缺氧对新生小牛胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性的影响
作者：程宁莉 蔡文杰 吴圣楣 蒋明华
单位：上海市儿科医学研究所 200092
关键词：婴儿；新生；低氧；血糖；受体；胰岛素；蛋白质酪氨酸激酶
中华儿科杂志991210 【摘要】 目的 了解缺氧状态新生儿胰岛素受体水平的血糖调节机制。方法 对7头新生小牛(缺氧组)头罩吸入0.048～0.059氧气2小时，对照组(7头)吸入氧气浓度为0.208，测定乳酸及血气，观察血糖和肝组织胰岛素受体的酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性。 结果 缺氧组呈乳酸酸中毒，血糖明显高于对照组[(8.0±1.3) mmol/L与(4.8±1.3) mmol/L相比，P<0.01]，随胰岛素刺激浓度的增加，激酶活性增高，缺氧组与对照组相比，差异有非常显著意义。结论 缺氧可诱导新生小牛血糖升高，缺氧时胰岛素受体TPK活性下降是血糖升高的原因之一。
The effect of hypoxia on TPK activities of the insulin receptor in newborn calves
, 百拇医药
CHENG Ningli, CAI Wenjie, WU Shengmei, et al.
Shanghai Institute of Pediatric Medical Research, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To understand the mechanism of regulating blood glucose in hepatic post-insulin receptor level in hypoxic newborns. Methods Seven newborn calves were given 4.8%-5.9% of oxygen inhalation with hoods for two hours. The control calves were given 20.8% of oxygen inhalation. The lactate, blood gases, blood glucose and tyrosine specific protein kinase (TPK) activities of hepatic insulin receptors were measured. Results Severe lactate acidosis existed in hypoxic group. The blood glucose was much higher in hypoxic group than those in control group [(8.0±1.3) mmol/L vs. (4.8±1.3) mmol/L, P<0.01], and the TPK activities of hepatic insulin receptors were significantly lower in hypoxic group than that in control group (K0 P=0.001, K1 P<0.01, K2 P=0.001, K3 P<0.01, K4 P<0.01, K5 P<0.01). Conclusion Hypoxia could induce an increase of blood glucose in newborn calves and one of the mechanisms for regulation of blood glucose might be the decrease of tyrosine protein activeities of the insulin receptor.
, 百拇医药
【Key words】 Infant, newborn Anoxia Blood glucose Receptor, insulin Protein-tyrosine kinase
我们已经报道了缺氧引起新生动物血糖升高，且血糖的升高与缺氧时胰岛素受体本身特异性结合功能下降有关[1]。已经证实胰岛素具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性，且认为是胰岛素信号传递的重要步骤。我们观察了缺氧对新生小牛血糖及其胰岛素受体调节TPK活性的影响。现报道如下。
材料和方法
