CD3AK细胞对人白血病多药耐药细胞系K562/VCR及K562/HHT细胞的杀伤作用
作者：徐卫群 郭淑芬
单位：310003 杭州，浙江大学附属儿童医院
关键词：白血病；抗体；单克隆；杀伤细胞；抗药性；多药
中华儿科杂志990907 【摘要】 目的 研究杀伤细胞对人白血病多药耐药(MDR)细胞系的杀伤作用。方法 (1) 采用体外药敏试验(MTT法)检测两株MDR细胞系，即K562/VCR和K562/HHT 细胞的耐药性。(2)用优选方案诱导效应细胞：50 ng/ml的抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)和50 U/ml的IL-2诱导的CD3AK细胞(CD3McAb activated killer cell)；400 U/ml的IL-2诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)。(3)以3H-TdR掺入法测定效应细胞的增殖活性。(4)以3H-TdR释放法测定效应细胞对K562细胞及其两个MDR细胞系的杀伤活性。结果 (1) K562/VCR、K562/HHT经冻存-复苏后无药培养1～2个月仍具有高度耐药性。(2)成功地诱导出CD3AK+/-细胞及LAK细胞。(3)CD3AK+细胞的增殖活性较LAK细胞强；CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性较LAK细胞强，且维持时间较LAK细胞长。(4)CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于对敏感细胞K562，其对K562/HHT细胞的杀伤活性与其对K562细胞的杀伤活性比较，差异无显著性。LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性比较，均与对K562细胞的杀伤活性差异无显著性。且CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于LAK细胞。结论 CD3AK+细胞对白血病细胞具有很强的杀伤活性，可望作为较理想的效应细胞用于耐药白血病的过继免疫治疗。
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The cytotoxicities of anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells against human multidrug resistant leukemic cell lines
XU Weiqun, GUO Shufen.
Children′s Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the cytotoxicities of the killer cells to human multidrug resistant (MDR) leukemic cell lines. Methods (1) The sensitivities of two MDR cell lines (K562/VCR and K562/HHT) reacted to vincristine (VCR), high harringtonine (HHT) and daunorubicin (DNR) were examined by MTT assay. (2) For induction of effector cells, 50 ng/ml of CD3 monoclonal antibody (CD3 McAb) and 50 U/ml of IL-2 were selected as the optimal condition for the induction of CD3McAb activated killer cells (CD3AK cells); 400 U/ml of IL-2 was used for the generation of lymphokine activated killer cells (LAK cells). (3)Proliferations of the effector cells were determined by 3 H-TdR uptake assay. (4) Cytotoxicities of the killer cells to K562 as well as the two MDR cell lines of K562 were determined by 3 H-thymidine (3H-TdR) release assay. Results (1) The multi-drug resistance consistently existed in both cell lines of K562/VCR and K562/HHT thawed after freezing and cultured for 1～2 months with drug-free medium. (2) CD3AK+/- and LAK cells were successfully induced. (3) The proliferation of CD3AK+ cells was much stronger than that of LAK cells. The cytolysis of K562 cells by CD3AK+ cells was higher than that of CD3AK- and LAK cells. The duration of the cytolytic activity of CD3AK+ cells was longer than that of the LAK cells. (4) The hilling activing of CD3AK+ cells showed significantly higher to K562/VCR cells than to K562 cells, while there was no difference of cytotoxicity between K562 /HHT and K562 cells. No significant difference was found in LAK-mediated cell killing either to K562/VCR and K562 /HHT cells or to K562 cells. The cell-mediated killing of K562/VCR cells by CD3AK+ cells was significantly higher than that by LAK cells. Conclusion CD3AK+ cells might be used as effector cells in adoptive immunotherapy of drug-resistant leukemic patients.
