荧光原位杂交检测Williams综合征及主动脉瓣上狭窄患儿的弹性蛋白基因缺失
作者：梁瑛 周爱卿 王世雄 胡琴
单位：200092 上海市儿科医学研究所
关键词：原位杂交；荧光；基因缺失；主动脉瓣狭窄；威廉斯综合征
中华儿科杂志990909 【摘要】 目的 试图了解主动脉瓣上狭窄(SVAS)和Williams综合征(WS)患儿弹性蛋白基因(ELN)缺失的不同程度，从分子水平为鉴别诊断提供有力的实验室依据。方法 采用含ELN位点的地高辛标记的单一序列探针WSCR探针,对8例以SVAS收治入院的患儿染色体标本进行荧光原位杂交(FISH)，同时根据Lowery的WS表现型评分表进行症状评估。结果 8例患儿中5例为WS，1例为单纯性SVAS，另2例尚属可疑。结论 WS中ELN位点的缺失为半合子状态，FISH是一种协助临床鉴别中国人WS和SVAS的有效方法。
Elastin gene deletions detected by FISH in children with Williams syndrome and supravalvular aortic stenosis
, 百拇医药
LIANG Ying, ZHOU Aiqing,WANG Shixiong, et al.
Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To investigate the different degrees of elastin gene deletions in Chinese children with Williams syndrome (WS)and supravalvular aortic stenosis (SVAS), and provide an effective molecular laboratory test for the differentiation diagnosis. Methods Eight children with SVAS diagnosed by echocardiography and catheterization were examined by fluorescent in situ hybridization (FISH)with WSCR probe which included elastin gene locus. The clinical features of the patients were assessed according to Lowery′s phenotype scoring system of WS. Results Out of the 8 patients, 5 were diagnosed as WS, one as simple SVAS by FISH. Two patients remained undecided. Conclusion Hemizygosity of the elastin gene deletions was identified in patients with WS. FISH might be an useful genetic test for diagnosis of Chinese children with WS and SVAS.
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【Key words】 In situ hybridization, fluorescence Gene deletion Aortic valve stenosis Williams syndrome
主动脉瓣上狭窄(SVAS)是一种先天性心脏病，若同时合并多器官功能紊乱则称为SVAS综合征，即Williams综合征(WS)。临床表现包括特殊面容、智力障碍等。近年来的研究表明，弹性蛋白基因(ELN)的异常改变与这两种病变有关。我们对8例以SVAS收入院的患儿，应用荧光原位杂交技术(FISH)，了解中国人中SVAS和WS患儿ELN缺失的不同程度，为鉴别诊断提供有力的实验室依据。
对象和方法
一、对象
1990年8月～1998年3月，以SVAS收治的8例住院患儿，男6例，女2例；年龄为2岁～12岁。根据超声心动图和心血管造影术诊断心脏畸形为SVAS。对患儿的随访时间为1997年11月～1998年4月。
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二、方法
1.WS的临床症状评估：根据Lowery等[1]于1995年提出的WS的表现型评分表(表1)评估8例患儿，0～3分者属“不确定”类，4～10分者属“典型”类。
表1 WS的表现型评分表 表现型
计分
典型的面容特征
3
智力障碍/发育迟滞
1
SVAS
2
非SVAS的先天性心脏畸形
, http://www.100md.com
1
腹股沟疝
1
高血钙症
2
总分
10
2.细胞遗传学检查：采用人外周血淋巴细胞培养法，制备染色体，G显带核型分析，并按人类细胞遗传学染色体命名的国际体制命名。
3.FISH：按上述细胞遗传学检查常规进行染色体制备。地高辛标记的单一序列探针WSCR购自Oncor公司。该探针包含7q11.23处的ELN位点和7q36处的D7S427对照位点。FISH步骤按说明书上进行。BX-50型Olympus荧光显微镜观察及显微照相。
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结果
一、临床症状评估结果
8例患儿的WS表现型评分结果和临床资料显示：“典型”类7例，“不确定”类1例(表2)。“特殊面容”包括头型瘦而长、前额宽广、眼距增宽或内眦赘皮、鼻梁扁平鼻孔上翘、长人中、宽嘴厚唇、小下颌、两颊饱满等。由专业人员根据相应的年龄对患儿进行智力测试，得分在70以下属“智力障碍”。