一、动物急性缺氧实验
随机将14头小牛分为缺氧组与对照组新生雄性小牛各7头，由上海市第九牧场提供。对照组体重35.5～45.0 kg，胎龄276～284天，日龄7～11小时。缺氧组体重35.4～45.1 kg，胎龄277～284天，日龄6～10.5小时。两组体重、胎龄、日龄比较，差异无显著意义。缺氧组小牛头罩吸入氧浓度为0.048～0.059的气体2小时，用测氧仪监测氧浓度。对照组自然吸入空气，氧浓度为0.21。分别于实验结束时作血气分析，抽血测定血糖(葡萄糖氧化酶纸片法)及乳酸(乳酸氧化酶法)。缺氧结束前每公斤体重静脉注射戊巴比妥25～30 mg，肋缘下切口，速取肝组织3.5 g，液氮保存，半年内处理。
, http://www.100md.com
二、部分纯化肝细胞胰岛素受体的检查
方法按参考文献[2，3]。用差速离心法抽提肝细胞膜蛋白，用亲和层析法提纯受体蛋白。
三、胰岛素受体TPK活性的测定
方法按参考文献[2，3]。胰岛素受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，胰岛素的信号传递与其活性有关，我们以不同浓度的外源性胰岛素作为激活剂，刺激受体的TPK活性，以每毫克受体蛋白每分钟使每毫克底物多聚Glu4∶Tyr1磷酸化来表示其激酶活性。
四、统计学处理
所有样本数据用均数±标准差(
±s)表示，缺氧组与非缺氧组之间数据比较用t检验，每组自身前后对照用配对t检验。
, 百拇医药
结果
一、血气分析与乳酸
实验前缺氧组与对照组新生小牛乳酸及血气分析均值比较差异均无显著性(表1)。说明实验条件相似有可比性。缺氧组新生小牛乳酸及血气分析均值缺氧前后比较差异均有显著性，表现为乳酸酸中毒，代偿预期值PaCO2=1.5×178±2=31.5～35.5 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，实际测得PaCO2=4.7×7.519=35.3，因此基本上不存在呼吸性碱中毒。实验结束时两组均值比较差异均有显著性(表1)。同样说明小牛缺氧模型已处于缺氧酸中毒状态。
表1 两组新生小牛实验前后乳酸与血气分析比较(±s) 组别
牛数
, 百拇医药
(只)
实验前
实验2h后
乳酸
(mmol/L)
pH
值
PCO2
(mmHg)
PO2
(mmHg)
HCO3
, http://www.100md.com
(mol/L)
TCO2
(mmol/L)
BE
(mmol/L)
乳酸
(mmol/L)
pH
值
PCO2
(mmHg)
PO2
, http://www.100md.com
(mmHg)
HCO2
(mol/L)
TCO2
(mmol/L)
BE
(mmol/L)
缺氧组
7
3.23±
7.36±
47.18±
, http://www.100md.com
76.35±
27.15±
28.70±
1.37±
9.51±
7.29±
35.25±
22.80±
17.67±
18.57±
-7.54±
0.57
0.01
, http://www.100md.com
1.80
3.83
0.69
0.78
0.70
2.76
0.06
4.28
11.70
1.71
1.23
3.12
对照组
, 百拇医药
7
3.53±
7.37±
46.7±
79.95±
27.37±
28.87±
2.10±
3.36±
7.36±
46.58±
71.18±
28.10±
, 百拇医药
29.11±
0.73±
1.02
0.02
1.88
9.75
1.15
1.16
1.29
0.83
0.01
0.68
26.78
, http://www.100md.com
1.01
1.16
1.71
t值
0.68
1.05
0.40
0.90
0.42
0.32
1.32
5.65
2.91
, 百拇医药
6.92
4.38
13.90
16.49
6.15
P值
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
, 百拇医药
<0.001
<0.01
<0.001
<0.001
<0.01
<0.001
<0.001
二、血糖
缺氧组小牛于缺氧前血糖在3.1～7.2 mmol/L之间，1头牛血糖>7.0 mmol/L。缺氧1小时血糖在4.8～8.2 mmol/L之间，其中2头牛血糖>7.0 mmol/L。缺氧2小时血糖在5.9～9.3 mmol/L之间，其中5头牛血糖>7.0 mmol/L。对照组实验前血糖在3.5～7.2 mmol/L之间，实验1小时血糖在4.1～6.8 mmol/L之间，实验2小时血糖在2.9～6.4 mmol/L之间，两组之间血糖均值及比较见表2，可见缺氧组血糖显著高于对照组。实验前后血糖无显著变化，缺氧组缺氧2小时后血糖则明显升高(t=6.213，P<0.01)。
