间期荧光原位杂交13/21 α卫星探针快速诊断唐氏综合征
作者：李文典 叶兹礼 周玉球 吴玉萍 肖鸽飞 朱兰芳
单位：李文典 叶兹礼 周玉球 吴玉萍 肖鸽飞 朱兰芳：广东省珠海市妇幼保健院医学遗传研究所 519000
关键词：
中华儿科杂志000121 唐氏综合征(也称先天愚型，21三体综合征)是人类常染色体最常见的异常，在智力低下的患儿鉴别诊断中，唐氏综合征的诊断都是采用传统的细胞遗传学检查。但需要进行细胞培养、染色体核型分析，不仅整个实验周期长，而且影响培养成功的因素很多，使一般条件的实验室开展这项检查受到限制。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization ,FISH)技术问世后，特别是在应用于间期核检测染色体非整体得到证实以来[1]，FISH技术发展迅猛且日臻完善。人类22对常染色体和X、Y性染色体的不同类型的探针均已能制备，如着丝粒α卫星探针、染色体特异性探针池、单一序列探针和端粒探针等。我们选用13/21 α卫星探针，因其DNA片段可重复几百次到几千次，杂交信号强，特异性高，在间期核中分布集中。具有操作简便、杂交率高，适合于染色体数目异常的唐氏综合征的快速诊断。
, 百拇医药
材料：唐氏综合征患儿来自我院遗传咨询门诊，从1996年1月～1998年12月经细胞遗传学检查确认为唐氏综合征患儿10例，其中男6例，女4例。年龄最小3 d，最大7岁。对照组为我院正常婚检人群作血常规检查的标本。
方法：1. 中期染色体的制备：对照组及唐氏综合征患儿组肝素抗凝静脉血0.5 ml左右，接种RPMI 1640液体培养基，经72 h培养后，按常规细胞遗传学处理，制备染色体玻片，备用。
2. 未培养间期核的制备：对照组及唐氏综合征患儿组肝素抗凝静脉血1～2 ml，经淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离，提取白细胞，直接低渗、预固定、固定。以细胞核均匀分散、尽可能不重叠的浓度滴片，空气干燥备用。
3. 荧光原位杂交：(1) 标本玻片预处理：将备用玻片置37℃ pH值为7.0的2×SSC(氯化钠，枸椽酸钠溶液)中水浴30 min后，室温下分别以70%、80%、95%的酒精脱水2 min，空气干燥。(2) 玻片变性：将标本玻片置已预热至70℃的pH值为7.0的70%甲酰胺/2×SSC溶液中变性2 min，立即在70%、80%、95%系列冷酒精(-20℃)中脱水2 min，空气干燥。(3) 13/21 α卫星探针(Oncor公司)变性：探针置于37℃预温5 min，旋涡混匀器混匀后高速离心2～3 s，将1.5 μl探针加到30 μl Hybrisol VI(杂交液6，Oncor公司) 杂交液中，在微型离心管中混匀，70℃水浴变性5 min，离心2～3 s，置4℃冰浴中备用。(4)标本玻片杂交：将25 mm×25 mm的基因框贴于已变性的玻片上，取30 μl探针杂交混合液置于已变性的玻片上，盖上塑料盖片置37℃湿盒中孵育16 h，去除塑料盖片及基因框。将去除盖片的玻片投入预热71℃，0.25×SSC中5 min，然后置于1×PBS(磷酸盐缓冲液)中室温下2 min。取出玻片加入20 μl异硫氰酸荧光素抗地高辛抗体检测试剂(FITC/Anit-Digoxigenin)，盖上玻璃盖片，37℃湿盒避光温育5 min。移去盖片，在1×PBS室温下洗3次各2 min，加入20 μl兔抗羊抗体 (rabbit anti-sheep)。盖上盖玻片，37℃湿盒中孵育15 min，移去盖片，在1×PBD中室温下洗3次，每次2 min，加抗兔抗体 (FITC/anti-rabbit) 20 μl，37℃湿盒中避光孵育15 min，移去盖片，再用1×PBS室温下洗3次每次2 min，加10 μl碘化丙啶(PI)复染。将玻片置BH2-RFCA型奥林巴斯荧光显微镜下，激发波长490 nm，阻滞波长515 nm，观察杂交信号，并用ASA 400彩色胶卷照相记录。