表2 8例患儿的临床表现 例号
年龄
(岁)
性别
特殊
面容
智力
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障碍
腹股
沟疝
非SVAS
心脏畸形
高血钙
Lowery
评分
FISH
结果
1
3
女
, 百拇医药 +
+
-
RPS LPS
-
7
+
2
19
男
+
+
+
-
, 百拇医药
ND
7
+
3
2
男
+
-
+
RPS
ND
4
-
4
, 百拇医药
2
男
-
-
-
-
-
2
-
5
9
男
+
+
, 百拇医药
-
RPS LSCAS
ND
7
+
6
7
男
+
+
+
LPS PDA
ND
8
, 百拇医药
+
7
9
女
-
-
+
RPS
ND
4
-
8
4
男
, 百拇医药
+
-
-
-
-
6
+
注：年龄为患儿随访年龄；RPS为右肺动脉分支狭窄，LPS为左肺动脉分支狭窄，LSCAS为左锁骨下动脉狭窄，PDA为动脉导管未闭，ND为未检测
二、细胞遗传学检查
8例患儿的外周血染色体标本的G显带结果均为正常。
三、FISH检查结果
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应用WSCR探针与8例标本玻片进行原位杂交，结果发现：3号、4号和7号标本的中期染色体中，7q11.23和7q36处均可见到特异性杂交信号，而余者5例均显示一条7号染色体仅存7q36处的对照位点信号(图1，2)。
图1 FISH检测正常样本显示二条染色体上均存在ELN和D7S427二个位点的杂交信号
图2 FISH对ELN半合子状态的检测结果(缺失样本)显示一条正常7号染色体,另一条为缺失(简头所示)的7号染色体,只存在对照的D7S427位点信号
讨论
我们对8例以SVAS收入院的患儿，首次应用FISH和Lowery评分法进行鉴别诊断，其中1例(4号)为单纯性SVAS，5例为WS，2例(3号、7号)尚属可疑。
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SVAS是一种引起血管梗阻的先天性心脏病。而WS临床症状变异性很大，幼年时表现往往不典型。Lowery提出的WS评分表中有6项指标，其中“高血钙”多发生在新生儿期。根据临床症状可大致分为“典型”和“不确定”二类。但对评分为临界状态的患儿，如果症状不典型，临床则较难确诊。
近年来分子遗传学方面的研究发现，SVAS与7号染色体上的ELN的异常病变有关[2，3]；而WS则是一种邻近基因缺失综合征[4]，由包括ELN在内的几个基因共同缺失造成。本研究首次在中国人中应用FISH鉴别SVAS与WS，结合Lowery的评分标准，对7名患儿作出WS临床诊断。从中可以肯定与单纯SVAS相比，WS患儿的一个ELN位点完全缺失形成半合子状态(hemizygosity)[5]。国外文献报道，90%以上的WS患者，FISH检测有效[6]。国内的研究尚属起步阶段。
但是Lowery还发现4%的“典型”类WS患儿，FISH检测缺失的结果为阴性[1]。同样在本研究中也发现类似病例如3号及7号，但值得提出的是该两例Lowery评分均较低。有人曾用DNA多态性和FISH同时检测ELN的缺失，这也提示我们对一些仍属可疑的病例可作进一步的研究。
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总之，现阶段FISH方法成熟，结果直观易懂，是一种协助临床鉴别诊断的有效方法。我们相信一旦确诊，除了给患儿必要的营养和治疗外，对早期遗传咨询也有巨大的帮助。
参考文献
1 Lowery MC，Morris CA，Ewart A，et al. Strong correlation of elastin deletion detected by FISH with Williams syndrome: evaluation of 235 patients.Am J Hum Genet，1995，57:49-53.
2 Ewart AK，Jin WS，Atkinson D，et al. Supravalvular aortic stenosis associated with a deletion disrupting the elastin gene. J Clin Invest，1994, 93:1071-1077.
, 百拇医药
3 Curran ME，Atkinson DL，Ewart AK，et al. The elastin gene is disrupting by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell，1993,73:159-168.
4 Keating MT. Genetic approaches to cardiovascular disease. Circulation，1995,92:142-147.
5 Joyce CA，Zorich B，Barber JCK，et al. Williams-Beuren syndrome: phenotypic variability and deletion of chromosomes 7，11，and 22 in a series of 52 patients. J Med Genet，1996, 33:986-992.
6 Nickerson E，Greenberg F，Keating MT，et al. Deletions of the elastin gene at 7q11.23 occur in approximately 90%of patients with Williams syndrome. Am J Hum Genet，1995,56: 1156-1161.