, http://www.100md.com
表2 两组新生小牛实验前后血糖的变化(±s, mmol/L) 组别
实验前
实验1 h
实验2 h
对照组
5.1±1.4
5.3±1.0
4.8±1.3
缺氧组
5.5±1.6
6.8±1.2
, 百拇医药
8.0±1.3
t值
0.492
2.552
4.575
P值
>0.05
<0.05
<0.001
三、胰岛素受体TPK活性
实验结果表明，随胰岛素刺激剂浓度的增高(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L，激酶活性增高，并且缺氧组与对照组比较差异均有显著性(表3)。表3 两组新生小牛肝组织胰岛素受体的TPK活性比较(±s) 试管号
, 百拇医药
胰岛素浓度
(mol/L)
对照组
缺氧组
t值
P值
K0
0
25.5±2.3
16.1±2.5
7.260
<0.001
K1
, 百拇医药
10-10
26.7±3.1
18.2±2.6
5.642
<0.001
K2
10-9
27.3±3.3
19.1±2.5
5.232
<0.001
K3
, http://www.100md.com
10-8
28.4±4.6
20.1±2.7
4.139
<0.001
K4
10-7
29.4±4.9
21.2±2.9
3.840
<0.001
K5
, 百拇医药
10-6
30.8±5.8
22.2±2.8
3.554
<0.001
讨论
新生儿缺氧后对代谢方面很重要的影响之一是出现糖代谢稳乱。我们的研究结果表明，缺氧2小时小牛血糖浓度显著增高，并随缺氧时间延长而增加。正常情况下，血糖的稳定依赖于胰岛素及其拮抗激素的平衡及相互制约，以及它们能否正常发挥生理作用。我们进行了血糖调节机制的研究，从胰岛素受体前水平、受体本身及受体后水平三方面考虑，受体前及受体后的调节见另行报道。
胰岛素与胰岛素受体结合后，如何将信息传至细胞内，引起生物学效应？这是个复杂的生物学过程，目前有几种假设，胰岛素与胰岛素受体结合后，如磷脂酶C作用后的磷脂酰肌醇及二酰基甘油[4]，蛋白激酶C[5]，钙调蛋白，G蛋白作用。已经证实胰岛素受体具有TPK活性[6]。体外实验中，将一定量含抗酪氨酸磷酸化胰岛素受体的抗体加入培养敏感细胞的液体中，则胰岛素所刺激的几种功能被抑制[7]，因此认为测定TPK活性是用来研究受体后的信号传递重要手段。有关新生儿胰岛素受体TPK活性报道极少，Sinha等[8]对大鼠胎仔及新生仔研究胰岛素受体TPK活性，认为其胰岛素受体功能已和成人的胰岛素受体功能相似。但缺氧对新生儿胰岛素受体TPK影响尚未报道。
, 百拇医药
我们观察了胰岛素受体TPK活性，其活性是用在不同浓度胰岛素刺激下使外源性底物多聚Glu4:Tyr1磷酸化的能力来表示。缺氧组对各递增的外源性胰岛素浓度的刺激，所表现的磷酸化逐渐升高，但明显低于对照组，即缺氧降低新生儿胰岛素受体的TPK活性。笔者认为缺氧诱导新生小牛血糖升高，其重要原因之一是缺氧影响胰岛素受体后水平的调节。基金项目：本课题为国家自然科学基金资助(项目编号:39570738)
参考文献
1 程宁莉，蒋明华，蔡文杰，等.新生牛缺氧模型的血糖及胰岛素受体的研究.中华儿科杂志，1997， 35:132-134.
2 Freidenberg GR, Klein HH, Cordera R, et al. Insulin receptor kinase activity in rat liver. J Biol Chem, 1985, 260: 12444.
, 百拇医药
3 程宁莉，蔡文杰，吴圣楣.新生小牛肝组织胰岛素受体的功能.上海第二医科大学学报，1997， 17:91-93.
4 Farese RV, Kuo JY, Babischkin JS, et al. Insulin provokes a transient activation of phospholipase C in the rat epididymal fat pad. J Biol Chem, 1986, 261: 8589.
5 Saltiel AR, Fox JA, Sherline P, et al. Insulin-stimulated hydrolysis of a novel glycolipid generates modulators of cAMP phosphodiesterase. Science, 1986,233:967.
