国人常见的两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变及其临床表现
作者：何永蜀 施进 黄永坤 龙莉 杜传书
单位：何永蜀、龙莉 昆明医学院生物学教研室 650031；施进 昆明医学院第二附属医院儿科；黄永坤 昆明医学院第一附属医院儿科；杜传书 广州中山医科大学遗传学研究室
关键词：葡糖-磷酸脱氢酶缺乏；基因扩增；突变
中华儿科杂志991207 【摘要】 目的 探讨中国人中两种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因突变与临床表现的关系。方法 应用突变扩增系统(ARMS)法，研究15例云南籍汉族G6PD缺乏症患儿两种常见G6PD基因突变，并对其临床表现进行分析。结果 15例中检出 cDNA G1388A突变9例，cDNA G1376T突变5例，未定型1例。所有患者都具有急性溶血性贫血，黄疸等临床表现及不同程度的血红蛋白尿、G6PD酶活性降低。结论 G6PD基因cDNA G1376T和 cDNA G1388A突变时具有相似的临床表现。
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The two common G6PD gene mutations in Chinese and their clinical manifestations
HE Yongshu, SHI Jin, HUANG Yongkun, et al.
Department of Biology, Kunming Medical College, Kunming 650031
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the two common glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) gene mutations in Chinese and their clinical manifestations. Methods Using amplification refractory mutation system (ARMS) the authors detected the two common G6PD gene mutations in 15 children of Han nationality from Yunnan province, and analyzed their clinical manifestations. Results Nine out of 15 cases were found to have G1388A mutation, 5 cases had G1376T mutation, and 1 was undefined. All these cases had acute hemolytic anemia, jaundice,hemoglobinuria and reduced G6PD activity to different extents. Conclusion Patients with these mutations have the same clinical manifestations.
, 百拇医药
【Key words】 Glucose phosphate dehydrogenase deficiency Gene amplification Mutation
遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症的基础研究已深入到分子水平。至1997年，全世界所报道的G6PD基因突变为122种以上，其中大多为点突变[1]。中国人中已报道的G6PD基因突变为14种，都为点突变，其中cDNA1388(G→A)(G1388A)和cDNA 1376(G→T)(G1376T)突变占50%以上[2]，为中国人中最常见的G6PD基因突变类型。G6PD基因的各种突变所致的G6PD缺乏症具遗传异质性，临床表现呈个体差异。为探讨G6PD基因突变与临床表现的关系，我们通过突变扩增系统(amplification refractary mutation system，ARMS)方法检测云南省汉族G6PD缺乏症患儿cDNA1388(G→A)和cDNA1376(G→T)这两种中国人中最常见的突变，并对其临床表现进行分析。
, 百拇医药
对象和方法
一、对象
病例来源：15例G6PD缺乏症患儿均为男性，均为昆明医学院第二附属医院住院患儿，父系及母系三代居住云南，相互间无亲缘关系。发病诱因都是在蚕豆成熟季节进食蚕豆而发病，通过静脉血紫外分光光度计定量测定G6PD活性确定为G6PD缺乏症。
二、方法
1. 临床实验室检查：(1)确定贫血程度[3]；(2)根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。(3)G6PD活性测定，酶活性单位以每克Hb含多少国际单位来表示(IU/g)，正常值为4～7 IU/g。
2.基因检测：DNA制备：按常规法，蛋白酶K消化，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
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PCR引物设计：ARMS法试剂盒由中山医科大学遗传研究室提供。引物序列为：
上游引物1388L2：5′GACCTGACCTACGGCAACAGATAC3′
下游引物1388M2：5′GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT3′
1376M：5′TGAAAATACGCCAGGCCTCAA 3′
1388L2和1388M2特异性扩增G6PD基因第12外显子cDNA1388(G→A)突变，扩增出361bp片段，而1388L2和1376M扩增cDNA1376(G→T)突变，扩增出345bp片段。
