低CD40L表达在儿童单纯性肾病综合征低IgG血症发生中的作用
作者：王菁 杨锡强 李成荣 李永柏 蒋利萍 王莉佳 张远维
单位：重庆医科大学附属儿童医院 410014；王菁 现在 华西医科大学附属第二医院 610041
关键词：
中华儿科杂志991214 单纯性肾病综合征低IgG血症的发生机制至今尚不清楚。研究表明与 T细胞功能紊乱致Ig同种型转换障碍有关[1]。近年发现CD40L信号在同种型转换中发挥了重要作用，其表达缺失或减少是X连锁高IgM血症(X-HIM)血清Ig水平异常的原因[2]。我们检测了单纯性肾病患儿T细胞CD40LmRNA和蛋白质表达，分析其表达与血清IgG水平的相关性，并探讨了CD40单克隆抗体(CD40mAb)对体外产生IgG及其亚类的调节作用。
对象：(1)研究组：单纯性肾病综合征患儿16例，发作期11例，恢复期5例，诊断按全国儿科肾病协作组制定的标准[3]。男10例，女6例，年龄2～8岁。发作期和恢复期患儿采血前1月未用皮质激素及免疫抑制剂治疗。(2)对照组：健康儿童20例，男12例，女8例，年龄1.5岁～8岁。
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方法：常规分离人外周血单个核细胞(PBMC)，加植物血凝素(PHA)终浓度50 μg/ml，常规培养6小时。用TRIZOL试剂盒抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，分别扩增β-actin(1 126 bp)和CD40L(809 bp)。以CD40L/β-actin平均吸光度值之比表示CD40LmRNA的相对表达强度。1×106/ml PBMC加PMA(终浓度10 μg /ml) A23187(终浓度1 μg /ml)，常规培养6小时，收集细胞行荧光染色。阳性对照为鼠抗人CD40L-PE，阴性对照为抗鼠IgG1-PE。4℃避光孵育30分钟，上机检测。正常、发作期、发作期加CD40mAb(终浓度2 μg/ml) 处理组PBMC悬液分别加PWM (终浓度3 μg/ml) 常规培养10天，收集上清用ELISA法检测。血清免疫球蛋白采用多克隆抗体单向免疫扩散法检测。
统计学处理：多组间方差检验和两组间t检验,以及相关性分析。
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结果：(1)外周血T细胞CD40 LmRNA和蛋白质表达情况：与正常组比较，患儿发作期CD40LmRNA和蛋白质表达明显降低，恢复期表达无明显差异。(2)T细胞CD40L表达与血清IgG水平的相关性：与正常组相比，患儿发作期血清IgG水平明显降低，IgM水平增高、IgA无明显变化，发作期和恢复期血清IgG水平与CD40L mRNA表达呈显著正相关(r=0.49，0.70，P均<0.05)，与CD40L蛋白质表达呈显著正相关(r=0.65，0.74，P均<0.05)。(3)CD40mAb对体外培养患儿PBMC IgG及其亚类生成的影响：与正常组比较，患儿PBMC生成IgG明显降低(P<0.05)，为正常水平的42%。IgG1，IgG2，IgG4有不同程度的降低，分别为正常水平的34%，53%，49%(P均<0.05)，IgG3无明显变化。患儿PBMC加CD40mAb培养后，其上清IgG水平明显增加，达正常水平的64%(P<0.05)，IgG1、IgG2、IgG4生成也有不同程度的增加，分别达正常水平的58%，64%，67%(P均<0.05)，但与正常组相比差异仍有显著差异(P均<0.05)。
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讨论：单纯性肾病综合征发作期患儿血清IgG水平降低的原因仍不清楚。既往研究证明患儿低IgG血症与Ig同种型转换障碍有关，推测T细胞功能缺陷使B细胞合成IgM→IgG的转换过程受抑[1]。CD40L-CD40是T、B细胞间一对信号传递分子，CD40L主要存在于活化的 CD4+T细胞，与B细胞CD40交联后参与B细胞活化，增殖及抗体同种型转换[4]。X-HIM综合征患者CD40L基因突变或缺失引起抗体同种型转换完全阻断，免疫球蛋白重链(IgH)稳定区上游μ基因的表达过度产生高IgM血症，下游基因转换重组受阻使 IgG、IgA、IgE缺失或水平异常低下[2]。
本结果提示，T细胞CD40L表达降低参与低IgG血症的发生。其机制为：单纯性肾病患儿CD40L表达是部分降低，故IgH同种型转换不会完全受阻，因此μ基因下游各CH基因均可不同程度被转录，IgM及其邻近下游基因产物IgG3基本正常，其他IgG亚类水平降低，导致低IgG血症。而血清IgA、IgE水平并不因CD40L信号减弱而降低甚至增高，这可能与Ig类型转换特异性调控因子——细胞因子的作用有关。用 CD40mAb代替CD40L，激活CD40使患儿B细胞活化、增殖和分化，促进IgG及IgG1、IgG2、IgG4的同种型转换。但其上调作用仍未使IgG及其亚类水平达到正常，进一步提示本病低IgG血症还有其他因素参与。
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参考文献
1 Giangiacomo J, Clearly TG, Cole BR, et al. Serum immunoglobulins in the nephrotic syndrome. N Engl J Med, 1975, 293: 8-12.
2 Korthauer UIF, Graf D, Mages HW, et al. Defective expression of T-cell CD40 ligand caused X-linked immunodeficiency with hyper-IgM. Nature, 1993, 361: 539-543.
3 姜新猷,陈荣华,王宝琳，整理.《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志, 1981, 19:241-243.
