维生素D缺乏、钙缺乏对雏鸡长骨生长板软骨发育的影响
作者：王松艳 黎海芪 杨锡强 瞿平 李欣
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：鸡；钙；维生素D缺乏；脱噬作用；软骨细胞；骨发育
中华儿科杂志990810 摘要 目的 钙和维生素D(VitD)是影响骨发育的两个重要因素，通过建立雏鸡单纯钙缺乏、VitD缺乏的动物模型，比较两种情况下肥大软骨细胞凋亡的变化。方法 该研究在建立不同发育阶段单纯VitD、钙缺乏肉鸡雏鸡动物模型的基础上，采用Tunel原位末端标记检测技术、流式细胞术等方法，从形态、生化及组织学等多方面对VitD缺乏、钙缺乏所致骨生长发育障碍的机制进行了深入的研究。结果 正常软骨细胞凋亡发生在终末肥大软骨细胞处，肥大软骨细胞凋亡百分率约为34.7 %。雏鸡单纯钙缺乏对生长板软骨细胞的凋亡无明显影响，VitD缺乏时有生长板软骨细胞的凋亡的减少。结论 VitD缺乏、钙缺乏导致骨发育异常的机制可能不同。VitD缺乏导致的肥大软骨细胞凋亡减少可能是VitD缺乏时软骨细胞堆积和软骨层明显增厚的重要原因之一。
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Cartilage development disorder of bone growth plate in vitamin D deficient,calcium deficient chicken
WANG Songyan,LI Haiqi,YANG Xiqiang,et al.Affiliated Children′s Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400014
Abstract Objective To observe the chondrocyte development disorder caused by vitamin D (VitD) and calcium deficiency.Methods Chondrocyte apoptosis was documented by using the technique of in situ end-labeling,flow cytometric analysis and DNA fragmentation.Chondrocyte morphologic changes were observed by H-E staining.Results The results showed that 34.7 % of the normal hypertrophic chondrocytes were undergoing apoptosis,the percentage and the location of apoptosis between the calcium deficient group and the control group had no significant difference,but in VitD deficient group the percentage of hypertrophic chondrocytes apoptosis was significantly lower (19.77%).It was also found that there were chondrocytes architectural disarrangement in Vit D deficient group.Conclusion The study demonstrated that there are different mechanism of bone growth disorder between VitD and calcium deficient chicken.Significantly lower hypertrophic chondrocytes apoptosis may be the main reason of chondrocytes accumulation and cartilage thickning caused by VitD deficiency.
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Key words Chickens Calcium Vitamin D deficiency Apoptosis Chondrocytes
Bone development
长骨生长板终末肥大软骨细胞凋亡是近几年才得到证据证实其存在，且在长骨发育过程中具有重要意义的生理性过程。终末肥大软骨细胞的凋亡异常将引起骨生长板发育的异常，使骨生长障碍。维生素D(VitD)缺乏和钙缺乏均引起了骨生长的障碍，但两者表现不完全相同。本研究用本实验室已建立的雏鸡VitD缺乏、钙缺乏动物模型，研究单纯VitD缺乏、单纯钙缺乏时雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡的变化。