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【Key words】 Leukemia Antibodies, monoclonal Killer cells Drug resistance, multiple
白血病是小儿时期发病率最高的恶性肿瘤，化学治疗是其目前主要的治疗手段。耐药性的产生是化疗失败的主要原因。文献报道淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell, LAK)对多数白血病耐药细胞系具有较高甚至有高于对敏感细胞系的杀伤活性[1]，故可以用细胞过继免疫疗法辅助克服白血病的耐药。又据曹建平等[2]报道，抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3McAb activated killer cell,CD3AK)与LAK细胞相比，具有体外增殖活性强、体内外杀伤活性强、IL-2用量少、体内应用副作用小等优点。CD3AK细胞在体外和体内实验中均对白血病细胞具有高效杀伤作用[3]。鉴于以CD3AK细胞作为效应细胞杀伤人白血病多药耐药(MDR)细胞的实验研究国内外尚未见报道，为此我们进行了本研究。
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材料和方法
一、材料
1.细胞系：K562为本院血液恶性肿瘤研究室保存的细胞系；K562/VCR、K562/HHT为本室诱导建立的MDR细胞系[4]。
2.主要试剂：抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)：军事医学科学院生物制剂发展中心产品。人重组IL-2(rhIL-2/IL-2):上海华新生物制品公司产品。噻唑蓝(MTT)：瑞士Fluka公司产品。3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)：中国原子能研究所产品。
二、方法
1. 细胞培养：(1) 将白血病细胞系常规培养于RPMI-1640完全培养液[含10%新生牛血清(FCS)，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液]中。MDR细胞系于RPMI-1640完全培养液中加100 ng/ml原诱导药物以维持其耐药性,于实验前无药培养2～4周[4]。 (2) 将CD3AK及LAK细胞培养于效应细胞培养液[含10%FCS，5×10-5 mol/L 二巯基乙醇(2-ME)，2 mmol/L的L-谷氨酰胺(L-glu)，25 mmol/L的N-2-羟基乙酯呱嗪乙烷硫酸(HEPES)，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基[5]]中。培养条件为37℃、5%CO2、全湿度。
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2. 靶细胞耐药性的检测(MTT法)[6]：分别检测长春新碱(VCR)、高三尖杉酯碱(HHT)和柔红霉素(DNR)对K562/VCR 和 K562/HHT的半数抑制浓度(IC50)。
3.效应细胞的诱导[5]：常规分离正常人外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC以低浓度的CD3McAb和低浓度的IL-2共同作用诱导CD3AK细胞(以CD3McAb和IL-2共同激活48～72小时后,以含CD3McAb和IL-2的效应细胞培养液维持培养诱导出CD3AK+细胞，以仅含IL-2的效应细胞培养液中维持培养诱导出CD3AK-细胞，统称为CD3AK细胞)；PBMC仅以IL-2作用诱导出LAK细胞。均为优选诱导方案。
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4. 效应细胞增殖活性的测定：3H-TdR掺入法[7]。将效应细胞加入96孔板中培养，于培养终止前6小时加入25 μci/ml的3H-TdR 20 μl/孔，培养结束后收集细胞，烘干后测定每分钟计数(count per minute，CPM)值。
5. 效应细胞杀伤活性的测定：3H-TdR释放法[8]。(1) 标记靶细胞：取前1天传代的靶细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。在0.8 ml靶细胞悬液中加入90.9 μci/ml的3H-TdR 100 μl，标记4小时，每半小时摇1次，标记后洗3次，调整细胞浓度为2×105/ml。(2)效应细胞洗3次，调整细胞浓度为5×106/ml 。(3)效靶结合：96孔板中先加入靶细胞50 μl/孔，后加效应细胞100 μl/孔，空白孔仅加100 μl 效应细胞培养液，效靶比为50：1。培养18小时，于培养终止前半小时加入含0.6 mg的胰蛋白酶、10 μg DNA酶的混合酶液50 μl/孔，振荡后继续培养30分钟收集细胞，烘干后测定CPM值。
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6.统计学处理：两组均值比较用t检验，多组均值比较用两因素或单因素方差分析，在586微机上用SPSS统计软件包进行分析。
