流式细胞仪检测肾病综合征患儿血小板活化程度
作者：白晓玲 孙晓明 姚慧 许波 满立新 段晓辉
单位：白晓玲、许波、满立新、段晓辉：250031 济南军区总医院儿科；孙晓明：流式细胞室；姚慧：济南千佛山医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990821 近年来，越来越多的研究表明，血小板在肾小球疾病的发生及发展中起重要作用。我们采用流式细胞术，以单克隆抗体为分子探针，检测了38例肾病综合征(NS)患儿血小板α-颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)的表达水平，以探讨NS 患儿血小板活化程度及其临床意义。
对象：原发性肾病综合征患儿共38例，其诊断均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组关于NS诊断标准的修订方案，其中男25例，女13例，年龄1.5岁～12岁，病程1周～6年。单纯性肾病(SNS)26例，肾炎性肾病(NNS)12例；肾组织活检8例，系膜增生性肾炎5例，IgM肾病2例；局灶性节段硬化1例。另设20例健康儿童为正常对照组，其中男12例，女8例，年龄2～12岁。
, 百拇医药
方法：取2% EDTA抗凝血2ml，800 r/min,5分钟， 取上层富含血小板血清,调整血小板2×106/ml，每管中分别加入CD62P-FITC,CD63-FITC,TSP-PE和阴性对照IgG1-FITC及IgG-PE(法国国际免疫公司提供)，避光反应30 min，PBS 洗涤两次，在流式细胞仪上(美国BD公司产)测试，用Cell Quest Plot软件(BD公司产)分析数据; 血清白蛋白、胆固醇、甘油三酯在自动生化仪上测试，24小时尿蛋白定量用磺柳酸、硫酸钠法测定；采用方差分析、q检验及直线相关分析进行统计学处理。
结果：(1) NS活动期血小板CD62P为(5.0±3.0)%，CD63为(4.2±2.1)%，TSP为(3.6±1.8)%，均明显高于缓解期的(1.9±1.1)%、(2.1±1.3)%、(2.2±1.1)%及对照组的(1.8±1.3)%、(2.1±1.3)%、(2.2±2.1)%，差异有显著意义(P均<0.01)。(2) NNS组与SNS组CD62P分别为(5.4±3.4)%及(4.8±2.9)%，CD63为(4.4±2.5)%及(4.0±1.8)%，差异无显著意义；NNS组TSP表达水平为(4.6±2.4)%，高于SNS组的(3.3±1.4)%(P<0.05)；以分型比较，SNS组TSP略高于对照组，但差异无显著意义。(3) 24小时尿蛋白与CD62P、CD63及TSP呈明显正相关(r=0.553、0.430、0.398,P均<0.01); 血清白蛋白与CD62P、CD63及TSP呈明显负相关(r=-0.414、-0.390、-0.362，P<0.01、<0.01、<0.05)。
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讨论：过去多通过测定血小板释放产物β-血栓球蛋白、血小板第4 因子的含量来判断体内血小板活化程度，其含量受机体代谢和排泄的影响，准确性较差。CD62P又称P-选择素、α-颗粒膜蛋白，为静止相血小板α-颗粒膜的组成部分；CD63又称作血小板53-KDa活化抗原，为溶酶体颗粒蛋白；凝血酶敏感蛋白(TSP)是一种钙敏感蛋白，位于血小板α-颗粒上。 当血小板被激活后相继发生细胞排粒作用，引起CD62P、CD63及TSP从胞浆颗粒转移到细胞表面，可作为血小板活化标志。采用McAb经流式细胞术检测表面有活化标志物的血小板数量，可灵敏、精确地反映血小板的活化程度和功能状态。血小板活化时，可能通过CD62P 调节血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞等多种白细胞的粘附；CD63则参与中性粒细胞与内皮细胞的粘附，在细胞粘附中起活化信号传递作用；而TSP是细胞与细胞、 细胞与间质之间粘附的配体之一，使白细胞移行到肾小球及肾间质内浸润，释放炎症介质、活性氧及蛋白酶等，导致肾组织病理损害，同时介导了肾小球内凝血、血栓形成，加剧和扩大了肾脏损害。
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三项指标中以CD62P 在正常对照组中表达水平最低，NS活动期表达最高。在难治性肾病中CD62P阳性表达率较高(11/12例)，这可能与CD62P较其他指标更敏感、更精确地反映不同活化程度的血小板，以及作为粘附分子与肾小球疾病发病关系更密切有关。近年来研究表明TSP在局灶硬化症、血管炎、膜型肾小球肾炎及糖尿病肾病肾组织中广泛表达，而在微小病变型肾组织中表达甚少，在正常肾组织中不表达，认为可作为肾小球疾病中炎症和早期纤维化的标志。我们发现TSP主要在NNS中表达水平高，这可能与NNS较SNS免疫性炎症损伤为重有关。
综上所述，血小板活化可能是NS发生、发展的一个重要环节，而由活化血小板表达并释放的CD62P、CD63及TSP与NS的发病过程密切相关，用流式细胞术检测血小板活化标志，有助于判断NS患儿血小板活化程度及高凝状态，并可能作为监测病情、估计预后的指标。
(收稿：1998-05-18 修回：1999-03-25), 百拇医药