对象和方法
一、对象及分组
20只雄性肉鸡雏鸡(年龄1周，平均体重为54.3 g)随机分为四组：A组为正常组(饲料中钙含量为9.102 g/kg，VitD为 400 IU/kg)；B组为轻度钙缺乏组(饲料中钙含量6.147 g/kg,VitD 400 IU/kg)；C组为重度钙缺乏组(饲料中钙含量为3.192 g/kg,VitD 400 IU/kg)；D组为VitD缺乏组(饲料中钙含量为9.102 g/kg，不含VitD,且避光喂养)。每组各5只。用配制饲料喂养7周。实验末检测血钙、血离子钙、25(OH)D3、骨密度、血碱性磷酸酶证实动物模型的成功建立，然后处死动物，取骨作以下检测。
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二、实验方法
1.光镜下观察生长板软骨细胞层结构变化:取右侧胫骨近端干骺端，用10%福尔马林固定，经梯度酒精系列脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜观察组织学变化。
2.原位末端标记法观察生长板软骨细胞凋亡：雏鸡胫骨生长板软骨石蜡切片,用Tunel原位末端标记检测试剂盒,按其操作说明进行实验。Tunel 原位末端标记检测技术，利用TdT的修饰作用,将荧光素标记的寡核苷酸填补组织细胞DNA断口，再通过一系列免疫反应显示出来，能对组织中单个细胞的凋亡情况进行定位分析[1]。
3.流式细胞仪(FACS)检测软骨细胞凋亡：(1)软骨细胞单细胞悬液的制备：按Helmtrud提供方法略加修改[2]。(2)FACS：将已制备好的软骨细胞单细胞悬液1 ml(调细胞数为1×106/ml)，0.01 mol PBS洗2次，碘化乙锭(PI)+RNase孵育4℃，45分钟，300目网筛过滤，上流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司FACS Calibar)。用Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析细胞凋亡。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速定量检测的新技术，可反映不同周期中DNA含量所占比例，且在细胞凋亡，DNA发生片段化时，在正常细胞G1期前出现另一峰(AP峰)，这是凋亡细胞所特有的亚二倍体核型峰，此外，通过计算机分析，还可计算出凋亡细胞的百分率，它较凝胶电泳具有更高的灵敏性，目前它是分析细胞凋亡最常用的先进方法[3]。
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三、数据的统计学处理
采用华西医科大学的医学统计软件包计算机处理。实验数据先进行方差齐性分析，然后再进行各组间两两比较；q=0.05。
结果
一、钙缺乏、VitD缺乏时鸡长骨干骺端生长板软骨的形态学变化
光镜下可见，VitD缺乏雏鸡其长骨生长板软骨增殖层和肥大层增厚异常显著，且有软骨细胞的排列紊乱，形态异常，低钙B组、C组也可见增殖层和肥大层的增厚，C组较B组增厚明显，但两者轻于D组，未见软骨排列紊乱(图1～3)。
二、原位末端标记观察生长板软骨细胞凋亡
光镜下可见正常肥大软骨细胞凋亡出现在终末肥大软骨细胞的位置，即在软骨细胞与骨松质交界处，也可见血管周的软骨细胞凋亡。B、C组雏鸡长骨生长板的软骨细胞凋亡与A组相似。D组偶见血管周的肥大软骨细胞凋亡(图4～6)。
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三、流式细胞仪检测软骨细胞凋亡
各组流式细胞DNA直方图均出现双峰，第1峰为亚二倍体峰，即AP峰；第2峰为二倍体峰。A组、B、C组双峰形状相似，D组AP峰明显低于其他各组。根据Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析所得的凋亡细胞百分率显示A组为(34.7±8.45) %，D组(19.8±5.8)%,D与A组相比差异有显著性(P<0.05); B组为(30.1±7.2)%、C组为(33.5±7.4)与A组比较差异无显著性(图7)。
AP峰为凋亡细胞所特有的亚二倍体峰，图中A、B、C、D分别表示
A、B、C、D组的流式细胞DNA直方图，可见A组、B、C组双峰形状相似，而D组AP峰明显低于其他各组
图7 四组流式细胞DNA直方图
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讨论 一、正常雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞的凋亡