结果
一、靶细胞耐药性的检测(表1)
表1 K562/VCR和K562/HHT细胞系对VCR、HHT、DNR的耐药性(n=3) 药物
K562
IC50(μg/ml)
K562/VCR
K562/HHT
IC50(μg/ml)
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RF(倍)
IC50(μg/ml)
RF(倍)
VCR
0.008
>100.000
>12500.0
94.400
11800.0
HHT
0.097
99.273
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1 023.4
84.860
874.8
DNR
0.008
0.451
56.4
0.733
91.6
表1显示K562/VCR、K562/HHT细胞经冻存-复苏后无药培养1～2个月对VCR、HHT仍具高度耐药性(RF>100)，对DNR仍具中度耐药性(10
二、效应细胞诱导方案的优选
1.CD3AK细胞诱导方案的优选：(1)首先观察 CD3AK细胞在96孔板中，不更换培养液的条件下持续培养9天的增殖情况。结果表明，CD3AK细胞在诱导第7天时3H-TdR掺入最多，故以第7天的CPM值作为摸索CD3AK细胞诱导方案的指标。(2) 固定IL-2浓度为50 U/ml，以不同浓度(50～1 000 ng/ml)的CD3McAb诱导CD3AK细胞。结果表明各浓度CD3McAb诱导的CD3AK细胞的CPM值差异无显著性(单因素方差分析，F=1.94，P=0.14)。因此选择低浓度(50 ng/ml)的CD3McAb诱导CD3AK细胞。(3) 固定CD3McAb浓度为50 ng/ml，以不同浓度(50～200 U/ml)的IL-2诱导CD3AK细胞。得到不同浓度IL-2诱导的CD3AK 细胞的CPM值，比较其差异亦无显著性(单因素方差分析，F=0.31，P=0.74)。故确定以50ng/ml的CD3McAb和50 U/ml的IL-2诱导扩增CD3AK细胞。
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2. LAK细胞诱导方案的优选：以不同浓度(50～800 U/ml)IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞进行杀伤，结果表明：(1)分别比较50～200和400～800 U/ml的IL-2诱导的LAK细胞分别对K562细胞的杀伤活性，差异无显著性。(2)400 U/ml的IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性显著强于200 U/ml的 IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性[单因素方差分析，F=3.51，P=0.049，(26.4±4.5)%, (36.0±3.8)%，q检验，P<0.05]。故选择IL-2浓度为400 U/ml诱导LAK细胞。
三、CD3AK和LAK细胞杀伤活性的比较
1. CD3AK+和CD3AK-细胞对K562细胞杀伤活性的比较：诱导第7天的CD3AK+细胞对K562细胞杀伤活性为(41.5±5.9)%，显著强于CD3AK-细胞对K562细胞的杀伤活性(29.5±10.0)%(t=3.11，n=9，P=0.007)。故在CD3AK细胞中选择杀伤活性强的CD3AK+细胞进行以下实验。
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2. CD3AK+和LAK细胞对K562细胞杀伤活性的比较(表2): (1) CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性显著强于LAK细胞(两因素方差分析，F=5.10，P=0.04)。 (2)不同诱导时间效应细胞对靶细胞的杀伤活性有显著差异(两因素方差分析，F=3.5，P=0.03),其中诱导第17天的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性为(29.5±8.2)%，显著低于诱导第10天的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性(46.5±7.3)%(q检验，P=0.04)，而不同诱导时间的CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性差异没有显著意义(单因素方差分析，F=0.91，P=0.49)。表2 CD3AK+和LAK细胞对K562细胞的杀伤活性 (n=3，%，
) K562细胞系的诱导时间(天)
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CD3AK+
LAK
4
48.0± 3.5
39.8±0.4
7
43.2± 3.3
42.9±3.7
10
50.3±12.8
46.5±7.3
13
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49.0± 6.7
41.9±3.7
17
40.5± 1.3
29.5±8.2
