悬液置于25 cm2的培养瓶底面，使每5×106细胞悬浮于5 ml含20%小牛血清的IMDM培养液中，置于5%CO2，37℃，1小时后收获上层的非贴壁细胞，作为粘附于贴壁层的非贴壁细胞，与首次吸出的非贴壁细胞混合，即为收获的扩增后细胞。制成悬液，即可做抗原测定。根据标记的抗原数目不同分为：(1)单标记组：标记抗体为藻红蛋白荧光素(PE)结合的CD34抗体，对照为IgG1-PE。抗体以1∶10(10 μl/1×106)的MNC稀释，4℃孵育20～25分钟，用标准缓冲液(PBS)洗涤两次，重新悬浮；(2)双标记组：标记抗体为PE结合的CD34抗体和异硫氢基荧光素(FITC)标记的CD38抗体，对照为IgG1-PE和IgG1-FITC，以上述方法处理。以上抗体均为丹麦Dako公司生产。单标记组细胞根据PE荧光激发特性进行单标记参数分析，双标记组根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。所用流式细胞仪为FACScan，分析软件为Cell Quest Version 1.2，每个样品细胞数≥5×104的MNC。
, 百拇医药
4.造血祖细胞培养：将上述同样方法收获的不同时间的扩增后细胞制成单个核细胞悬液，按本室方法分别行CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E培养[1，2]。第7天计数CFU-GM，第14天计数CFU-GEMM、BFU-E。CFU-GM为40个以上细胞组成的细胞团，即为一个集落。BFU-E集落为棕红色(内含血红蛋白的红系细胞)。CFU-GEMM为集落内含红细胞、粒系、巨噬细胞成分。
5.统计学方法：本实验资料数据属非正态分布，以中位数(M)表示。两组间比较采用成组设计两样本比较的秩和检验，显著性检验采用双侧检验。
结 果
一、单纯人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)和单纯成人骨髓基质细胞层(ABMSCL)对脐血造血干/祖细胞的扩增效果(表1)
表1 加与不加HGFs条件下ABMSC和FBMSC对脐血CFCs和
, 百拇医药
CD+34细胞的中位扩增倍数(M) 扩增天数
CFU-GM
CFU-GEMM
BFU-E
CD+34细胞
ABMSC
FBMSC
ABMSC
FBMSC
ABMSC
FBMSC
, 百拇医药
ABMSC
FBMSC
不加HGFs
10
8.74
16.60
5.29
11.50
4.24
11.20*
0.33
1.16**
, 百拇医药
21
50.19
81.00*
9.90
42.50**
9.03
34.50*
0.55
2.05**
30
40.24
59.50*
, 百拇医药
8.34
37.00*
8.49
33.00*
1.42
3.25**
38
17.45
47.50*
1.25
5.60*
, 百拇医药 1.39
6.15*
0.07
1.50*
加HGFs
10
10.04
18.05**
5.94
13.00**
4.85
12.40**
, http://www.100md.com
1.41
5.05
21
57.94
99.00*
15.94
46.00**
15.18
37.95*
4.11
7.50
30
, 百拇医药
40.20
82.50*
9.45
44.00*
8.93
37.50*
5.03
21.00**
38
25.50
52.00*
, 百拇医药
1.54
6.70*
1.39
7.44*
2.57
4.20*
注：均为10例；秩和检验，*P<0.01；**P<0.05
FBMSC组和ABMSC组对脐血CD+34细胞和CFCs均有扩增作用。FBMSC组(n=10)和ABMSC组(n=10)对脐血CD+34细胞扩增高峰均于第4～5周(第30天)；对脐血CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E 的扩增高峰均在第3周(第21天)。FBMSC组对脐血CD+34细胞及CFCs的扩增作用明显优于ABMSC组。
, 百拇医药
二、FBMSCL联合HGFs体系和ABMSCL联合HGFs体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果(表1)
FBMSC+HGFs组(n=10)和ABMSC+HGFs组(n=10)对脐血CD+34细胞和CFCs均有扩增作用。FBMSC+HGFs组和ABMSC+HGFs 组对CD+34细胞的扩增高峰均在第4～5周(第30天)。FBMSC+HGFs组的扩增作用优于ABMSC+HGFs 组。FBMSC+HGFs组与ABMSC+HGFs组对CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E的扩增高峰均在第3周(第21天)，FBMSC+HGFs 组优于ABMSC+HGFs组。
三、含FBMSCL仿体内扩增体系对早中期脐血造血干/祖细胞的影响