长骨生长主要通过长骨干骺端生长板软骨生长、基质形成和软骨钙化三者良好的平衡产生。对软骨发育中肥大软骨细胞的归宿一直存有两种观点。有些学者认为肥大软骨细胞是软骨细胞的终末细胞，最终退化死亡；另一些学者认为在软骨内成骨过程中肥大软骨细胞均分化为成骨细胞[4]。近年来越来越多的研究表明，肥大软骨细胞主要通过凋亡退化[5，6]。本研究用 DNA凝胶电泳证实了软骨细胞凋亡的存在，同时Tunel原位凋亡检测显示正常肥大软骨细胞的凋亡出现在终末肥大软骨细胞靠近软骨矿化和血管吸收的位置。这与近年来相关的文献报道一致。证明肥大软骨细胞凋亡确为软骨细胞的重要归宿。
在特定生长阶段，软骨细胞柱的长度和细胞数量被精确调控。软骨细胞增生的速度、程序性细胞死亡的速度、生长阻滞程度直接影响生长板软骨细胞数量。在生长过程中，增殖软骨细胞分化为肥大软骨细胞的速度在不同的年龄阶段因长骨的生长速度的不同而不同，软骨生长速度随之也不同。因此对不同生长阶段的长骨生长板软骨细胞，其增殖程度和程序性死亡的速度不同。Farnum等[7]用电镜观察到猪的生长板终末肥大软骨细胞有20%～30%显示凋亡早期的细胞形态。Gary等[5]对17～18天鸡胚胸骨的研究发现，15%以上包括初级骨化中心在内的软骨细胞和50%吸收血管系统接着面的软骨细胞表现浓缩的形态。而Masashi等[8]对8周白岩鸡胫骨生长板软骨细胞层的研究显示，凋亡细胞占整个软骨细胞层的8%～12%。本实验流式细胞结果分析表明，8周正常肉鸡雏鸡生长板终末软骨细胞凋亡占肥大软骨细胞的34.7%左右。
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二、单纯钙缺乏对雏鸡长骨生长板软骨细胞凋亡的影响
单纯钙缺乏引起了骨矿化障碍、骨质疏松。Kaastad等[9]发现低钙摄入主要引起鼠骨质疏松症，骨体积降低30%，骨钙含量下降，轻度软骨堆积，与本研究的结果一致。但单纯钙缺乏引起的轻度生长板软骨细胞堆积是由于单纯矿化不足所致，还是另有原因尚不清楚。本组研究单纯钙缺乏组(B、C组)尽管软骨细胞增殖层与肥大层都有增厚，但增厚轻，软骨细胞柱状排列规则，未见明显软骨细胞形态异常。本研究结果显示，单纯钙缺乏组与正常组雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡出现的部位和凋亡百分率一致，表明单纯钙缺乏对肥大软骨细胞凋亡无明显影响。推测此期生长板软骨的轻度肥厚是主要由于钙、磷细胞外液浓度降低而引起矿化不足。但是否涉及生长因子方面的调控紊乱有待进一步研究。
三、VitD缺乏对雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡的影响及其机制
尽管人们很早就已认识到VitD缺乏所致佝偻病有生长板发育障碍、软骨细胞的堆积，但均归结于骨矿化过程的障碍。但近几年的有关生长板软骨发育的研究发现，VitD对软骨细胞的增生分化具有直接和间接的调节作用[10，11]，肥大软骨细胞凋亡在软骨发育、骨矿化中占有非常重要的地位[6]，肥大软骨细胞凋亡是骨矿化的前提。但VitD缺乏与肥大软骨细胞凋亡的关系目前国内外尚未见报道。本研究发现VitD缺乏组软骨增厚明显。软骨细胞排列紊乱，柱状排列消失，细胞分布不均、形态改变，证实VitD缺乏引起了软骨发育的异常。VitD缺乏不但影响了钙化过程，也影响了软骨的增殖、分化。同时，VitD缺乏时出现了长骨生长板肥大软骨细胞的凋亡减少或障碍，流式细胞分析显示其凋亡细胞百分率明显低于正常组，与正常组相比差异有显著性。用原位凋亡检测、DNA电泳均得到证实，表明肥大软骨细胞凋亡减少是VitD缺乏引起骨发育障碍的重要原因之一。因此VitD缺乏佝偻病时的软骨堆积，骨矿化障碍并不是简单的矿化不足，而可能是VitD缺乏时骨发育过程的多方面调节障碍而导致的发育异常。
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细胞进行凋亡是因为它接受了来自其环境中的信息并将其翻译为内部信号的结果。细胞表面受体介导的凋亡调控机制通常是通过信号转导系统起作用。细胞在受体接受刺激后，活化蛋白激酶/腺苷环化酶系统，再促使第二信号的释放，以促进或抑制特异性基因的转录[12]。VitD缺乏导致肥大软骨细胞凋亡减少可能通过了细胞表面VitD受体(VDR)，使细胞活化促进或抑制特异性基因的转录、表达。
现已证实VDR存在于多种组织细胞，如骨骺生长板软骨细胞，乳腺癌细胞，成神经细胞瘤细胞等。VitD活性代谢产物1，25-(OH)2D3通过VDR在各种细胞型中调节细胞的增殖和分化[13]。在培养软骨细胞中，VitD刺激软骨细胞分化和成熟，高剂量1,25-(OH)2D3有一个抗生长板软骨细胞增生的作用，而低剂量1,25(OH)2D3则刺激软骨细胞增生[10]。在Elena等[14]和Maura等[15]的研究中发现，1，25 (OH)2D3抑制乳腺癌细胞的增殖，促使其分化。同时1，25(OH)2D3通过阻滞细胞于G0/G1期，下调乳腺癌细胞Bcl-2的表达，增强蛋白激酶C(PKC)活性，通过受体介导途径促进Ca2+内流等诱导细胞凋亡。此外，Yuzo等[16]研究1，25(OH)2D3对鼠乳腺细胞的作用发现，1，25(OH)2D3能诱导其核酸内切酶活化，其机理是因为显著提高了细胞内钙离子浓度。因此VitD在某些细胞型的增殖、分化和凋亡中具有重要作用。