基因扩增：30 μl聚合酶链反应含基因组DNA 1.0 μg，10×反应缓冲液3.0 μl，dNTPs(2 mmol/L)3.0 μl，5′上游引物和3′下游引物各20 ng，内对照引物40 ng。反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5U GD Taq酶后，进入热循环。循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。PCR在自动PCR仪(英国HYADI公司Omn-E)中进行。
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结果观察：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，选用1 kb λDNA作为DNA分子量标准。银染，固定，干燥保存。
结果
一、患儿临床表现
本组15例G6PD缺乏症患儿均表现为急性进行性贫血、黄疸，发热5例，占33%。
二、基因检测结果
15例患儿中，G1376T突变者5例(图1)，G1388A突变者9例(图2)，未定型1例。显示G1388A和G1376T突变为云南省汉族G6PD缺乏症患儿基因突变的主要类型。
图1 ARMS法检测1376(G→T)突变
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1：1 kb 标准DNA分子量；2，4：例1、例9患儿检测标本，扩增1376(G→T)突变的345 bp片段和内对照4FR的196 bp片段；3：为正常标本，仅见4FR的内对照的196 bp片段
图2 ARMS法检测1388(G→A)突变
1：1 kb标准DNA分子量；2，3：例4、例8患儿检测标本，扩增1388(G→A)突变的361 bp片段及内对照4FR扩增的196 bp片段；4～7：正常标本，只见4FR的196 bp的内对照片段
三、临床实验室检测结果
14例已知基因型的G6PD缺乏症患儿中轻度贫血3例(21%)；中度贫血4例(29%)；重度贫血6例(43%)；极重度贫血1例(7%)；尿潜血试验阳性11例(79%)；14例患儿Hb电泳全部正常，除外了Hb异常所致的溶血性贫血(表1)。
, 百拇医药
表1 14例男性G6PD缺乏症患儿的实验室检测结果 例号
年龄
Hb
(g/L)
RBC
(×1012/L)
血型
G6PD活性
(IU/g)
基因
突变型
1
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2岁10个月
67
2.52
A
2.68
G1376T
2
2岁
95
3.36
A
1.39
G1388A
, 百拇医药
3
3岁
30
1.03
B
0.63
G1388A
4
4岁
49
1.66
B
2.10
, http://www.100md.com G1388A
5
5个月
96
3.61
A
0.93
G1388A
6
1岁6个月
55
2.08
B
, 百拇医药 1.29
G1388A
7
3岁
65
3.31
B
2.30
G1388A
8
6岁
45
1.48
, 百拇医药 B
2.46
G1388A
9
1岁9个月
28
0.90
B
0.83
G1376T
10
1岁5个月
76
, 百拇医药
2.65
A
0.72
G1388A
11
2岁2个月
92
3.55
A
2.50
G1376T
12
1岁2个月
, 百拇医药
68
1.32
B
1.95
G1376T
13
4岁
56.3
2.05
A
1.45
G1388A
14
, 百拇医药
2岁
46.7
1.48
B
0.81
G1376T
讨论
G6PD是参与磷酸戊糖旁路代谢产生还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的关键酶。因G6PD基因突变引起的G6PD缺乏症是最常见的遗传病之一，其遗传方式为X连锁不完全显性遗传，女性杂合子表现度有很大差别，从表型正常到G6PD缺乏，因此人群中多见男性患儿。G6PD缺乏症具遗传异质性，各种点突变所致的表型变化范围宽广，临床表现从无症状到新生儿黄疸、药物诱导性溶血、蚕豆病，非球形细胞溶血性贫血(CNHSA)等。 G6PD基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。G6PD cDNA1388、cDNA1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，其突变在华人和华裔中有较高的发生频率。突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代。据文献报道，导致严重临床症状的突变，大都位于G6PD结合区域或NADP结合区附近， G6PD缺乏症的严重程度与靠近NADP结合位点的突变有关，轻微的缺乏是由于突变位于决定G6PD末端的氨基酸所致[4，5]。459及463位精氨酸座落在10多个具高度保守的氨基酸区域中，其位置与NADP第一结合位点386～387位氨基酸在空间位置上相距很近，在酶与NADP的结合过程中起重要作用。但G1376T是一个较保守的氨基酸替换(Arg-Leu)，预期它对G6PD酶活性的影响比较大[6]。G1376T突变总是伴随着脱氨NADP利用率的显著增高，而G1388A突变并不如此[7]。台湾学者在34例需要输血治疗的新生儿G6PD缺乏症患儿中发现G1376T突变占64.7%，发生新生儿高胆红素血症的G6PD缺乏症患儿G1376T突变占多数，提示有1376突变的患儿临床症状严重[8]。本组所有病例发病原因均因进食蚕豆引起，都具急性溶血表现，如进行性贫血，黄疸及不同程度的血红蛋白尿，患儿G6PD活性均低于正常， Hb电泳排除异常血红蛋白所致的溶血性贫血。本组15例G6PD缺乏症患儿经基因检测，9例为G1388A突变，5例为G1376T突变。另1例患儿非上述两种突变，经同法ARMS检测，已排除A95G突变，其突变类型尚待确定。在这些患儿中检出的这两种突变是中国人中最常见的两种G6PD基因突变类型，表明突变具民族和地域性。所有这些患儿在发病后症状都较严重，临床表现严重程度与这两种G6PD基因突变型类型无关。发病原因与血型无关。患儿大多数经维持水、电解质平衡，碱化尿液等对症治疗即康复，仅部份患儿需要输血并合用肾上腺皮质激素治疗，患儿是否需要输血治疗由发病时贫血的严重程度决定。本组患儿G6PD基因G1376T和G1388A突变所致的临床表现没有明显区别，与谢建生等从前的报道一致[9]