由表2可见CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性较LAK细胞强，维持时间较LAK细胞长，并可见CD3AK+和LAK细胞在诱导第7天即对K562细胞具有较高的杀伤活性，故以下实验中以诱导第7天的CD3AK+和LAK细胞杀伤K562及其两株MDR细胞系。
3.CD3AK+和LAK细胞增殖活性的比较：诱导第7天的CD3AK+细胞3H-TdR掺入的CPM值为2 445±1 106，LAK细胞3H-TdR掺入的CPM值为1 035±331，CD3AK+细胞的增殖活性显著强于LAK细胞(t′=2.73，n=5，P=0.04)。
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四、CD3AK+和LAK细胞对K562敏感和MDR细胞系杀伤活性的比较
1. CD3AK+细胞对K562和K562/VCR、K562/HHT细胞的杀伤活性：(1) CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性显著强于其对K562细胞的杀伤活性(t=2.86，n=9，P=0.01)。(2)CD3AK+细胞对K562/HHT细胞的杀伤活性与对K562细胞的杀伤活性比较，两者差异无显著性(t=0.51，n=9，P=0.62)。
2. LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性与对K562细胞的杀伤活性分别比较，差异均无显著性(t1=1.10，P1=0.30；t2=1.48，P2=0.17，n均为6)。
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3. CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性显著强于LAK细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性(t′=3.99，n1=9，n2=6，P=0.003)。讨论
本研究成功地诱导了CD3AK+/-细胞和LAK细胞，得出50 ng/ml的CD3McAb和50 U/ml的IL-2即足以激活CD3AK细胞的增殖和杀伤活性，而LAK细胞至少需400 U/ml的IL-2才能诱导出较高的杀伤活性。我们以CD3AK+细胞和LAK细胞对K562细胞进行了杀伤作用的研究，结果表明，CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性强于CD3AK-和LAK细胞对K562细胞的杀伤活性。然后以CD3AK+细胞和LAK细胞对K562及其两株MDR细胞系进行了杀伤作用的研究。该两株耐药细胞系经体外药敏试验(MTT法)检测证实经冻存1年，复苏后无药培养1～2个月仍保持高度耐药性。本研究结果表明，CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于对敏感细胞系，其对K562/HHT细胞的杀伤活性与对敏感细胞系的杀伤活性差异无显著性；而LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性与对敏感细胞的杀伤活性差异均无显著性，且CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于LAK细胞对K562/VCR的杀伤活性。即我们诱导的CD3AK+和LAK细胞对该两株人白血病MDR细胞系的杀伤活性至少等同于甚至有的强于其对敏感细胞系的杀伤活性，其中以CD3AK+细胞对敏感和耐药细胞系的杀伤活性最强。
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在白血病细胞对化疗药物产生抵抗后，增加化疗药物的用量并不能有效地杀死耐药白血病细胞，而毒副作用的增加却使病人难以耐受。此时细胞过继免疫疗法即显示出优越性：(1) 据报道杀伤细胞对耐药白血病细胞具有较高甚至高于对敏感细胞的杀伤活性[1]，可有效地杀死耐药白血病细胞；(2) 副作用相对较小；(3) 还有部分免疫调节作用[9]。而且本研究结果还表明，CD3AK+细胞的增殖及杀伤活性均较LAK细胞强，维持时间也较LAK细胞长，便于获得足够数量的高效杀伤细胞；而且对IL-2的依赖性较LAK细胞低，可减少临床应用时因IL-2大量输注引起的副作用。鉴于CD3AK+细胞对人白血病MDR细胞系K562/VCR细胞具有强于对敏感细胞的杀伤活性，故CD3AK+细胞可望作为较理想的效应细胞用于耐药白血病的过继免疫治疗。
本课题由浙江省自然科学基金资助(项目编号：396455)
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参考文献
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8 吴厚生，谢琪，姜小玲，等. 用3H-TdR释放法测量细胞介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志，1987，7：230-233.
9 虞喜豪，程永德，饶灵宁，等. CD3单克隆抗体激活细胞用于中晚期癌肿临床治疗初步观察. 中国肿瘤生物治疗杂志， 1995，2：260.