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图1 A组雏鸡生长板软骨细胞层结构,可见排列规则的软骨细胞,HE×100;
图2 B组长骨生长板软骨细胞层结构,增殖层增厚,无排列紊乱,HE×100
图3 D组长骨生长板软骨细胞层(部分)结板,不明显结构排列紊乱的增殖层,HE×100
图4 A组终末肥大软骨细胞处凋亡,原位末端标记法染色,苏木素复染×100
图5 小血管周围的阳性凋亡细胞,原位末端标记法,苏木素复染,×100
图6 D组血管入侵处无明显阳性凋亡细胞,原位末端标记法,苏木素复染×100
参考文献
1 Wijsman JH,Jonker RR,Keijzer R,et al.A new mothod to detect apoptosis in paraffin section: in situ end-lebeling of fragmented of fragmented DNA.J Histochem，1993，41:7 .
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2 Helmtrud IR,Jekaterina E,Thomas A.Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis.J Cell Biol， 1995，131:483-494.
3 Huschtscha LI,Jeitner TM,Andersson WA,et al.Identification of apoptosis and necrotic human leukemic cells by flow cytometry.Exp Cell Res，1994，212:161.
4 Moskalewski S,Malejczyk J.Bone formation following intrarenal transplantation of isolated murine chondrocytes: chondrocytes-bone cell transdifferentiation.Development， 1989， 107: 473-480.
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5 Gary JG,William JK,Mitchekk BS.Chondrocyte apoptosis in endochondral ossification of chick sterna.Dev Dynamics， 1995，203:468-476.
6 Roach HI.New aspects of endochondral ossification in the chick: chondrocyte apoptosis,bone formation by former chondrocytes,and acid phosphatase activity in the endochondral bone matrix.J Bone Miner Res， 1997， 12:795-805.
7 Farnum CE,Wilsman NJ.Cellular turnover at the chondro-osseousjunction of growth plate cartilage: analysis by serial sections at the light microscopical level.J Orthopaced Res， 1989，7:654-666.
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8 Masashi H,Kevin JK,Cristina CT.End labeling studies of fragmented DNA in the avian growth plate: evidence of apoptosis in terminally differentiated chondrocytes.J Bone Mineral Res， 1995，10:1960-1968.
9 Kaastad TS,Reiker O,Madsen JE,et al.Effects of clodronate on cortical and trabecular bone in ovariectomized rats on a low calcium diet.Calcif Tissue Int， 1997，61:158-164.