在FBMSC+HGFs组(n=10)和ABMSC+HGFs组(n=10)对CD+34细胞的扩增高峰期(第30～38天)，对两组的早、中期造血祖细胞(CFU-GEMM+BFU-E)占全部集落形成细胞(CFCs)的百分数，即[(CFU-GEMM+BFU-E)/CFCs]×100%作成组设计两样本比较的秩和检验，结果显示：FBMSC+HGFs 组所扩增的早中期造血祖细胞百分含量高于 ABMSC +HGFs组(P均<0.05)。其中，第30天FBMSC+HGFs组和ABMSC+HGFs组所扩增的早中期造血祖细胞的中位百分含量，分别为49%和20%，第38天分别为35%和7%。
, http://www.100md.com
四、FBMSCL及含FBMSCL的仿体内扩增体系对脐血CD+34CD-38细胞亚群的扩增影响
单纯FBMSC(n=10)或ABMSC(n=10)对脐血CD+34CD-38细胞基本上无扩增作用。第4～5周(第30 天)前基本维持原来数量，第5～6周(第38天)数量明显减少，分别为20% 和17%。FBMSC+HGFs和ABMSC+HGFs对CD+34CD-38亚群细胞则有轻度扩增作用。FBMSC+HGFs在第3～5周内使CD+34CD-38细胞扩增3倍，至第5～6周(第 38 天)仍保持 75% ；ABMSC+HGFs在第4～5周(第30天)扩增CD+34CD-38细胞2倍，至第5～6周(第38天)仅剩25%。
, 百拇医药
讨 论
目前多数造血干/祖细胞的扩增体系主要是扩增中晚期造血干/祖细胞，早期造血祖细胞扩增不多，甚至出现“干细胞耗竭”的现象。因此，尽可能扩增早期祖细胞，同时又保持干细胞原有数量和活性，使之不被耗竭，是目前扩增研究的焦点。许多学者认为，含基质细胞和HGFs的扩增体系更接近人造血微环境，具有更高的扩增效率。但应用ABMSCL则存在异基因免疫原性强的污染，不利于移植。若利用FBMSCL则可避免这一缺陷。最近作者研究发现人胚胎骨髓基质细胞无血清培养上清对成人骨髓CFCs 有明显刺激作用，明显高于成人骨髓基质细胞无血清培养上清组[1]。本研究根据以上胚胎骨髓基质细胞生物学特性，首次探讨利用人胚胎骨髓基质细胞作为脐血干/祖细胞扩增体系的基质层的可行性。
一、FBMSC和ABMSC对脐血造血干/祖细胞的扩增作用
作者已有研究证明，FBMSC无血清培养上清对成人骨髓造血细胞的刺激作用明显优于ABMSC无血清培养上清。本研究结果显示，FBMSC组和ABMSC组对脐血CD+34细胞扩增高峰在第30天，高峰时FBMSC组扩增CD+34细胞3.25倍， ABMSC组为1.42倍。FBMSC组与ABMSC组对脐血CFU-GM，CFU-GEMM，BFU-E扩增高峰均在第21天，高峰时FBMSC组和ABMSC组对CFU-GM，扩增分别为81.00倍、50.19倍；CFU-GEMM 42.50倍、9.90倍；BFU-E为34.60倍、9.30倍。FBMSC组对脐血CD+34细胞及CFCs的扩增作用优于ABMSC组。这进一步从生物功能证实，胚胎骨髓基质细胞生物学特性不同于成人骨髓基质细胞，以支持胚胎期造血。梁辉等[3]比较人骨髓长期培养起始细胞(LTC-IC)在五种细胞株的基质细胞层上的培养，证实人胎肺成纤维细胞具有明显支持造血的能力。可见胚胎期的基质细胞较发育成熟阶段的基质细胞可能更有利于支持造血及仿体内扩增。其可能的机制如何呢?Harms等[4]研究发现，人胚胎间充质(12～14周)的基质细胞不但分泌的因子较成人骨髓基质细胞丰富，而且细胞表面粘附分子的受体密度高于成人骨髓基质细胞。也就是说，其发挥细胞间近距离作用以及细胞外基质的作用可能比成人骨髓基质细胞强。那么，胚胎骨髓基质细胞与成人骨髓基质细胞支持造血及仿体内扩增方面的机制是否存在上述类似的差异呢?尚有待于进一步的研究。
, 百拇医药
二、含人胚胎骨髓基质细胞层体系的扩增特征
本研究结果显示，FBMSC+HGFs组对脐血CD+34细胞、CUF-GM、CFU-GEMM及BFU-E的扩增作用均明显优于ABMSC+HGFs组。扩增高峰CFU-GM和BFU-E在第21天，CFU-GEMM和CD+34细胞在第30天。FBMSC+HGFs组扩增峰值分别为：CFU-GM为99.00倍，BFU-E为37.95倍，CFU-GEMM为46.00倍，CD+34细胞为21.00倍。而ABMSC+HGFs组相应的扩增峰值则为57.94倍、15.18倍、15.94倍和5.03倍。许多学者利用含基质细胞层+HGFs扩增体系的优点，再加以改进，以期得到更佳的扩增效果。如持续灌注系统，隔离培养体系等。Koller等[5]报道在含有成人骨髓基质层的体系中持续灌注IL-3、IL-6、SCF，扩增人骨髓单个核细胞，其扩增高峰在第7周，扩增CFU-GM 18倍，CFU-GEMM 5倍，LTC-IC 3倍。Van Zant等[6]报道在含上述基质层的体系中持续灌注IL-3、SCF、GM-CSF、EPO，扩增高峰在第14天，细胞总数、CFU-GM 、LTC-IC分别扩增50、80、20倍。本研究FBMSC+HGFs的扩增作用明显优于ABMSC+HGFs，其扩增高峰在第4～5周，较上述体系晚2周左右。这说明该扩增体系所扩增的祖细胞更原始，但也可能与脐血富含更原始造血细胞有关。