4 Laman JD, Cleassen E, Nolle RJ, Function of CD40 and its ligand, gp39 (CD40L). Crit Rev Immunol, 1996, 16: 59.
(收稿：1998-12-31 修回：1999-05-04), 百拇医药
单位：重庆医科大学附属儿童医院 410014；王菁 现在 华西医科大学附属第二医院 610041
关键词：
中华儿科杂志991214 单纯性肾病综合征低IgG血症的发生机制至今尚不清楚。研究表明与 T细胞功能紊乱致Ig同种型转换障碍有关[1]。近年发现CD40L信号在同种型转换中发挥了重要作用，其表达缺失或减少是X连锁高IgM血症(X-HIM)血清Ig水平异常的原因[2]。我们检测了单纯性肾病患儿T细胞CD40LmRNA和蛋白质表达，分析其表达与血清IgG水平的相关性，并探讨了CD40单克隆抗体(CD40mAb)对体外产生IgG及其亚类的调节作用。
对象：(1)研究组：单纯性肾病综合征患儿16例，发作期11例，恢复期5例，诊断按全国儿科肾病协作组制定的标准[3]。男10例，女6例，年龄2～8岁。发作期和恢复期患儿采血前1月未用皮质激素及免疫抑制剂治疗。(2)对照组：健康儿童20例，男12例，女8例，年龄1.5岁～8岁。
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方法：常规分离人外周血单个核细胞(PBMC)，加植物血凝素(PHA)终浓度50 μg/ml，常规培养6小时。用TRIZOL试剂盒抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，分别扩增β-actin(1 126 bp)和CD40L(809 bp)。以CD40L/β-actin平均吸光度值之比表示CD40LmRNA的相对表达强度。1×106/ml PBMC加PMA(终浓度10 μg /ml) A23187(终浓度1 μg /ml)，常规培养6小时，收集细胞行荧光染色。阳性对照为鼠抗人CD40L-PE，阴性对照为抗鼠IgG1-PE。4℃避光孵育30分钟，上机检测。正常、发作期、发作期加CD40mAb(终浓度2 μg/ml) 处理组PBMC悬液分别加PWM (终浓度3 μg/ml) 常规培养10天，收集上清用ELISA法检测。血清免疫球蛋白采用多克隆抗体单向免疫扩散法检测。
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结果：(1)外周血T细胞CD40 LmRNA和蛋白质表达情况：与正常组比较，患儿发作期CD40LmRNA和蛋白质表达明显降低，恢复期表达无明显差异。(2)T细胞CD40L表达与血清IgG水平的相关性：与正常组相比，患儿发作期血清IgG水平明显降低，IgM水平增高、IgA无明显变化，发作期和恢复期血清IgG水平与CD40L mRNA表达呈显著正相关(r=0.49，0.70，P均<0.05)，与CD40L蛋白质表达呈显著正相关(r=0.65，0.74，P均<0.05)。(3)CD40mAb对体外培养患儿PBMC IgG及其亚类生成的影响：与正常组比较，患儿PBMC生成IgG明显降低(P<0.05)，为正常水平的42%。IgG1，IgG2，IgG4有不同程度的降低，分别为正常水平的34%，53%，49%(P均<0.05)，IgG3无明显变化。患儿PBMC加CD40mAb培养后，其上清IgG水平明显增加，达正常水平的64%(P<0.05)，IgG1、IgG2、IgG4生成也有不同程度的增加，分别达正常水平的58%，64%，67%(P均<0.05)，但与正常组相比差异仍有显著差异(P均<0.05)。
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讨论：单纯性肾病综合征发作期患儿血清IgG水平降低的原因仍不清楚。既往研究证明患儿低IgG血症与Ig同种型转换障碍有关，推测T细胞功能缺陷使B细胞合成IgM→IgG的转换过程受抑[1]。CD40L-CD40是T、B细胞间一对信号传递分子，CD40L主要存在于活化的 CD4+T细胞，与B细胞CD40交联后参与B细胞活化，增殖及抗体同种型转换[4]。X-HIM综合征患者CD40L基因突变或缺失引起抗体同种型转换完全阻断，免疫球蛋白重链(IgH)稳定区上游μ基因的表达过度产生高IgM血症，下游基因转换重组受阻使 IgG、IgA、IgE缺失或水平异常低下[2]。
本结果提示，T细胞CD40L表达降低参与低IgG血症的发生。其机制为：单纯性肾病患儿CD40L表达是部分降低，故IgH同种型转换不会完全受阻，因此μ基因下游各CH基因均可不同程度被转录，IgM及其邻近下游基因产物IgG3基本正常，其他IgG亚类水平降低，导致低IgG血症。而血清IgA、IgE水平并不因CD40L信号减弱而降低甚至增高，这可能与Ig类型转换特异性调控因子——细胞因子的作用有关。用 CD40mAb代替CD40L，激活CD40使患儿B细胞活化、增殖和分化，促进IgG及IgG1、IgG2、IgG4的同种型转换。但其上调作用仍未使IgG及其亚类水平达到正常，进一步提示本病低IgG血症还有其他因素参与。
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参考文献
1 Giangiacomo J, Clearly TG, Cole BR, et al. Serum immunoglobulins in the nephrotic syndrome. N Engl J Med, 1975, 293: 8-12.
2 Korthauer UIF, Graf D, Mages HW, et al. Defective expression of T-cell CD40 ligand caused X-linked immunodeficiency with hyper-IgM. Nature, 1993, 361: 539-543.
3 姜新猷,陈荣华,王宝琳，整理.《关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗的建议》的修订意见.中华儿科杂志, 1981, 19:241-243.
4 Laman JD, Cleassen E, Nolle RJ, Function of CD40 and its ligand, gp39 (CD40L). Crit Rev Immunol, 1996, 16: 59.
(收稿：1998-12-31 修回：1999-05-04), 百拇医药