10 Gerstenfeld LC,Kelly CM,Dek M,et al.Effect of 1,25-dihy- droxyvitamin D3 on induction of chondrocyte maturation in culture: extracellular matrix gene expression and morphology.Endocrinology，1990,126,1599-1609.
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11 Schwarz Z,Brooks B,Swain L,et al.Production of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and 24,25-dihydroxyvitamin D3 by growth zone and resting zone chondrocytes is dependent on cell maturation and is regulated by hormones and growth factors.Endocrinology，1992,130:2495-2504.
12 Annette JH,Christopher A,Smith LC,et al.Apoptosis: molecular regulation of cell death.Eur J Biochem，1996，236:1-26.
13 Timothy DV,Anthorry JW,Rajiv K.1,25-dihydroxyvitamin D3 regulates the expression of N-myc,c-myc,proteinkinase C,and transforming growth factor-β2 in neuroblastoma cells.Biochem Biophys Res Commun,1997，235:15-18.
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14 Elena E,Marjane linker-zsraeli,Johnathan S,et al.20- epi- vitamin D3 analogues: a novel class of potent inhibitors of proliferation and inducers of differentiation of human breast cancer cell lines.Cancer Research 1995,55:2822-2830.
15 Maura SC,Carmen JN,Kathryn VW,et al.Comparative effects of 1,25(OH)2D3 and EB 1089 on cell cycle kinetics and apoptosis in MCF-7 breast cancer cell.Breast Cancer Research Teeatment，1998，42:31-41.
16 Yuzo F,Sho O,Jun S.Induction of apoptosis in androgen-independent mouse mammary cell line by 1,25-dihydroxyvitaminD3.Int J Cancer，1996，68:143-148.
(收稿：1998-07-10 修回：1998-12-28), http://www.100md.com
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院
关键词：鸡；钙；维生素D缺乏；脱噬作用；软骨细胞；骨发育
中华儿科杂志990810 摘要 目的 钙和维生素D(VitD)是影响骨发育的两个重要因素，通过建立雏鸡单纯钙缺乏、VitD缺乏的动物模型，比较两种情况下肥大软骨细胞凋亡的变化。方法 该研究在建立不同发育阶段单纯VitD、钙缺乏肉鸡雏鸡动物模型的基础上，采用Tunel原位末端标记检测技术、流式细胞术等方法，从形态、生化及组织学等多方面对VitD缺乏、钙缺乏所致骨生长发育障碍的机制进行了深入的研究。结果 正常软骨细胞凋亡发生在终末肥大软骨细胞处，肥大软骨细胞凋亡百分率约为34.7 %。雏鸡单纯钙缺乏对生长板软骨细胞的凋亡无明显影响，VitD缺乏时有生长板软骨细胞的凋亡的减少。结论 VitD缺乏、钙缺乏导致骨发育异常的机制可能不同。VitD缺乏导致的肥大软骨细胞凋亡减少可能是VitD缺乏时软骨细胞堆积和软骨层明显增厚的重要原因之一。
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Cartilage development disorder of bone growth plate in vitamin D deficient,calcium deficient chicken
WANG Songyan,LI Haiqi,YANG Xiqiang,et al.Affiliated Children′s Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400014
Abstract Objective To observe the chondrocyte development disorder caused by vitamin D (VitD) and calcium deficiency.Methods Chondrocyte apoptosis was documented by using the technique of in situ end-labeling,flow cytometric analysis and DNA fragmentation.Chondrocyte morphologic changes were observed by H-E staining.Results The results showed that 34.7 % of the normal hypertrophic chondrocytes were undergoing apoptosis,the percentage and the location of apoptosis between the calcium deficient group and the control group had no significant difference,but in VitD deficient group the percentage of hypertrophic chondrocytes apoptosis was significantly lower (19.77%).It was also found that there were chondrocytes architectural disarrangement in Vit D deficient group.Conclusion The study demonstrated that there are different mechanism of bone growth disorder between VitD and calcium deficient chicken.Significantly lower hypertrophic chondrocytes apoptosis may be the main reason of chondrocytes accumulation and cartilage thickning caused by VitD deficiency.