, 百拇医药
本研究结果还显示含FBMSC+HGFs的体系扩增的另一特点，在其扩增高峰(第4～5周)及高峰以后(第5～6周)所扩增的早中期祖细胞含量明显高于含ABMSC+HGFs体系所扩增的早中期祖细胞含量。而且含FBMSC+HGFs的扩增体系对脐血CD+34CD-38细胞具有一定的扩增作用，达2～3倍，其高峰在第3周(第21天)。到第5～6周(第38天)，这种接近原始干细胞群的细胞仍有75%，而含ABMSC+HGFs组仅有25%。Ruggieri等[7]报道的含脐血浆+白细胞介素3和粒单细胞集落刺激因子溶合蛋白(PIXY)+SCF液体培养体系扩增脐血CD+34细胞，从第1周末开始，早中期祖细胞含量逐周进行性下降。国内裴雪涛等[8]用SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+G-CSF+EPO等扩增脐血CD+34细胞，从第3周起，早中期祖细胞含量下降。Kobari等[9]建立含有鼠骨髓源基质细胞系MS-5+HGFs的扩增体系扩增人骨髓CD+34细胞，也是到第3周早中期祖细胞含量明显下降。Verfaillie等[10]报道，人骨髓CD+34细胞在含有人骨髓基质细胞的隔离培养体系中培养，第5周LTC-IC仍有50%，若加入MIP-1α和IL-3， LTC-IC可维持8周仍有100%。本研究采用含FBMSC+HGFs的扩增体系对扩增早中期祖细胞及维持一定量的CD+34CD-38细胞群明显优于ABMSC+HGFs组，这是其最大的特点。以上研究提示，若FBMSC联合更佳的HGFs 组合有可能建立一种理想的依赖基质细胞层的扩增培养体系，既高效扩增早期祖细胞又不耗竭或少耗竭具长期重建造血的干细胞群。
, http://www.100md.com
以上研究表明，含FBMSCL 的扩增体系对脐血干/祖细胞的扩增作用明显优于含ABMSCL的扩增体系，而人胚胎组织的抗原表达弱，因而FBMSCL 是较理想的仿体内扩增脐血干/祖细胞体系的基质层，在造血细胞仿体内扩增方面具有重要意义。
本课题由美国中国医学基金(CMB)资助(基金编号：96-630)
参考文献
1 孙新，黄绍良，刘俊范，等.胎儿骨髓基质细胞培养上清对造血祖细胞集落生长的影响.实验血液学杂志，1997，5:212-213.
2 黄绍良，李文益，侯玲玉，等.人胎盘血粒单系和红系祖细胞体外培养观察.中国实用儿科杂志，1994，9：225-226.
3 梁辉，应大明.长期培养启始细胞在不同的基质细胞上的培养.中华血液学杂志，1995，16：241-243.
, http://www.100md.com
4 Harms B, Burdach S, Goebel U, et al. Mixed haematopoietic colony formation via immature blast cell clusters on foetal mesenchymal cell layers distinguishes stem cells from peripheral blood, cord blood, bone marrow and blood stem cells mobilized by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Eur J Haematol, 1995,55:164-166.
5 Koller MR, Bender JG, Miller WM, et al. Expansion of primitive human hematopoietic progenitors in a perfusion bioreactor system with IL-6, IL-3 and SCF. Bio Technology,1993,11:358-361.
, 百拇医药
6 Van Zant G. Bummel SA, Koller ME, et al. Expansion in bioreactors of human progenitor populations from cord blood and mobilized peripheral blood. Blood Cells, 1994,20:492-499.
7 Ruggieri L, Heimfeld S, Broxmeyer HE, et al. Cytokine-dependent EX vivo expansion of early subsets of CD+34cord blood myeloid progeniton is enhanced by cord blood plasma, but expansion of the more mature subsets of progenitors is favored. Blood Cells, 1994, 20:436-441.