6 Exton JH. Some thoughts on the mechanism of action of insulin. Diabetes, 1991, 40: 521-526.
, 百拇医药
7 Kahn CR, Maron R, White MS. Modulation of growth of antibodies to phosphotyrosine containing proteins. Clin Res, 1985,34:684A.
8 Sinha MK, Jenquin M . Subunit structure autophosphorylation and tyrosine specific protein kinase activity of hepatic insulin receptor in fetal,neonatal, and adult rats. Diabetes, 1987,36:1161.
(收稿：1999-06-17 修回：1999-07-09), 百拇医药
单位：上海市儿科医学研究所 200092
关键词：婴儿；新生；低氧；血糖；受体；胰岛素；蛋白质酪氨酸激酶
中华儿科杂志991210 【摘要】 目的 了解缺氧状态新生儿胰岛素受体水平的血糖调节机制。方法 对7头新生小牛(缺氧组)头罩吸入0.048～0.059氧气2小时，对照组(7头)吸入氧气浓度为0.208，测定乳酸及血气，观察血糖和肝组织胰岛素受体的酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性。 结果 缺氧组呈乳酸酸中毒，血糖明显高于对照组[(8.0±1.3) mmol/L与(4.8±1.3) mmol/L相比，P<0.01]，随胰岛素刺激浓度的增加，激酶活性增高，缺氧组与对照组相比，差异有非常显著意义。结论 缺氧可诱导新生小牛血糖升高，缺氧时胰岛素受体TPK活性下降是血糖升高的原因之一。
The effect of hypoxia on TPK activities of the insulin receptor in newborn calves
, 百拇医药
CHENG Ningli, CAI Wenjie, WU Shengmei, et al.
Shanghai Institute of Pediatric Medical Research, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To understand the mechanism of regulating blood glucose in hepatic post-insulin receptor level in hypoxic newborns. Methods Seven newborn calves were given 4.8%-5.9% of oxygen inhalation with hoods for two hours. The control calves were given 20.8% of oxygen inhalation. The lactate, blood gases, blood glucose and tyrosine specific protein kinase (TPK) activities of hepatic insulin receptors were measured. Results Severe lactate acidosis existed in hypoxic group. The blood glucose was much higher in hypoxic group than those in control group [(8.0±1.3) mmol/L vs. (4.8±1.3) mmol/L, P<0.01], and the TPK activities of hepatic insulin receptors were significantly lower in hypoxic group than that in control group (K0 P=0.001, K1 P<0.01, K2 P=0.001, K3 P<0.01, K4 P<0.01, K5 P<0.01). Conclusion Hypoxia could induce an increase of blood glucose in newborn calves and one of the mechanisms for regulation of blood glucose might be the decrease of tyrosine protein activeities of the insulin receptor.