(收稿：1998-07-10 修回：1999-02-23), 百拇医药
单位：310003 杭州，浙江大学附属儿童医院
关键词：白血病；抗体；单克隆；杀伤细胞；抗药性；多药
中华儿科杂志990907 【摘要】 目的 研究杀伤细胞对人白血病多药耐药(MDR)细胞系的杀伤作用。方法 (1) 采用体外药敏试验(MTT法)检测两株MDR细胞系，即K562/VCR和K562/HHT 细胞的耐药性。(2)用优选方案诱导效应细胞：50 ng/ml的抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)和50 U/ml的IL-2诱导的CD3AK细胞(CD3McAb activated killer cell)；400 U/ml的IL-2诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)。(3)以3H-TdR掺入法测定效应细胞的增殖活性。(4)以3H-TdR释放法测定效应细胞对K562细胞及其两个MDR细胞系的杀伤活性。结果 (1) K562/VCR、K562/HHT经冻存-复苏后无药培养1～2个月仍具有高度耐药性。(2)成功地诱导出CD3AK+/-细胞及LAK细胞。(3)CD3AK+细胞的增殖活性较LAK细胞强；CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性较LAK细胞强，且维持时间较LAK细胞长。(4)CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于对敏感细胞K562，其对K562/HHT细胞的杀伤活性与其对K562细胞的杀伤活性比较，差异无显著性。LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性比较，均与对K562细胞的杀伤活性差异无显著性。且CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于LAK细胞。结论 CD3AK+细胞对白血病细胞具有很强的杀伤活性，可望作为较理想的效应细胞用于耐药白血病的过继免疫治疗。
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The cytotoxicities of anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells against human multidrug resistant leukemic cell lines
XU Weiqun, GUO Shufen.
Children′s Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the cytotoxicities of the killer cells to human multidrug resistant (MDR) leukemic cell lines. Methods (1) The sensitivities of two MDR cell lines (K562/VCR and K562/HHT) reacted to vincristine (VCR), high harringtonine (HHT) and daunorubicin (DNR) were examined by MTT assay. (2) For induction of effector cells, 50 ng/ml of CD3 monoclonal antibody (CD3 McAb) and 50 U/ml of IL-2 were selected as the optimal condition for the induction of CD3McAb activated killer cells (CD3AK cells); 400 U/ml of IL-2 was used for the generation of lymphokine activated killer cells (LAK cells). (3)Proliferations of the effector cells were determined by 3 H-TdR uptake assay. (4) Cytotoxicities of the killer cells to K562 as well as the two MDR cell lines of K562 were determined by 3 H-thymidine (3H-TdR) release assay. Results (1) The multi-drug resistance consistently existed in both cell lines of K562/VCR and K562/HHT thawed after freezing and cultured for 1～2 months with drug-free medium. (2) CD3AK+/- and LAK cells were successfully induced. (3) The proliferation of CD3AK+ cells was much stronger than that of LAK cells. The cytolysis of K562 cells by CD3AK+ cells was higher than that of CD3AK- and LAK cells. The duration of the cytolytic activity of CD3AK+ cells was longer than that of the LAK cells. (4) The hilling activing of CD3AK+ cells showed significantly higher to K562/VCR cells than to K562 cells, while there was no difference of cytotoxicity between K562 /HHT and K562 cells. No significant difference was found in LAK-mediated cell killing either to K562/VCR and K562 /HHT cells or to K562 cells. The cell-mediated killing of K562/VCR cells by CD3AK+ cells was significantly higher than that by LAK cells. Conclusion CD3AK+ cells might be used as effector cells in adoptive immunotherapy of drug-resistant leukemic patients.