, 百拇医药
基金项目：本课题受国家自然科学基金(项目编号：39670401)及云南省教委青年基金(项目编号：9841032)资助
参考文献
1 Vulliamy A, Luzzatto L, Hirono A,et al. Hematologically important mutations:glucose-6-phosphate dehydrogenase . Blood Cell Mol Dis, 1997,23：302-313.
2 杜传书，王青，陈路明，等.中国人中所见的六种葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志，1993，14：395-398.
3 吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1997.1664-1665.
, http://www.100md.com
4 Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. N Engl J Med,1991,324:169-174.
5 Chiu DTY, Zuo L, Chao L, et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) deficiency in patients of Chinese decent and identification of new base substitutions in the human G6PD gene. Blood,1992,81:2150-2154.
6 杨明.人类G6PD缺乏症的分子生物学进展.中华医学遗传学杂志，1995:12,159-162.
7 Chiu DTY, Zuo L, Chen E,et al. Two commonly occurring nucleotide base substitution in Chinese G6PD variants. Biochem Biophys Res Commun, 1991,180:988-993.
, 百拇医药
8 Lo YS, Lu CC, Chiou SS,et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Chinese infants with or with severe neonatal hyperbilirubinaemia. Brit J Haematol, 1994,86:858-862.
9 谢建生，龙桂芳，蒋南华，等.两种常见葡葡糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测及临床分析.中华血液学杂志，1995，16：179-181.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-07-07), 百拇医药
单位：何永蜀、龙莉 昆明医学院生物学教研室 650031；施进 昆明医学院第二附属医院儿科；黄永坤 昆明医学院第一附属医院儿科；杜传书 广州中山医科大学遗传学研究室
关键词：葡糖-磷酸脱氢酶缺乏；基因扩增；突变
中华儿科杂志991207 【摘要】 目的 探讨中国人中两种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因突变与临床表现的关系。方法 应用突变扩增系统(ARMS)法，研究15例云南籍汉族G6PD缺乏症患儿两种常见G6PD基因突变，并对其临床表现进行分析。结果 15例中检出 cDNA G1388A突变9例，cDNA G1376T突变5例，未定型1例。所有患者都具有急性溶血性贫血，黄疸等临床表现及不同程度的血红蛋白尿、G6PD酶活性降低。结论 G6PD基因cDNA G1376T和 cDNA G1388A突变时具有相似的临床表现。
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The two common G6PD gene mutations in Chinese and their clinical manifestations
HE Yongshu, SHI Jin, HUANG Yongkun, et al.
Department of Biology, Kunming Medical College, Kunming 650031
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the two common glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) gene mutations in Chinese and their clinical manifestations. Methods Using amplification refractory mutation system (ARMS) the authors detected the two common G6PD gene mutations in 15 children of Han nationality from Yunnan province, and analyzed their clinical manifestations. Results Nine out of 15 cases were found to have G1388A mutation, 5 cases had G1376T mutation, and 1 was undefined. All these cases had acute hemolytic anemia, jaundice,hemoglobinuria and reduced G6PD activity to different extents. Conclusion Patients with these mutations have the same clinical manifestations.