, 百拇医药
【Key words】 Infant, newborn Anoxia Blood glucose Receptor, insulin Protein-tyrosine kinase
我们已经报道了缺氧引起新生动物血糖升高，且血糖的升高与缺氧时胰岛素受体本身特异性结合功能下降有关[1]。已经证实胰岛素具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性，且认为是胰岛素信号传递的重要步骤。我们观察了缺氧对新生小牛血糖及其胰岛素受体调节TPK活性的影响。现报道如下。
材料和方法
一、动物急性缺氧实验
随机将14头小牛分为缺氧组与对照组新生雄性小牛各7头，由上海市第九牧场提供。对照组体重35.5～45.0 kg，胎龄276～284天，日龄7～11小时。缺氧组体重35.4～45.1 kg，胎龄277～284天，日龄6～10.5小时。两组体重、胎龄、日龄比较，差异无显著意义。缺氧组小牛头罩吸入氧浓度为0.048～0.059的气体2小时，用测氧仪监测氧浓度。对照组自然吸入空气，氧浓度为0.21。分别于实验结束时作血气分析，抽血测定血糖(葡萄糖氧化酶纸片法)及乳酸(乳酸氧化酶法)。缺氧结束前每公斤体重静脉注射戊巴比妥25～30 mg，肋缘下切口，速取肝组织3.5 g，液氮保存，半年内处理。
, http://www.100md.com
二、部分纯化肝细胞胰岛素受体的检查
方法按参考文献[2，3]。用差速离心法抽提肝细胞膜蛋白，用亲和层析法提纯受体蛋白。
三、胰岛素受体TPK活性的测定
方法按参考文献[2，3]。胰岛素受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，胰岛素的信号传递与其活性有关，我们以不同浓度的外源性胰岛素作为激活剂，刺激受体的TPK活性，以每毫克受体蛋白每分钟使每毫克底物多聚Glu4∶Tyr1磷酸化来表示其激酶活性。
四、统计学处理
所有样本数据用均数±标准差(
±s)表示，缺氧组与非缺氧组之间数据比较用t检验，每组自身前后对照用配对t检验。, 百拇医药
结果
一、血气分析与乳酸
实验前缺氧组与对照组新生小牛乳酸及血气分析均值比较差异均无显著性(表1)。说明实验条件相似有可比性。缺氧组新生小牛乳酸及血气分析均值缺氧前后比较差异均有显著性，表现为乳酸酸中毒，代偿预期值PaCO2=1.5×178±2=31.5～35.5 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，实际测得PaCO2=4.7×7.519=35.3，因此基本上不存在呼吸性碱中毒。实验结束时两组均值比较差异均有显著性(表1)。同样说明小牛缺氧模型已处于缺氧酸中毒状态。
表1 两组新生小牛实验前后乳酸与血气分析比较(
±s) 组别牛数
, 百拇医药
(只)
实验前
实验2h后
乳酸
(mmol/L)
pH
值
PCO2
(mmHg)
PO2
(mmHg)
HCO3
, http://www.100md.com
(mol/L)
TCO2
(mmol/L)
BE
(mmol/L)
乳酸
(mmol/L)
pH
值
PCO2
(mmHg)
PO2
, http://www.100md.com
(mmHg)
HCO2
(mol/L)
TCO2
(mmol/L)
BE
(mmol/L)
缺氧组
7
3.23±
7.36±
47.18±
, http://www.100md.com
76.35±
27.15±
28.70±
1.37±
9.51±
7.29±
35.25±
22.80±
17.67±
18.57±
-7.54±
0.57
0.01
, http://www.100md.com
1.80
3.83
0.69
0.78
0.70
2.76
0.06
4.28
11.70
1.71
1.23
3.12
对照组
, 百拇医药
7
3.53±
7.37±
46.7±
79.95±
27.37±
28.87±
2.10±
3.36±
7.36±
46.58±
71.18±
28.10±
, 百拇医药
29.11±
0.73±
1.02
0.02
1.88
9.75
1.15
1.16
1.29
0.83
0.01
0.68
26.78
, http://www.100md.com
1.01
1.16
1.71
t值
0.68
1.05
0.40
0.90
0.42
0.32
1.32
5.65
2.91
, 百拇医药
6.92
4.38
13.90
16.49
6.15
P值
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
, 百拇医药
<0.001
<0.01
<0.001
<0.001