, http://www.100md.com
8 裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血干、祖细胞分离纯化与体外扩增.实验血液学杂志，1996, 4:6-9.
9 Kobari L, Dubart A, Le Pesteur F, et al. Hematopoietic-promoting activity of the murine stromal cell line MS-5 is not related to the expression of the major hematop-oietic cytokines. J Cell Physiol, 1995, 163:295-299.
10 Verfaillie CM, Miller JS. CD+34/CD-33cells reselected from macrophage inflammatory protein 1α+IL-3 supplemented “stroma-noncontact” cultures are highly enriched for long-term bone marrow culture initiating cells. Blood, 1994,84:1442-1449.
(收稿：1998-04-23 修回：1999-02-26), 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学附属孙逸仙纪念医院[苏瑞军、黄绍良、周敦华(第一作者现在 510120，广州医学院第一附属医院工作)]；中山医科大学病理生理教研室(李树浓、梁晓燕)
关键词：骨髓细胞；造血细胞生长因子；造血干细胞
中华儿科杂志990712 【摘要】 目的 研究含人胚胎骨髓基质细胞层体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果。方法分别建立人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)和成人骨髓基质细胞层(ABMSCL)，观察他们单独及其与造血生长因子(HGFs)联合，在不同时间(第10、21、30、38天)对脐血CD+34细胞、CD+34CD-38细胞、粒单系祖细胞(CFU-GM)，多向祖细胞(CFU-GEMM)，早期红系祖细胞(BFU-E)的扩增作用。结果 (1)人胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)单独作用及其与HGFs[包括脐血浆、干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6、白细胞介素1β(IL-1β)，促红细胞生成素(EPO)、粒细胞刺激因子(G-CSF)]联合作用于CD+34细胞、集落形成细胞(CFCs)，其扩增效果均优于成人骨髓基质细胞(ABMSC)。(2)FBMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞的百分含量明显高于ABMSC+HGFs在其扩增高峰(第30天)所扩增的早中期祖细胞百分含量。(3)FBMSC+HGFs扩增CD+34CD-38细胞达3倍，ABMSC+HGFs对CD+34CD-38细胞数量起维持作用，当扩增到第5～6周，CD+34CD-38细胞并没有被耗竭，仍分别占75%和25%。结论 含人胚胎骨髓基质细胞层体系是较理想的脐血造血干/祖细胞仿体内扩增体系之一。
, 百拇医药
The effect of human fetal bone marrow stromal cells on the expansion of hematopoietic stem cells/progenitor cells in umbilical cord blood SU Ruijun, HUANG Shaoliang, ZHOU Dunhua, et al. SUN Yet-sen Memorial Hospital, Zhongshan University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To study the expansion effect of human fetal bone marrow cells system on the hematopoietic stem cells in umbilical cord blood.Methods Fetal bone marrow stromal cell layers (FBMSCL) and adult bone marrow stromal cell layers (ABMSCL) were established and their single and combined effects with hematopoietic growth factors (HGFs) on expansion of colony forming cells (CFCs), CD+34 cells and CD+34CD-38 cells in umbilical cord blood were observed at different time (day 10,21,30,38).Results (1) The expansion effect of FBMSCL on the CD+34 Cells and CFCs was better than ABMSCL′s and was also better than ABMSC′s when they were combined with HGFs (including umbilical cord blood plasma, SCF, IL-3, IL-6, IL-1 β, EPO, G-CSF), respectively. (2) During the CFCs peak on day 30, the percentage of early and mid-term progenitors expanded by FBMSCL+HGFs was higher than that expanded by ABMSCL+HGFs. (3) The CD+34CD-38 cells were three folds expanded by FBMSCL+HGFs and were not changed significantly by ABMSCL+HGFs. When they were expanded on the fifth to sixth week, CD+34CD-38 cells were not wasted up. There were 75% and 25% CD+34CD-38 cells supported by FBMSCL+HGFs and ABMSCL+HGFs, respectively.Conclusion Human fetal bone marrow stromal cells system is one of the ideal expansion systems of hematopoietic stem/progenitor cells in umbilical cord blood.