单位：白晓玲、许波、满立新、段晓辉：250031 济南军区总医院儿科；孙晓明：流式细胞室；姚慧：济南千佛山医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990821 近年来，越来越多的研究表明，血小板在肾小球疾病的发生及发展中起重要作用。我们采用流式细胞术，以单克隆抗体为分子探针，检测了38例肾病综合征(NS)患儿血小板α-颗粒膜蛋白(CD62P)、溶酶体膜蛋白(CD63)及凝血酶敏感蛋白(TSP)的表达水平，以探讨NS 患儿血小板活化程度及其临床意义。
对象：原发性肾病综合征患儿共38例，其诊断均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组关于NS诊断标准的修订方案，其中男25例，女13例，年龄1.5岁～12岁，病程1周～6年。单纯性肾病(SNS)26例，肾炎性肾病(NNS)12例；肾组织活检8例，系膜增生性肾炎5例，IgM肾病2例；局灶性节段硬化1例。另设20例健康儿童为正常对照组，其中男12例，女8例，年龄2～12岁。
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方法：取2% EDTA抗凝血2ml，800 r/min,5分钟， 取上层富含血小板血清,调整血小板2×106/ml，每管中分别加入CD62P-FITC,CD63-FITC,TSP-PE和阴性对照IgG1-FITC及IgG-PE(法国国际免疫公司提供)，避光反应30 min，PBS 洗涤两次，在流式细胞仪上(美国BD公司产)测试，用Cell Quest Plot软件(BD公司产)分析数据; 血清白蛋白、胆固醇、甘油三酯在自动生化仪上测试，24小时尿蛋白定量用磺柳酸、硫酸钠法测定；采用方差分析、q检验及直线相关分析进行统计学处理。
结果：(1) NS活动期血小板CD62P为(5.0±3.0)%，CD63为(4.2±2.1)%，TSP为(3.6±1.8)%，均明显高于缓解期的(1.9±1.1)%、(2.1±1.3)%、(2.2±1.1)%及对照组的(1.8±1.3)%、(2.1±1.3)%、(2.2±2.1)%，差异有显著意义(P均<0.01)。(2) NNS组与SNS组CD62P分别为(5.4±3.4)%及(4.8±2.9)%，CD63为(4.4±2.5)%及(4.0±1.8)%，差异无显著意义；NNS组TSP表达水平为(4.6±2.4)%，高于SNS组的(3.3±1.4)%(P<0.05)；以分型比较，SNS组TSP略高于对照组，但差异无显著意义。(3) 24小时尿蛋白与CD62P、CD63及TSP呈明显正相关(r=0.553、0.430、0.398,P均<0.01); 血清白蛋白与CD62P、CD63及TSP呈明显负相关(r=-0.414、-0.390、-0.362，P<0.01、<0.01、<0.05)。
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讨论：过去多通过测定血小板释放产物β-血栓球蛋白、血小板第4 因子的含量来判断体内血小板活化程度，其含量受机体代谢和排泄的影响，准确性较差。CD62P又称P-选择素、α-颗粒膜蛋白，为静止相血小板α-颗粒膜的组成部分；CD63又称作血小板53-KDa活化抗原，为溶酶体颗粒蛋白；凝血酶敏感蛋白(TSP)是一种钙敏感蛋白，位于血小板α-颗粒上。 当血小板被激活后相继发生细胞排粒作用，引起CD62P、CD63及TSP从胞浆颗粒转移到细胞表面，可作为血小板活化标志。采用McAb经流式细胞术检测表面有活化标志物的血小板数量，可灵敏、精确地反映血小板的活化程度和功能状态。血小板活化时，可能通过CD62P 调节血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞等多种白细胞的粘附；CD63则参与中性粒细胞与内皮细胞的粘附，在细胞粘附中起活化信号传递作用；而TSP是细胞与细胞、 细胞与间质之间粘附的配体之一，使白细胞移行到肾小球及肾间质内浸润，释放炎症介质、活性氧及蛋白酶等，导致肾组织病理损害，同时介导了肾小球内凝血、血栓形成，加剧和扩大了肾脏损害。
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三项指标中以CD62P 在正常对照组中表达水平最低，NS活动期表达最高。在难治性肾病中CD62P阳性表达率较高(11/12例)，这可能与CD62P较其他指标更敏感、更精确地反映不同活化程度的血小板，以及作为粘附分子与肾小球疾病发病关系更密切有关。近年来研究表明TSP在局灶硬化症、血管炎、膜型肾小球肾炎及糖尿病肾病肾组织中广泛表达，而在微小病变型肾组织中表达甚少，在正常肾组织中不表达，认为可作为肾小球疾病中炎症和早期纤维化的标志。我们发现TSP主要在NNS中表达水平高，这可能与NNS较SNS免疫性炎症损伤为重有关。
综上所述，血小板活化可能是NS发生、发展的一个重要环节，而由活化血小板表达并释放的CD62P、CD63及TSP与NS的发病过程密切相关，用流式细胞术检测血小板活化标志，有助于判断NS患儿血小板活化程度及高凝状态，并可能作为监测病情、估计预后的指标。
(收稿：1998-05-18 修回：1999-03-25), 百拇医药