<0.01
<0.001
<0.001
二、血糖
缺氧组小牛于缺氧前血糖在3.1～7.2 mmol/L之间，1头牛血糖>7.0 mmol/L。缺氧1小时血糖在4.8～8.2 mmol/L之间，其中2头牛血糖>7.0 mmol/L。缺氧2小时血糖在5.9～9.3 mmol/L之间，其中5头牛血糖>7.0 mmol/L。对照组实验前血糖在3.5～7.2 mmol/L之间，实验1小时血糖在4.1～6.8 mmol/L之间，实验2小时血糖在2.9～6.4 mmol/L之间，两组之间血糖均值及比较见表2，可见缺氧组血糖显著高于对照组。实验前后血糖无显著变化，缺氧组缺氧2小时后血糖则明显升高(t=6.213，P<0.01)。
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表2 两组新生小牛实验前后血糖的变化(
±s, mmol/L) 组别实验前
实验1 h
实验2 h
对照组
5.1±1.4
5.3±1.0
4.8±1.3
缺氧组
5.5±1.6
6.8±1.2
, 百拇医药
8.0±1.3
t值
0.492
2.552
4.575
P值
>0.05
<0.05
<0.001
三、胰岛素受体TPK活性
实验结果表明，随胰岛素刺激剂浓度的增高(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L，激酶活性增高，并且缺氧组与对照组比较差异均有显著性(表3)。表3 两组新生小牛肝组织胰岛素受体的TPK活性比较(
±s) 试管号, 百拇医药
胰岛素浓度
(mol/L)
对照组
缺氧组
t值
P值
K0
0
25.5±2.3
16.1±2.5
7.260
<0.001
K1
, 百拇医药
10-10
26.7±3.1
18.2±2.6
5.642
<0.001
K2
10-9
27.3±3.3
19.1±2.5
5.232
<0.001
K3
, http://www.100md.com
10-8
28.4±4.6
20.1±2.7
4.139
<0.001
K4
10-7
29.4±4.9
21.2±2.9
3.840
<0.001
K5
, 百拇医药
10-6
30.8±5.8
22.2±2.8
3.554
<0.001
讨论
新生儿缺氧后对代谢方面很重要的影响之一是出现糖代谢稳乱。我们的研究结果表明，缺氧2小时小牛血糖浓度显著增高，并随缺氧时间延长而增加。正常情况下，血糖的稳定依赖于胰岛素及其拮抗激素的平衡及相互制约，以及它们能否正常发挥生理作用。我们进行了血糖调节机制的研究，从胰岛素受体前水平、受体本身及受体后水平三方面考虑，受体前及受体后的调节见另行报道。
胰岛素与胰岛素受体结合后，如何将信息传至细胞内，引起生物学效应？这是个复杂的生物学过程，目前有几种假设，胰岛素与胰岛素受体结合后，如磷脂酶C作用后的磷脂酰肌醇及二酰基甘油[4]，蛋白激酶C[5]，钙调蛋白，G蛋白作用。已经证实胰岛素受体具有TPK活性[6]。体外实验中，将一定量含抗酪氨酸磷酸化胰岛素受体的抗体加入培养敏感细胞的液体中，则胰岛素所刺激的几种功能被抑制[7]，因此认为测定TPK活性是用来研究受体后的信号传递重要手段。有关新生儿胰岛素受体TPK活性报道极少，Sinha等[8]对大鼠胎仔及新生仔研究胰岛素受体TPK活性，认为其胰岛素受体功能已和成人的胰岛素受体功能相似。但缺氧对新生儿胰岛素受体TPK影响尚未报道。
, 百拇医药
我们观察了胰岛素受体TPK活性，其活性是用在不同浓度胰岛素刺激下使外源性底物多聚Glu4:Tyr1磷酸化的能力来表示。缺氧组对各递增的外源性胰岛素浓度的刺激，所表现的磷酸化逐渐升高，但明显低于对照组，即缺氧降低新生儿胰岛素受体的TPK活性。笔者认为缺氧诱导新生小牛血糖升高，其重要原因之一是缺氧影响胰岛素受体后水平的调节。基金项目：本课题为国家自然科学基金资助(项目编号:39570738)
参考文献
1 程宁莉，蒋明华，蔡文杰，等.新生牛缺氧模型的血糖及胰岛素受体的研究.中华儿科杂志，1997， 35:132-134.
2 Freidenberg GR, Klein HH, Cordera R, et al. Insulin receptor kinase activity in rat liver. J Biol Chem, 1985, 260: 12444.
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3 程宁莉，蔡文杰，吴圣楣.新生小牛肝组织胰岛素受体的功能.上海第二医科大学学报，1997， 17:91-93.
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(收稿：1999-06-17 修回：1999-07-09), 百拇医药