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Key words Chickens Calcium Vitamin D deficiency Apoptosis Chondrocytes
Bone development
长骨生长板终末肥大软骨细胞凋亡是近几年才得到证据证实其存在，且在长骨发育过程中具有重要意义的生理性过程。终末肥大软骨细胞的凋亡异常将引起骨生长板发育的异常，使骨生长障碍。维生素D(VitD)缺乏和钙缺乏均引起了骨生长的障碍，但两者表现不完全相同。本研究用本实验室已建立的雏鸡VitD缺乏、钙缺乏动物模型，研究单纯VitD缺乏、单纯钙缺乏时雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡的变化。
对象和方法
一、对象及分组
20只雄性肉鸡雏鸡(年龄1周，平均体重为54.3 g)随机分为四组：A组为正常组(饲料中钙含量为9.102 g/kg，VitD为 400 IU/kg)；B组为轻度钙缺乏组(饲料中钙含量6.147 g/kg,VitD 400 IU/kg)；C组为重度钙缺乏组(饲料中钙含量为3.192 g/kg,VitD 400 IU/kg)；D组为VitD缺乏组(饲料中钙含量为9.102 g/kg，不含VitD,且避光喂养)。每组各5只。用配制饲料喂养7周。实验末检测血钙、血离子钙、25(OH)D3、骨密度、血碱性磷酸酶证实动物模型的成功建立，然后处死动物，取骨作以下检测。
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二、实验方法
1.光镜下观察生长板软骨细胞层结构变化:取右侧胫骨近端干骺端，用10%福尔马林固定，经梯度酒精系列脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜观察组织学变化。
2.原位末端标记法观察生长板软骨细胞凋亡：雏鸡胫骨生长板软骨石蜡切片,用Tunel原位末端标记检测试剂盒,按其操作说明进行实验。Tunel 原位末端标记检测技术，利用TdT的修饰作用,将荧光素标记的寡核苷酸填补组织细胞DNA断口，再通过一系列免疫反应显示出来，能对组织中单个细胞的凋亡情况进行定位分析[1]。
3.流式细胞仪(FACS)检测软骨细胞凋亡：(1)软骨细胞单细胞悬液的制备：按Helmtrud提供方法略加修改[2]。(2)FACS：将已制备好的软骨细胞单细胞悬液1 ml(调细胞数为1×106/ml)，0.01 mol PBS洗2次，碘化乙锭(PI)+RNase孵育4℃，45分钟，300目网筛过滤，上流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司FACS Calibar)。用Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析细胞凋亡。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速定量检测的新技术，可反映不同周期中DNA含量所占比例，且在细胞凋亡，DNA发生片段化时，在正常细胞G1期前出现另一峰(AP峰)，这是凋亡细胞所特有的亚二倍体核型峰，此外，通过计算机分析，还可计算出凋亡细胞的百分率，它较凝胶电泳具有更高的灵敏性，目前它是分析细胞凋亡最常用的先进方法[3]。
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三、数据的统计学处理
采用华西医科大学的医学统计软件包计算机处理。实验数据先进行方差齐性分析，然后再进行各组间两两比较；q=0.05。
结果
一、钙缺乏、VitD缺乏时鸡长骨干骺端生长板软骨的形态学变化