, 百拇医药
【Key words】 Bone marrow cells Hematopoietic cell growth factors Hematopoietic stem cells
自1989年第一例脐血移植治疗Fanconi贫血患儿获得成功以来，至今已有500多例脐血移植治疗恶性肿瘤及恶性血液病，80%获得成功，所涉及的疾病有30余种。由于单份脐血采集量和(或)干/祖细胞数不足以应用于成人移植和基因治疗，脐血干/祖细胞的扩增研究日益受到重视。其中，寻找一种扩增效率高，且异基因免疫原表达弱的基质细胞具有重要的实用价值。最近作者等发现人胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)无血清培养上清对成人骨髓中集落形成细胞(CFCs)生长的刺激作用明显优于成人骨髓基质细胞(ABMSC)无血清培养上清的作用，胚胎细胞免疫原性弱。因此，我们拟利用 FBMSC建立一种仿体内扩增培养体系，对脐血CD+34细胞、CD+34CD-38细胞及粒单系祖细胞(CFU-GM)、多向祖细胞(CFU-GEMM)、早期红系祖细胞(BFU-E)等进行体外扩增，以探讨含人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)对脐血干/祖细胞的扩增效果。
, 百拇医药
材料及方法
一、实验材料
1.胚胎骨髓：胚胎骨髓取自本院妇产科。取水囊引产无病理情况的胚胎的股骨和胫骨。
2.成人骨髓：成人骨髓取自本院胸外科手术切除的肋骨(无血液病及其他原发病累及者的骨髓)。
3.脐血：脐血取自本院产房及中山医科大学附属第一医院产房。母亲及新生儿均无疾病的足月顺产儿的脐血。用装有ACD-A抗凝剂的采血袋收集。
胚胎、成人骨髓及脐血在采集12小时内均按本室方法制成单个核细胞(MNC)悬液备用[1]。
二、实验方法
1.胚胎/成人骨髓基质细胞层的培养：以成纤维细胞为主的混合基质细胞体外培养体系(4 ml)：伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)培养液(Sigma公司)中加入20%胎牛血清(FCS，GIBCO公司)(V/V)，氢化可的松(扬州制药厂)0.04 ml(终浓度10-6mol/L)，α-ME(德国Merk公司)(10-4mol/L) 20 μl，MNC浓度2×106/ml。将上述体系接种于25 ml容积培养瓶(Falcon)中，放置于37℃含5%CO2的培养箱内孵育，每周半量换液1次。贴壁细胞铺满90%～95%的培养瓶底面时，用0.05%胰酶(Gibco公司)1 ml加入培养瓶中，将贴壁细胞移种于24 孔板，留空4～6孔，24～48小时后，当成纤维细胞在24孔板重新铺满时，用10 Gy X线照射细胞，第2天即可接种脐血造血细胞(预实验中，给骨髓基质细胞以10 Gy X线照射，取出基质细胞做集落培养，未发现造血细胞集落生长)。
, http://www.100md.com
2.接种脐血造血细胞及建立仿体内扩增体系：将不同个体的2～3份脐血混合，制成MNC悬液后，在铺满基质细胞并经X线照射的孔板上划分4个实验组(各4孔)，每孔加入1×105/ml的脐血MNC。4个实验组的扩增体系如下：(1)胚胎骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)；⑵成人骨髓基质层扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×105/ml 和以成纤维细胞为主混合基质细胞体外培养体系；(3)胚胎骨髓基质层+细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)；(4)成人骨髓基质层+细胞因子扩增体系(1 ml/孔，n=10)。上述两组均含脐血MNC 1×105/ml、FCS 10%、白细胞介素1β(IL-1β，美国Santa Cruz Biotech公司)40 ng/ml、IL-3 20 ng/ml、IL-6 50 ng/ml、干细胞因子(SCF)50 ng/ml、粒细胞刺激因子(G-CSF)100 ng/ml(日本Kirin公司)生产。促红细胞生成素(EPO，美国Amgem生产)2 U/ml、脐血浆20%，用IMDM补足至1 ml/孔。将上述各扩增体系置入37℃、5%CO2条件下培养，每2～3天给扩增体系半量换液。
, http://www.100md.com
3.CD+34细胞以及CD+34细胞亚群(CD+34CD-38)的分析：于扩增前(即0天)及扩增后第10、21、30、38天， 在4个扩增组中各取出1孔细胞，用流式细胞术(FACS)检测细胞表面抗原CD+34、CD+34CD-38的含量。收获有基质层的孔内细胞，先将非贴壁细胞吸出，用0.05%胰酶(GIBCO)0.25 ml将贴壁层消化，吹打为MNC悬液。再将此悬液置于25 cm2的培养瓶底面，使每5×106细胞悬浮于5 ml含20%小牛血清的IMDM培养液中，置于5%CO2，37℃，1小时后收获上层的非贴壁细胞，作为粘附于贴壁层的非贴壁细胞，与首次吸出的非贴壁细胞混合，即为收获的扩增后细胞。制成悬液，即可做抗原测定。根据标记的抗原数目不同分为：(1)单标记组：标记抗体为藻红蛋白荧光素(PE)结合的CD34抗体，对照为IgG1-PE。抗体以1∶10(10 μl/1×106)的MNC稀释，4℃孵育20～25分钟，用标准缓冲液(PBS)洗涤两次，重新悬浮；(2)双标记组：标记抗体为PE结合的CD34抗体和异硫氢基荧光素(FITC)标记的CD38抗体，对照为IgG1-PE和IgG1-FITC，以上述方法处理。以上抗体均为丹麦Dako公司生产。单标记组细胞根据PE荧光激发特性进行单标记参数分析，双标记组根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。所用流式细胞仪为FACScan，分析软件为Cell Quest Version 1.2，每个样品细胞数≥5×104的MNC。