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【Key words】 Leukemia Antibodies, monoclonal Killer cells Drug resistance, multiple
白血病是小儿时期发病率最高的恶性肿瘤，化学治疗是其目前主要的治疗手段。耐药性的产生是化疗失败的主要原因。文献报道淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell, LAK)对多数白血病耐药细胞系具有较高甚至有高于对敏感细胞系的杀伤活性[1]，故可以用细胞过继免疫疗法辅助克服白血病的耐药。又据曹建平等[2]报道，抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3McAb activated killer cell,CD3AK)与LAK细胞相比，具有体外增殖活性强、体内外杀伤活性强、IL-2用量少、体内应用副作用小等优点。CD3AK细胞在体外和体内实验中均对白血病细胞具有高效杀伤作用[3]。鉴于以CD3AK细胞作为效应细胞杀伤人白血病多药耐药(MDR)细胞的实验研究国内外尚未见报道，为此我们进行了本研究。
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一、材料
1.细胞系：K562为本院血液恶性肿瘤研究室保存的细胞系；K562/VCR、K562/HHT为本室诱导建立的MDR细胞系[4]。
2.主要试剂：抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)：军事医学科学院生物制剂发展中心产品。人重组IL-2(rhIL-2/IL-2):上海华新生物制品公司产品。噻唑蓝(MTT)：瑞士Fluka公司产品。3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)：中国原子能研究所产品。
二、方法
1. 细胞培养：(1) 将白血病细胞系常规培养于RPMI-1640完全培养液[含10%新生牛血清(FCS)，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液]中。MDR细胞系于RPMI-1640完全培养液中加100 ng/ml原诱导药物以维持其耐药性,于实验前无药培养2～4周[4]。 (2) 将CD3AK及LAK细胞培养于效应细胞培养液[含10%FCS，5×10-5 mol/L 二巯基乙醇(2-ME)，2 mmol/L的L-谷氨酰胺(L-glu)，25 mmol/L的N-2-羟基乙酯呱嗪乙烷硫酸(HEPES)，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基[5]]中。培养条件为37℃、5%CO2、全湿度。
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2. 靶细胞耐药性的检测(MTT法)[6]：分别检测长春新碱(VCR)、高三尖杉酯碱(HHT)和柔红霉素(DNR)对K562/VCR 和 K562/HHT的半数抑制浓度(IC50)。
3.效应细胞的诱导[5]：常规分离正常人外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC以低浓度的CD3McAb和低浓度的IL-2共同作用诱导CD3AK细胞(以CD3McAb和IL-2共同激活48～72小时后,以含CD3McAb和IL-2的效应细胞培养液维持培养诱导出CD3AK+细胞，以仅含IL-2的效应细胞培养液中维持培养诱导出CD3AK-细胞，统称为CD3AK细胞)；PBMC仅以IL-2作用诱导出LAK细胞。均为优选诱导方案。
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4. 效应细胞增殖活性的测定：3H-TdR掺入法[7]。将效应细胞加入96孔板中培养，于培养终止前6小时加入25 μci/ml的3H-TdR 20 μl/孔，培养结束后收集细胞，烘干后测定每分钟计数(count per minute，CPM)值。
5. 效应细胞杀伤活性的测定：3H-TdR释放法[8]。(1) 标记靶细胞：取前1天传代的靶细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。在0.8 ml靶细胞悬液中加入90.9 μci/ml的3H-TdR 100 μl，标记4小时，每半小时摇1次，标记后洗3次，调整细胞浓度为2×105/ml。(2)效应细胞洗3次，调整细胞浓度为5×106/ml 。(3)效靶结合：96孔板中先加入靶细胞50 μl/孔，后加效应细胞100 μl/孔，空白孔仅加100 μl 效应细胞培养液，效靶比为50：1。培养18小时，于培养终止前半小时加入含0.6 mg的胰蛋白酶、10 μg DNA酶的混合酶液50 μl/孔，振荡后继续培养30分钟收集细胞，烘干后测定CPM值。