光镜下可见，VitD缺乏雏鸡其长骨生长板软骨增殖层和肥大层增厚异常显著，且有软骨细胞的排列紊乱，形态异常，低钙B组、C组也可见增殖层和肥大层的增厚，C组较B组增厚明显，但两者轻于D组，未见软骨排列紊乱(图1～3)。
二、原位末端标记观察生长板软骨细胞凋亡
光镜下可见正常肥大软骨细胞凋亡出现在终末肥大软骨细胞的位置，即在软骨细胞与骨松质交界处，也可见血管周的软骨细胞凋亡。B、C组雏鸡长骨生长板的软骨细胞凋亡与A组相似。D组偶见血管周的肥大软骨细胞凋亡(图4～6)。
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三、流式细胞仪检测软骨细胞凋亡
各组流式细胞DNA直方图均出现双峰，第1峰为亚二倍体峰，即AP峰；第2峰为二倍体峰。A组、B、C组双峰形状相似，D组AP峰明显低于其他各组。根据Mod Fit LI-2.0 DNA周期分析软件分析所得的凋亡细胞百分率显示A组为(34.7±8.45) %，D组(19.8±5.8)%,D与A组相比差异有显著性(P<0.05); B组为(30.1±7.2)%、C组为(33.5±7.4)与A组比较差异无显著性(图7)。
AP峰为凋亡细胞所特有的亚二倍体峰，图中A、B、C、D分别表示
A、B、C、D组的流式细胞DNA直方图，可见A组、B、C组双峰形状相似，而D组AP峰明显低于其他各组
图7 四组流式细胞DNA直方图
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讨论 一、正常雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞的凋亡
长骨生长主要通过长骨干骺端生长板软骨生长、基质形成和软骨钙化三者良好的平衡产生。对软骨发育中肥大软骨细胞的归宿一直存有两种观点。有些学者认为肥大软骨细胞是软骨细胞的终末细胞，最终退化死亡；另一些学者认为在软骨内成骨过程中肥大软骨细胞均分化为成骨细胞[4]。近年来越来越多的研究表明，肥大软骨细胞主要通过凋亡退化[5，6]。本研究用 DNA凝胶电泳证实了软骨细胞凋亡的存在，同时Tunel原位凋亡检测显示正常肥大软骨细胞的凋亡出现在终末肥大软骨细胞靠近软骨矿化和血管吸收的位置。这与近年来相关的文献报道一致。证明肥大软骨细胞凋亡确为软骨细胞的重要归宿。
在特定生长阶段，软骨细胞柱的长度和细胞数量被精确调控。软骨细胞增生的速度、程序性细胞死亡的速度、生长阻滞程度直接影响生长板软骨细胞数量。在生长过程中，增殖软骨细胞分化为肥大软骨细胞的速度在不同的年龄阶段因长骨的生长速度的不同而不同，软骨生长速度随之也不同。因此对不同生长阶段的长骨生长板软骨细胞，其增殖程度和程序性死亡的速度不同。Farnum等[7]用电镜观察到猪的生长板终末肥大软骨细胞有20%～30%显示凋亡早期的细胞形态。Gary等[5]对17～18天鸡胚胸骨的研究发现，15%以上包括初级骨化中心在内的软骨细胞和50%吸收血管系统接着面的软骨细胞表现浓缩的形态。而Masashi等[8]对8周白岩鸡胫骨生长板软骨细胞层的研究显示，凋亡细胞占整个软骨细胞层的8%～12%。本实验流式细胞结果分析表明，8周正常肉鸡雏鸡生长板终末软骨细胞凋亡占肥大软骨细胞的34.7%左右。
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二、单纯钙缺乏对雏鸡长骨生长板软骨细胞凋亡的影响
单纯钙缺乏引起了骨矿化障碍、骨质疏松。Kaastad等[9]发现低钙摄入主要引起鼠骨质疏松症，骨体积降低30%，骨钙含量下降，轻度软骨堆积，与本研究的结果一致。但单纯钙缺乏引起的轻度生长板软骨细胞堆积是由于单纯矿化不足所致，还是另有原因尚不清楚。本组研究单纯钙缺乏组(B、C组)尽管软骨细胞增殖层与肥大层都有增厚，但增厚轻，软骨细胞柱状排列规则，未见明显软骨细胞形态异常。本研究结果显示，单纯钙缺乏组与正常组雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡出现的部位和凋亡百分率一致，表明单纯钙缺乏对肥大软骨细胞凋亡无明显影响。推测此期生长板软骨的轻度肥厚是主要由于钙、磷细胞外液浓度降低而引起矿化不足。但是否涉及生长因子方面的调控紊乱有待进一步研究。