, 百拇医药
4.造血祖细胞培养：将上述同样方法收获的不同时间的扩增后细胞制成单个核细胞悬液，按本室方法分别行CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E培养[1，2]。第7天计数CFU-GM，第14天计数CFU-GEMM、BFU-E。CFU-GM为40个以上细胞组成的细胞团，即为一个集落。BFU-E集落为棕红色(内含血红蛋白的红系细胞)。CFU-GEMM为集落内含红细胞、粒系、巨噬细胞成分。
5.统计学方法：本实验资料数据属非正态分布，以中位数(M)表示。两组间比较采用成组设计两样本比较的秩和检验，显著性检验采用双侧检验。
结 果
一、单纯人胚胎骨髓基质细胞层(FBMSCL)和单纯成人骨髓基质细胞层(ABMSCL)对脐血造血干/祖细胞的扩增效果(表1)
表1 加与不加HGFs条件下ABMSC和FBMSC对脐血CFCs和
, 百拇医药
CD+34细胞的中位扩增倍数(M) 扩增天数
CFU-GM
CFU-GEMM
BFU-E
CD+34细胞
ABMSC
FBMSC
ABMSC
FBMSC
ABMSC
FBMSC
, 百拇医药
ABMSC
FBMSC
不加HGFs
10
8.74
16.60
5.29
11.50
4.24
11.20*
0.33
1.16**
, 百拇医药
21
50.19
81.00*
9.90
42.50**
9.03
34.50*
0.55
2.05**
30
40.24
59.50*
, 百拇医药
8.34
37.00*
8.49
33.00*
1.42
3.25**
38
17.45
47.50*
1.25
5.60*
, 百拇医药 1.39
6.15*
0.07
1.50*
加HGFs
10
10.04
18.05**
5.94
13.00**
4.85
12.40**
, http://www.100md.com
1.41
5.05
21
57.94
99.00*
15.94
46.00**
15.18
37.95*
4.11
7.50
30
, 百拇医药
40.20
82.50*
9.45
44.00*
8.93
37.50*
5.03
21.00**
38
25.50
52.00*
, 百拇医药
1.54
6.70*
1.39
7.44*
2.57
4.20*
注：均为10例；秩和检验，*P<0.01；**P<0.05
FBMSC组和ABMSC组对脐血CD+34细胞和CFCs均有扩增作用。FBMSC组(n=10)和ABMSC组(n=10)对脐血CD+34细胞扩增高峰均于第4～5周(第30天)；对脐血CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E 的扩增高峰均在第3周(第21天)。FBMSC组对脐血CD+34细胞及CFCs的扩增作用明显优于ABMSC组。
, 百拇医药
二、FBMSCL联合HGFs体系和ABMSCL联合HGFs体系对脐血造血干/祖细胞的扩增效果(表1)
FBMSC+HGFs组(n=10)和ABMSC+HGFs组(n=10)对脐血CD+34细胞和CFCs均有扩增作用。FBMSC+HGFs组和ABMSC+HGFs 组对CD+34细胞的扩增高峰均在第4～5周(第30天)。FBMSC+HGFs组的扩增作用优于ABMSC+HGFs 组。FBMSC+HGFs组与ABMSC+HGFs组对CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E的扩增高峰均在第3周(第21天)，FBMSC+HGFs 组优于ABMSC+HGFs组。
三、含FBMSCL仿体内扩增体系对早中期脐血造血干/祖细胞的影响
在FBMSC+HGFs组(n=10)和ABMSC+HGFs组(n=10)对CD+34细胞的扩增高峰期(第30～38天)，对两组的早、中期造血祖细胞(CFU-GEMM+BFU-E)占全部集落形成细胞(CFCs)的百分数，即[(CFU-GEMM+BFU-E)/CFCs]×100%作成组设计两样本比较的秩和检验，结果显示：FBMSC+HGFs 组所扩增的早中期造血祖细胞百分含量高于 ABMSC +HGFs组(P均<0.05)。其中，第30天FBMSC+HGFs组和ABMSC+HGFs组所扩增的早中期造血祖细胞的中位百分含量，分别为49%和20%，第38天分别为35%和7%。
, http://www.100md.com
四、FBMSCL及含FBMSCL的仿体内扩增体系对脐血CD+34CD-38细胞亚群的扩增影响