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【Key words】 Glucose phosphate dehydrogenase deficiency Gene amplification Mutation
遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症的基础研究已深入到分子水平。至1997年，全世界所报道的G6PD基因突变为122种以上，其中大多为点突变[1]。中国人中已报道的G6PD基因突变为14种，都为点突变，其中cDNA1388(G→A)(G1388A)和cDNA 1376(G→T)(G1376T)突变占50%以上[2]，为中国人中最常见的G6PD基因突变类型。G6PD基因的各种突变所致的G6PD缺乏症具遗传异质性，临床表现呈个体差异。为探讨G6PD基因突变与临床表现的关系，我们通过突变扩增系统(amplification refractary mutation system，ARMS)方法检测云南省汉族G6PD缺乏症患儿cDNA1388(G→A)和cDNA1376(G→T)这两种中国人中最常见的突变，并对其临床表现进行分析。
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对象和方法
一、对象
病例来源：15例G6PD缺乏症患儿均为男性，均为昆明医学院第二附属医院住院患儿，父系及母系三代居住云南，相互间无亲缘关系。发病诱因都是在蚕豆成熟季节进食蚕豆而发病，通过静脉血紫外分光光度计定量测定G6PD活性确定为G6PD缺乏症。
二、方法
1. 临床实验室检查：(1)确定贫血程度[3]；(2)根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。(3)G6PD活性测定，酶活性单位以每克Hb含多少国际单位来表示(IU/g)，正常值为4～7 IU/g。
2.基因检测：DNA制备：按常规法，蛋白酶K消化，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
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PCR引物设计：ARMS法试剂盒由中山医科大学遗传研究室提供。引物序列为：
上游引物1388L2：5′GACCTGACCTACGGCAACAGATAC3′
下游引物1388M2：5′GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT3′
1376M：5′TGAAAATACGCCAGGCCTCAA 3′
1388L2和1388M2特异性扩增G6PD基因第12外显子cDNA1388(G→A)突变，扩增出361bp片段，而1388L2和1376M扩增cDNA1376(G→T)突变，扩增出345bp片段。
基因扩增：30 μl聚合酶链反应含基因组DNA 1.0 μg，10×反应缓冲液3.0 μl，dNTPs(2 mmol/L)3.0 μl，5′上游引物和3′下游引物各20 ng，内对照引物40 ng。反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5U GD Taq酶后，进入热循环。循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。PCR在自动PCR仪(英国HYADI公司Omn-E)中进行。
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结果观察：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，选用1 kb λDNA作为DNA分子量标准。银染，固定，干燥保存。
结果
一、患儿临床表现
本组15例G6PD缺乏症患儿均表现为急性进行性贫血、黄疸，发热5例，占33%。
二、基因检测结果
15例患儿中，G1376T突变者5例(图1)，G1388A突变者9例(图2)，未定型1例。显示G1388A和G1376T突变为云南省汉族G6PD缺乏症患儿基因突变的主要类型。
图1 ARMS法检测1376(G→T)突变
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1：1 kb 标准DNA分子量；2，4：例1、例9患儿检测标本，扩增1376(G→T)突变的345 bp片段和内对照4FR的196 bp片段；3：为正常标本，仅见4FR的内对照的196 bp片段
图2 ARMS法检测1388(G→A)突变
1：1 kb标准DNA分子量；2，3：例4、例8患儿检测标本，扩增1388(G→A)突变的361 bp片段及内对照4FR扩增的196 bp片段；4～7：正常标本，只见4FR的196 bp的内对照片段
三、临床实验室检测结果
14例已知基因型的G6PD缺乏症患儿中轻度贫血3例(21%)；中度贫血4例(29%)；重度贫血6例(43%)；极重度贫血1例(7%)；尿潜血试验阳性11例(79%)；14例患儿Hb电泳全部正常，除外了Hb异常所致的溶血性贫血(表1)。
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表1 14例男性G6PD缺乏症患儿的实验室检测结果 例号
年龄
Hb
(g/L)
RBC
(×1012/L)
血型
G6PD活性
(IU/g)
基因
突变型
1
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2岁10个月
67
2.52
A
2.68
G1376T
2
2岁
95
3.36
A
1.39
G1388A
, 百拇医药
3
3岁
30
1.03
B
0.63
G1388A
4
4岁
49
1.66
B
2.10
, http://www.100md.com G1388A
5
5个月
96
3.61
A
0.93
G1388A
6
1岁6个月
55
2.08
B
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7
3岁
65
3.31
B
2.30
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8