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6.统计学处理：两组均值比较用t检验，多组均值比较用两因素或单因素方差分析，在586微机上用SPSS统计软件包进行分析。
结果
一、靶细胞耐药性的检测(表1)
表1 K562/VCR和K562/HHT细胞系对VCR、HHT、DNR的耐药性(n=3) 药物
K562
IC50(μg/ml)
K562/VCR
K562/HHT
IC50(μg/ml)
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RF(倍)
IC50(μg/ml)
RF(倍)
VCR
0.008
>100.000
>12500.0
94.400
11800.0
HHT
0.097
99.273
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1 023.4
84.860
874.8
DNR
0.008
0.451
56.4
0.733
91.6
表1显示K562/VCR、K562/HHT细胞经冻存-复苏后无药培养1～2个月对VCR、HHT仍具高度耐药性(RF>100)，对DNR仍具中度耐药性(10
二、效应细胞诱导方案的优选
1.CD3AK细胞诱导方案的优选：(1)首先观察 CD3AK细胞在96孔板中，不更换培养液的条件下持续培养9天的增殖情况。结果表明，CD3AK细胞在诱导第7天时3H-TdR掺入最多，故以第7天的CPM值作为摸索CD3AK细胞诱导方案的指标。(2) 固定IL-2浓度为50 U/ml，以不同浓度(50～1 000 ng/ml)的CD3McAb诱导CD3AK细胞。结果表明各浓度CD3McAb诱导的CD3AK细胞的CPM值差异无显著性(单因素方差分析，F=1.94，P=0.14)。因此选择低浓度(50 ng/ml)的CD3McAb诱导CD3AK细胞。(3) 固定CD3McAb浓度为50 ng/ml，以不同浓度(50～200 U/ml)的IL-2诱导CD3AK细胞。得到不同浓度IL-2诱导的CD3AK 细胞的CPM值，比较其差异亦无显著性(单因素方差分析，F=0.31，P=0.74)。故确定以50ng/ml的CD3McAb和50 U/ml的IL-2诱导扩增CD3AK细胞。
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2. LAK细胞诱导方案的优选：以不同浓度(50～800 U/ml)IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞进行杀伤，结果表明：(1)分别比较50～200和400～800 U/ml的IL-2诱导的LAK细胞分别对K562细胞的杀伤活性，差异无显著性。(2)400 U/ml的IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性显著强于200 U/ml的 IL-2诱导的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性[单因素方差分析，F=3.51，P=0.049，(26.4±4.5)%, (36.0±3.8)%，q检验，P<0.05]。故选择IL-2浓度为400 U/ml诱导LAK细胞。
三、CD3AK和LAK细胞杀伤活性的比较
1. CD3AK+和CD3AK-细胞对K562细胞杀伤活性的比较：诱导第7天的CD3AK+细胞对K562细胞杀伤活性为(41.5±5.9)%，显著强于CD3AK-细胞对K562细胞的杀伤活性(29.5±10.0)%(t=3.11，n=9，P=0.007)。故在CD3AK细胞中选择杀伤活性强的CD3AK+细胞进行以下实验。
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2. CD3AK+和LAK细胞对K562细胞杀伤活性的比较(表2): (1) CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性显著强于LAK细胞(两因素方差分析，F=5.10，P=0.04)。 (2)不同诱导时间效应细胞对靶细胞的杀伤活性有显著差异(两因素方差分析，F=3.5，P=0.03),其中诱导第17天的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性为(29.5±8.2)%，显著低于诱导第10天的LAK细胞对K562细胞的杀伤活性(46.5±7.3)%(q检验，P=0.04)，而不同诱导时间的CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性差异没有显著意义(单因素方差分析，F=0.91，P=0.49)。表2 CD3AK+和LAK细胞对K562细胞的杀伤活性 (n=3，%，
) K562细胞系的诱导时间(天), 百拇医药