单纯FBMSC(n=10)或ABMSC(n=10)对脐血CD+34CD-38细胞基本上无扩增作用。第4～5周(第30 天)前基本维持原来数量，第5～6周(第38天)数量明显减少，分别为20% 和17%。FBMSC+HGFs和ABMSC+HGFs对CD+34CD-38亚群细胞则有轻度扩增作用。FBMSC+HGFs在第3～5周内使CD+34CD-38细胞扩增3倍，至第5～6周(第 38 天)仍保持 75% ；ABMSC+HGFs在第4～5周(第30天)扩增CD+34CD-38细胞2倍，至第5～6周(第38天)仅剩25%。
, 百拇医药
讨 论
目前多数造血干/祖细胞的扩增体系主要是扩增中晚期造血干/祖细胞，早期造血祖细胞扩增不多，甚至出现“干细胞耗竭”的现象。因此，尽可能扩增早期祖细胞，同时又保持干细胞原有数量和活性，使之不被耗竭，是目前扩增研究的焦点。许多学者认为，含基质细胞和HGFs的扩增体系更接近人造血微环境，具有更高的扩增效率。但应用ABMSCL则存在异基因免疫原性强的污染，不利于移植。若利用FBMSCL则可避免这一缺陷。最近作者研究发现人胚胎骨髓基质细胞无血清培养上清对成人骨髓CFCs 有明显刺激作用，明显高于成人骨髓基质细胞无血清培养上清组[1]。本研究根据以上胚胎骨髓基质细胞生物学特性，首次探讨利用人胚胎骨髓基质细胞作为脐血干/祖细胞扩增体系的基质层的可行性。
一、FBMSC和ABMSC对脐血造血干/祖细胞的扩增作用
作者已有研究证明，FBMSC无血清培养上清对成人骨髓造血细胞的刺激作用明显优于ABMSC无血清培养上清。本研究结果显示，FBMSC组和ABMSC组对脐血CD+34细胞扩增高峰在第30天，高峰时FBMSC组扩增CD+34细胞3.25倍， ABMSC组为1.42倍。FBMSC组与ABMSC组对脐血CFU-GM，CFU-GEMM，BFU-E扩增高峰均在第21天，高峰时FBMSC组和ABMSC组对CFU-GM，扩增分别为81.00倍、50.19倍；CFU-GEMM 42.50倍、9.90倍；BFU-E为34.60倍、9.30倍。FBMSC组对脐血CD+34细胞及CFCs的扩增作用优于ABMSC组。这进一步从生物功能证实，胚胎骨髓基质细胞生物学特性不同于成人骨髓基质细胞，以支持胚胎期造血。梁辉等[3]比较人骨髓长期培养起始细胞(LTC-IC)在五种细胞株的基质细胞层上的培养，证实人胎肺成纤维细胞具有明显支持造血的能力。可见胚胎期的基质细胞较发育成熟阶段的基质细胞可能更有利于支持造血及仿体内扩增。其可能的机制如何呢?Harms等[4]研究发现，人胚胎间充质(12～14周)的基质细胞不但分泌的因子较成人骨髓基质细胞丰富，而且细胞表面粘附分子的受体密度高于成人骨髓基质细胞。也就是说，其发挥细胞间近距离作用以及细胞外基质的作用可能比成人骨髓基质细胞强。那么，胚胎骨髓基质细胞与成人骨髓基质细胞支持造血及仿体内扩增方面的机制是否存在上述类似的差异呢?尚有待于进一步的研究。
, 百拇医药
二、含人胚胎骨髓基质细胞层体系的扩增特征
本研究结果显示，FBMSC+HGFs组对脐血CD+34细胞、CUF-GM、CFU-GEMM及BFU-E的扩增作用均明显优于ABMSC+HGFs组。扩增高峰CFU-GM和BFU-E在第21天，CFU-GEMM和CD+34细胞在第30天。FBMSC+HGFs组扩增峰值分别为：CFU-GM为99.00倍，BFU-E为37.95倍，CFU-GEMM为46.00倍，CD+34细胞为21.00倍。而ABMSC+HGFs组相应的扩增峰值则为57.94倍、15.18倍、15.94倍和5.03倍。许多学者利用含基质细胞层+HGFs扩增体系的优点，再加以改进，以期得到更佳的扩增效果。如持续灌注系统，隔离培养体系等。Koller等[5]报道在含有成人骨髓基质层的体系中持续灌注IL-3、IL-6、SCF，扩增人骨髓单个核细胞，其扩增高峰在第7周，扩增CFU-GM 18倍，CFU-GEMM 5倍，LTC-IC 3倍。Van Zant等[6]报道在含上述基质层的体系中持续灌注IL-3、SCF、GM-CSF、EPO，扩增高峰在第14天，细胞总数、CFU-GM 、LTC-IC分别扩增50、80、20倍。本研究FBMSC+HGFs的扩增作用明显优于ABMSC+HGFs，其扩增高峰在第4～5周，较上述体系晚2周左右。这说明该扩增体系所扩增的祖细胞更原始，但也可能与脐血富含更原始造血细胞有关。
, 百拇医药
本研究结果还显示含FBMSC+HGFs的体系扩增的另一特点，在其扩增高峰(第4～5周)及高峰以后(第5～6周)所扩增的早中期祖细胞含量明显高于含ABMSC+HGFs体系所扩增的早中期祖细胞含量。而且含FBMSC+HGFs的扩增体系对脐血CD+34CD-38细胞具有一定的扩增作用，达2～3倍，其高峰在第3周(第21天)。到第5～6周(第38天)，这种接近原始干细胞群的细胞仍有75%，而含ABMSC+HGFs组仅有25%。Ruggieri等[7]报道的含脐血浆+白细胞介素3和粒单细胞集落刺激因子溶合蛋白(PIXY)+SCF液体培养体系扩增脐血CD+34细胞，从第1周末开始，早中期祖细胞含量逐周进行性下降。国内裴雪涛等[8]用SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+G-CSF+EPO等扩增脐血CD+34细胞，从第3周起，早中期祖细胞含量下降。Kobari等[9]建立含有鼠骨髓源基质细胞系MS-5+HGFs的扩增体系扩增人骨髓CD+34细胞，也是到第3周早中期祖细胞含量明显下降。Verfaillie等[10]报道，人骨髓CD+34细胞在含有人骨髓基质细胞的隔离培养体系中培养，第5周LTC-IC仍有50%，若加入MIP-1α和IL-3， LTC-IC可维持8周仍有100%。本研究采用含FBMSC+HGFs的扩增体系对扩增早中期祖细胞及维持一定量的CD+34CD-38细胞群明显优于ABMSC+HGFs组，这是其最大的特点。以上研究提示，若FBMSC联合更佳的HGFs 组合有可能建立一种理想的依赖基质细胞层的扩增培养体系，既高效扩增早期祖细胞又不耗竭或少耗竭具长期重建造血的干细胞群。