6岁
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2.46
G1388A
9
1岁9个月
28
0.90
B
0.83
G1376T
10
1岁5个月
76
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2.65
A
0.72
G1388A
11
2岁2个月
92
3.55
A
2.50
G1376T
12
1岁2个月
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68
1.32
B
1.95
G1376T
13
4岁
56.3
2.05
A
1.45
G1388A
14
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2岁
46.7
1.48
B
0.81
G1376T
讨论
G6PD是参与磷酸戊糖旁路代谢产生还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的关键酶。因G6PD基因突变引起的G6PD缺乏症是最常见的遗传病之一，其遗传方式为X连锁不完全显性遗传，女性杂合子表现度有很大差别，从表型正常到G6PD缺乏，因此人群中多见男性患儿。G6PD缺乏症具遗传异质性，各种点突变所致的表型变化范围宽广，临床表现从无症状到新生儿黄疸、药物诱导性溶血、蚕豆病，非球形细胞溶血性贫血(CNHSA)等。 G6PD基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。G6PD cDNA1388、cDNA1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，其突变在华人和华裔中有较高的发生频率。突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代。据文献报道，导致严重临床症状的突变，大都位于G6PD结合区域或NADP结合区附近， G6PD缺乏症的严重程度与靠近NADP结合位点的突变有关，轻微的缺乏是由于突变位于决定G6PD末端的氨基酸所致[4，5]。459及463位精氨酸座落在10多个具高度保守的氨基酸区域中，其位置与NADP第一结合位点386～387位氨基酸在空间位置上相距很近，在酶与NADP的结合过程中起重要作用。但G1376T是一个较保守的氨基酸替换(Arg-Leu)，预期它对G6PD酶活性的影响比较大[6]。G1376T突变总是伴随着脱氨NADP利用率的显著增高，而G1388A突变并不如此[7]。台湾学者在34例需要输血治疗的新生儿G6PD缺乏症患儿中发现G1376T突变占64.7%，发生新生儿高胆红素血症的G6PD缺乏症患儿G1376T突变占多数，提示有1376突变的患儿临床症状严重[8]。本组所有病例发病原因均因进食蚕豆引起，都具急性溶血表现，如进行性贫血，黄疸及不同程度的血红蛋白尿，患儿G6PD活性均低于正常， Hb电泳排除异常血红蛋白所致的溶血性贫血。本组15例G6PD缺乏症患儿经基因检测，9例为G1388A突变，5例为G1376T突变。另1例患儿非上述两种突变，经同法ARMS检测，已排除A95G突变，其突变类型尚待确定。在这些患儿中检出的这两种突变是中国人中最常见的两种G6PD基因突变类型，表明突变具民族和地域性。所有这些患儿在发病后症状都较严重，临床表现严重程度与这两种G6PD基因突变型类型无关。发病原因与血型无关。患儿大多数经维持水、电解质平衡，碱化尿液等对症治疗即康复，仅部份患儿需要输血并合用肾上腺皮质激素治疗，患儿是否需要输血治疗由发病时贫血的严重程度决定。本组患儿G6PD基因G1376T和G1388A突变所致的临床表现没有明显区别，与谢建生等从前的报道一致[9]
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基金项目：本课题受国家自然科学基金(项目编号：39670401)及云南省教委青年基金(项目编号：9841032)资助
参考文献
1 Vulliamy A, Luzzatto L, Hirono A,et al. Hematologically important mutations:glucose-6-phosphate dehydrogenase . Blood Cell Mol Dis, 1997,23：302-313.
2 杜传书，王青，陈路明，等.中国人中所见的六种葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志，1993，14：395-398.
3 吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1997.1664-1665.
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4 Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. N Engl J Med,1991,324:169-174.
5 Chiu DTY, Zuo L, Chao L, et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) deficiency in patients of Chinese decent and identification of new base substitutions in the human G6PD gene. Blood,1992,81:2150-2154.
6 杨明.人类G6PD缺乏症的分子生物学进展.中华医学遗传学杂志，1995:12,159-162.
7 Chiu DTY, Zuo L, Chen E,et al. Two commonly occurring nucleotide base substitution in Chinese G6PD variants. Biochem Biophys Res Commun, 1991,180:988-993.
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(收稿：1998-12-09 修回：1999-07-07), 百拇医药