三、VitD缺乏对雏鸡长骨生长板肥大软骨细胞凋亡的影响及其机制
尽管人们很早就已认识到VitD缺乏所致佝偻病有生长板发育障碍、软骨细胞的堆积，但均归结于骨矿化过程的障碍。但近几年的有关生长板软骨发育的研究发现，VitD对软骨细胞的增生分化具有直接和间接的调节作用[10，11]，肥大软骨细胞凋亡在软骨发育、骨矿化中占有非常重要的地位[6]，肥大软骨细胞凋亡是骨矿化的前提。但VitD缺乏与肥大软骨细胞凋亡的关系目前国内外尚未见报道。本研究发现VitD缺乏组软骨增厚明显。软骨细胞排列紊乱，柱状排列消失，细胞分布不均、形态改变，证实VitD缺乏引起了软骨发育的异常。VitD缺乏不但影响了钙化过程，也影响了软骨的增殖、分化。同时，VitD缺乏时出现了长骨生长板肥大软骨细胞的凋亡减少或障碍，流式细胞分析显示其凋亡细胞百分率明显低于正常组，与正常组相比差异有显著性。用原位凋亡检测、DNA电泳均得到证实，表明肥大软骨细胞凋亡减少是VitD缺乏引起骨发育障碍的重要原因之一。因此VitD缺乏佝偻病时的软骨堆积，骨矿化障碍并不是简单的矿化不足，而可能是VitD缺乏时骨发育过程的多方面调节障碍而导致的发育异常。
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细胞进行凋亡是因为它接受了来自其环境中的信息并将其翻译为内部信号的结果。细胞表面受体介导的凋亡调控机制通常是通过信号转导系统起作用。细胞在受体接受刺激后，活化蛋白激酶/腺苷环化酶系统，再促使第二信号的释放，以促进或抑制特异性基因的转录[12]。VitD缺乏导致肥大软骨细胞凋亡减少可能通过了细胞表面VitD受体(VDR)，使细胞活化促进或抑制特异性基因的转录、表达。
现已证实VDR存在于多种组织细胞，如骨骺生长板软骨细胞，乳腺癌细胞，成神经细胞瘤细胞等。VitD活性代谢产物1，25-(OH)2D3通过VDR在各种细胞型中调节细胞的增殖和分化[13]。在培养软骨细胞中，VitD刺激软骨细胞分化和成熟，高剂量1,25-(OH)2D3有一个抗生长板软骨细胞增生的作用，而低剂量1,25(OH)2D3则刺激软骨细胞增生[10]。在Elena等[14]和Maura等[15]的研究中发现，1，25 (OH)2D3抑制乳腺癌细胞的增殖，促使其分化。同时1，25(OH)2D3通过阻滞细胞于G0/G1期，下调乳腺癌细胞Bcl-2的表达，增强蛋白激酶C(PKC)活性，通过受体介导途径促进Ca2+内流等诱导细胞凋亡。此外，Yuzo等[16]研究1，25(OH)2D3对鼠乳腺细胞的作用发现，1，25(OH)2D3能诱导其核酸内切酶活化，其机理是因为显著提高了细胞内钙离子浓度。因此VitD在某些细胞型的增殖、分化和凋亡中具有重要作用。
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图1 A组雏鸡生长板软骨细胞层结构,可见排列规则的软骨细胞,HE×100;
图2 B组长骨生长板软骨细胞层结构,增殖层增厚,无排列紊乱,HE×100
图3 D组长骨生长板软骨细胞层(部分)结板,不明显结构排列紊乱的增殖层,HE×100
图4 A组终末肥大软骨细胞处凋亡,原位末端标记法染色,苏木素复染×100
图5 小血管周围的阳性凋亡细胞,原位末端标记法,苏木素复染,×100
图6 D组血管入侵处无明显阳性凋亡细胞,原位末端标记法,苏木素复染×100
参考文献
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(收稿：1998-07-10 修回：1998-12-28), http://www.100md.com