, http://www.100md.com
以上研究表明，含FBMSCL 的扩增体系对脐血干/祖细胞的扩增作用明显优于含ABMSCL的扩增体系，而人胚胎组织的抗原表达弱，因而FBMSCL 是较理想的仿体内扩增脐血干/祖细胞体系的基质层，在造血细胞仿体内扩增方面具有重要意义。
本课题由美国中国医学基金(CMB)资助(基金编号：96-630)
参考文献
1 孙新，黄绍良，刘俊范，等.胎儿骨髓基质细胞培养上清对造血祖细胞集落生长的影响.实验血液学杂志，1997，5:212-213.
2 黄绍良，李文益，侯玲玉，等.人胎盘血粒单系和红系祖细胞体外培养观察.中国实用儿科杂志，1994，9：225-226.
3 梁辉，应大明.长期培养启始细胞在不同的基质细胞上的培养.中华血液学杂志，1995，16：241-243.
, http://www.100md.com
4 Harms B, Burdach S, Goebel U, et al. Mixed haematopoietic colony formation via immature blast cell clusters on foetal mesenchymal cell layers distinguishes stem cells from peripheral blood, cord blood, bone marrow and blood stem cells mobilized by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Eur J Haematol, 1995,55:164-166.
5 Koller MR, Bender JG, Miller WM, et al. Expansion of primitive human hematopoietic progenitors in a perfusion bioreactor system with IL-6, IL-3 and SCF. Bio Technology,1993,11:358-361.
, 百拇医药
6 Van Zant G. Bummel SA, Koller ME, et al. Expansion in bioreactors of human progenitor populations from cord blood and mobilized peripheral blood. Blood Cells, 1994,20:492-499.
7 Ruggieri L, Heimfeld S, Broxmeyer HE, et al. Cytokine-dependent EX vivo expansion of early subsets of CD+34cord blood myeloid progeniton is enhanced by cord blood plasma, but expansion of the more mature subsets of progenitors is favored. Blood Cells, 1994, 20:436-441.
, http://www.100md.com
8 裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血干、祖细胞分离纯化与体外扩增.实验血液学杂志，1996, 4:6-9.
9 Kobari L, Dubart A, Le Pesteur F, et al. Hematopoietic-promoting activity of the murine stromal cell line MS-5 is not related to the expression of the major hematop-oietic cytokines. J Cell Physiol, 1995, 163:295-299.
10 Verfaillie CM, Miller JS. CD+34/CD-33cells reselected from macrophage inflammatory protein 1α+IL-3 supplemented “stroma-noncontact” cultures are highly enriched for long-term bone marrow culture initiating cells. Blood, 1994,84:1442-1449.
(收稿：1998-04-23 修回：1999-02-26), 百拇医药