(收稿：1998-06-19 修回：1999-02-11), 百拇医药
单位：200092 上海市儿科医学研究所
关键词：原位杂交；荧光；基因缺失；主动脉瓣狭窄；威廉斯综合征
中华儿科杂志990909 【摘要】 目的 试图了解主动脉瓣上狭窄(SVAS)和Williams综合征(WS)患儿弹性蛋白基因(ELN)缺失的不同程度，从分子水平为鉴别诊断提供有力的实验室依据。方法 采用含ELN位点的地高辛标记的单一序列探针WSCR探针,对8例以SVAS收治入院的患儿染色体标本进行荧光原位杂交(FISH)，同时根据Lowery的WS表现型评分表进行症状评估。结果 8例患儿中5例为WS，1例为单纯性SVAS，另2例尚属可疑。结论 WS中ELN位点的缺失为半合子状态，FISH是一种协助临床鉴别中国人WS和SVAS的有效方法。
Elastin gene deletions detected by FISH in children with Williams syndrome and supravalvular aortic stenosis
, 百拇医药
LIANG Ying, ZHOU Aiqing,WANG Shixiong, et al.
Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To investigate the different degrees of elastin gene deletions in Chinese children with Williams syndrome (WS)and supravalvular aortic stenosis (SVAS), and provide an effective molecular laboratory test for the differentiation diagnosis. Methods Eight children with SVAS diagnosed by echocardiography and catheterization were examined by fluorescent in situ hybridization (FISH)with WSCR probe which included elastin gene locus. The clinical features of the patients were assessed according to Lowery′s phenotype scoring system of WS. Results Out of the 8 patients, 5 were diagnosed as WS, one as simple SVAS by FISH. Two patients remained undecided. Conclusion Hemizygosity of the elastin gene deletions was identified in patients with WS. FISH might be an useful genetic test for diagnosis of Chinese children with WS and SVAS.
, http://www.100md.com
【Key words】 In situ hybridization, fluorescence Gene deletion Aortic valve stenosis Williams syndrome
主动脉瓣上狭窄(SVAS)是一种先天性心脏病，若同时合并多器官功能紊乱则称为SVAS综合征，即Williams综合征(WS)。临床表现包括特殊面容、智力障碍等。近年来的研究表明，弹性蛋白基因(ELN)的异常改变与这两种病变有关。我们对8例以SVAS收入院的患儿，应用荧光原位杂交技术(FISH)，了解中国人中SVAS和WS患儿ELN缺失的不同程度，为鉴别诊断提供有力的实验室依据。
对象和方法
一、对象
1990年8月～1998年3月，以SVAS收治的8例住院患儿，男6例，女2例；年龄为2岁～12岁。根据超声心动图和心血管造影术诊断心脏畸形为SVAS。对患儿的随访时间为1997年11月～1998年4月。
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二、方法
1.WS的临床症状评估：根据Lowery等[1]于1995年提出的WS的表现型评分表(表1)评估8例患儿，0～3分者属“不确定”类，4～10分者属“典型”类。
表1 WS的表现型评分表 表现型
计分
典型的面容特征
3
智力障碍/发育迟滞
1
SVAS
2
非SVAS的先天性心脏畸形
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1
腹股沟疝
1
高血钙症
2
总分
10
2.细胞遗传学检查：采用人外周血淋巴细胞培养法，制备染色体，G显带核型分析，并按人类细胞遗传学染色体命名的国际体制命名。
3.FISH：按上述细胞遗传学检查常规进行染色体制备。地高辛标记的单一序列探针WSCR购自Oncor公司。该探针包含7q11.23处的ELN位点和7q36处的D7S427对照位点。FISH步骤按说明书上进行。BX-50型Olympus荧光显微镜观察及显微照相。
, http://www.100md.com
结果
一、临床症状评估结果
8例患儿的WS表现型评分结果和临床资料显示：“典型”类7例，“不确定”类1例(表2)。“特殊面容”包括头型瘦而长、前额宽广、眼距增宽或内眦赘皮、鼻梁扁平鼻孔上翘、长人中、宽嘴厚唇、小下颌、两颊饱满等。由专业人员根据相应的年龄对患儿进行智力测试，得分在70以下属“智力障碍”。
表2 8例患儿的临床表现 例号
年龄
(岁)
性别
特殊
面容
智力
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障碍
腹股
沟疝
非SVAS
心脏畸形
高血钙
Lowery
评分
FISH
结果
1
3
女