CD3AK+
LAK
4
48.0± 3.5
39.8±0.4
7
43.2± 3.3
42.9±3.7
10
50.3±12.8
46.5±7.3
13
, 百拇医药
49.0± 6.7
41.9±3.7
17
40.5± 1.3
29.5±8.2
由表2可见CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性较LAK细胞强，维持时间较LAK细胞长，并可见CD3AK+和LAK细胞在诱导第7天即对K562细胞具有较高的杀伤活性，故以下实验中以诱导第7天的CD3AK+和LAK细胞杀伤K562及其两株MDR细胞系。
3.CD3AK+和LAK细胞增殖活性的比较：诱导第7天的CD3AK+细胞3H-TdR掺入的CPM值为2 445±1 106，LAK细胞3H-TdR掺入的CPM值为1 035±331，CD3AK+细胞的增殖活性显著强于LAK细胞(t′=2.73，n=5，P=0.04)。
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四、CD3AK+和LAK细胞对K562敏感和MDR细胞系杀伤活性的比较
1. CD3AK+细胞对K562和K562/VCR、K562/HHT细胞的杀伤活性：(1) CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性显著强于其对K562细胞的杀伤活性(t=2.86，n=9，P=0.01)。(2)CD3AK+细胞对K562/HHT细胞的杀伤活性与对K562细胞的杀伤活性比较，两者差异无显著性(t=0.51，n=9，P=0.62)。
2. LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性与对K562细胞的杀伤活性分别比较，差异均无显著性(t1=1.10，P1=0.30；t2=1.48，P2=0.17，n均为6)。
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3. CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性显著强于LAK细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性(t′=3.99，n1=9，n2=6，P=0.003)。讨论
本研究成功地诱导了CD3AK+/-细胞和LAK细胞，得出50 ng/ml的CD3McAb和50 U/ml的IL-2即足以激活CD3AK细胞的增殖和杀伤活性，而LAK细胞至少需400 U/ml的IL-2才能诱导出较高的杀伤活性。我们以CD3AK+细胞和LAK细胞对K562细胞进行了杀伤作用的研究，结果表明，CD3AK+细胞对K562细胞的杀伤活性强于CD3AK-和LAK细胞对K562细胞的杀伤活性。然后以CD3AK+细胞和LAK细胞对K562及其两株MDR细胞系进行了杀伤作用的研究。该两株耐药细胞系经体外药敏试验(MTT法)检测证实经冻存1年，复苏后无药培养1～2个月仍保持高度耐药性。本研究结果表明，CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于对敏感细胞系，其对K562/HHT细胞的杀伤活性与对敏感细胞系的杀伤活性差异无显著性；而LAK细胞对K562/VCR和K562/HHT细胞的杀伤活性与对敏感细胞的杀伤活性差异均无显著性，且CD3AK+细胞对K562/VCR细胞的杀伤活性强于LAK细胞对K562/VCR的杀伤活性。即我们诱导的CD3AK+和LAK细胞对该两株人白血病MDR细胞系的杀伤活性至少等同于甚至有的强于其对敏感细胞系的杀伤活性，其中以CD3AK+细胞对敏感和耐药细胞系的杀伤活性最强。
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在白血病细胞对化疗药物产生抵抗后，增加化疗药物的用量并不能有效地杀死耐药白血病细胞，而毒副作用的增加却使病人难以耐受。此时细胞过继免疫疗法即显示出优越性：(1) 据报道杀伤细胞对耐药白血病细胞具有较高甚至高于对敏感细胞的杀伤活性[1]，可有效地杀死耐药白血病细胞；(2) 副作用相对较小；(3) 还有部分免疫调节作用[9]。而且本研究结果还表明，CD3AK+细胞的增殖及杀伤活性均较LAK细胞强，维持时间也较LAK细胞长，便于获得足够数量的高效杀伤细胞；而且对IL-2的依赖性较LAK细胞低，可减少临床应用时因IL-2大量输注引起的副作用。鉴于CD3AK+细胞对人白血病MDR细胞系K562/VCR细胞具有强于对敏感细胞的杀伤活性，故CD3AK+细胞可望作为较理想的效应细胞用于耐药白血病的过继免疫治疗。
本课题由浙江省自然科学基金资助(项目编号：396455)
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(收稿：1998-07-10 修回：1999-02-23), 百拇医药