, 百拇医药 +
+
-
RPS LPS
-
7
+
2
19
男
+
+
+
-
, 百拇医药
ND
7
+
3
2
男
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+
RPS
ND
4
-
4
, 百拇医药
2
男
-
-
-
-
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2
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5
9
男
+
+
, 百拇医药
-
RPS LSCAS
ND
7
+
6
7
男
+
+
+
LPS PDA
ND
8
, 百拇医药
+
7
9
女
-
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+
RPS
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4
男
, 百拇医药
+
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-
-
-
6
+
注：年龄为患儿随访年龄；RPS为右肺动脉分支狭窄，LPS为左肺动脉分支狭窄，LSCAS为左锁骨下动脉狭窄，PDA为动脉导管未闭，ND为未检测
二、细胞遗传学检查
8例患儿的外周血染色体标本的G显带结果均为正常。
三、FISH检查结果
, http://www.100md.com
应用WSCR探针与8例标本玻片进行原位杂交，结果发现：3号、4号和7号标本的中期染色体中，7q11.23和7q36处均可见到特异性杂交信号，而余者5例均显示一条7号染色体仅存7q36处的对照位点信号(图1，2)。
图1 FISH检测正常样本显示二条染色体上均存在ELN和D7S427二个位点的杂交信号
图2 FISH对ELN半合子状态的检测结果(缺失样本)显示一条正常7号染色体,另一条为缺失(简头所示)的7号染色体,只存在对照的D7S427位点信号
讨论
我们对8例以SVAS收入院的患儿，首次应用FISH和Lowery评分法进行鉴别诊断，其中1例(4号)为单纯性SVAS，5例为WS，2例(3号、7号)尚属可疑。
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SVAS是一种引起血管梗阻的先天性心脏病。而WS临床症状变异性很大，幼年时表现往往不典型。Lowery提出的WS评分表中有6项指标，其中“高血钙”多发生在新生儿期。根据临床症状可大致分为“典型”和“不确定”二类。但对评分为临界状态的患儿，如果症状不典型，临床则较难确诊。
近年来分子遗传学方面的研究发现，SVAS与7号染色体上的ELN的异常病变有关[2，3]；而WS则是一种邻近基因缺失综合征[4]，由包括ELN在内的几个基因共同缺失造成。本研究首次在中国人中应用FISH鉴别SVAS与WS，结合Lowery的评分标准，对7名患儿作出WS临床诊断。从中可以肯定与单纯SVAS相比，WS患儿的一个ELN位点完全缺失形成半合子状态(hemizygosity)[5]。国外文献报道，90%以上的WS患者，FISH检测有效[6]。国内的研究尚属起步阶段。
但是Lowery还发现4%的“典型”类WS患儿，FISH检测缺失的结果为阴性[1]。同样在本研究中也发现类似病例如3号及7号，但值得提出的是该两例Lowery评分均较低。有人曾用DNA多态性和FISH同时检测ELN的缺失，这也提示我们对一些仍属可疑的病例可作进一步的研究。
, http://www.100md.com
总之，现阶段FISH方法成熟，结果直观易懂，是一种协助临床鉴别诊断的有效方法。我们相信一旦确诊，除了给患儿必要的营养和治疗外，对早期遗传咨询也有巨大的帮助。
参考文献
1 Lowery MC，Morris CA，Ewart A，et al. Strong correlation of elastin deletion detected by FISH with Williams syndrome: evaluation of 235 patients.Am J Hum Genet，1995，57:49-53.
2 Ewart AK，Jin WS，Atkinson D，et al. Supravalvular aortic stenosis associated with a deletion disrupting the elastin gene. J Clin Invest，1994, 93:1071-1077.
, 百拇医药
3 Curran ME，Atkinson DL，Ewart AK，et al. The elastin gene is disrupting by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell，1993,73:159-168.
4 Keating MT. Genetic approaches to cardiovascular disease. Circulation，1995,92:142-147.
5 Joyce CA，Zorich B，Barber JCK，et al. Williams-Beuren syndrome: phenotypic variability and deletion of chromosomes 7，11，and 22 in a series of 52 patients. J Med Genet，1996, 33:986-992.
6 Nickerson E，Greenberg F，Keating MT，et al. Deletions of the elastin gene at 7q11.23 occur in approximately 90%of patients with Williams syndrome. Am J Hum Genet，1995,56: 1156-1161.
(收稿：1998-06-19 修回：1999-02-11), 百拇医药