, 百拇医药
4. 间期核计数杂交信号的规则：每例随机分析500个间期核，镜下必须是核膜完整，单个核分布较均匀，核内杂交信号明亮清晰无重叠(信号间距大于信号直径)，信号弥散及微弱均不作统计，油镜下分别统计0、1、2、3、4、≥5个杂交信号的核数[2]。
结果：1. 13/21 α卫星探针与外周血未培养的间期核杂交，对照组83.3%的核含有4个杂交信号(图1)，唐氏综合征组81.5%的核含有5个杂交信号(图2)，二组总和的杂交率分别为96.7%和97.5%，平均高达97.0%以上。二组含不同数目杂交信号的间期核的平均百分比及范围见表1。
图1 与未培养的正常个体淋巴细胞间期核杂交示间期核中有4个杂交信号
, 百拇医药
图2 与未培养的患儿淋巴细胞间期核杂交示间期核中有5个杂交信号
表1 13/21α卫星探针在对照组及唐氏综合征组未
培养淋巴细胞杂交间期核中的信号分布平均值及范围(%) 组别
例数
分析核
总数
杂交信号数
核型
0
1
2
3
, http://www.100md.com
4
≥5
对照组
5
2500
3.2
0.3
3.7
8.1
83.3
1.3
(0.8～5.2)
(0.1～1.1)
, 百拇医药
(1.5～4.3)
(4.2～10.1)
(71.5～93.2)
(0～2.7)
46，XX，(XY)
唐氏综
10
5000
2.7
0.2
3.1
4.5
, 百拇医药 8.2
81.5
合征组
(0.7～4.6)
(0.1～1.4)
(0.9～4.8)
(2.6～5.9)
(6.7～11.3)
(62.7～95.7)
47，XX，(XY)
2. 13/21 α卫星探针与培养后的中期分裂相杂交，在D组和G组染色体着丝粒处有淡绿色杂交信号，对照组可见4条染色体的着丝粒处有信号(图3)。唐氏综合征组可见5条染色体的着丝粒处有信号，其中3条染色体的长度清楚显示出是属于G组(图4)。与我们用G显带确诊的唐氏综合征结果完全一致。
, 百拇医药
图3与培养的正常个体淋巴细胞中期分裂相杂交示
4条具端着丝粒的染色体的着丝粒部位有杂交信号
图4与培养的患儿淋巴细胞中期分裂相杂交示5条
具端着丝粒的染色体的着丝粒部位有杂交信号
讨论：细胞培养及核型分析已广泛应用于诊断染色体结构和数目异常引起的疾病，但是这一技术不仅需要繁琐和较长的培养周期，而且由于受种种因素的影响，最终的培养结果并不一定能满足核型分析的要求，而无法确诊。
FISH技术作为一种细胞与分子相结合的新方法不但简便、敏感、特异、快速和准确，而且不论在中期分裂相中还是在未培养的间期核中均能进行。该技术在遗传学领域里的基础研究或应用学科中都日益受到关注。目前用于FISH的探针有着丝粒α卫星探针、单一序列探针、涂色探针和末端探针等，因具有各自的不同特点，对于不同的研究目的而有所侧重。如单一序列探针，DNA片段小，探针越小，杂交位点信号相对弱，检出率越低；涂色探针，由于整条染色体显色、特异性不强，杂交时容易产生整张片都显示荧光，而必须采用染色体原位抑制杂交技术(CISS)。如何准确把握竞争DNA的剂量，增加了该技术操作的难度。
, 百拇医药
本研究结果表明，不仅在中期染色体的着丝粒上信号清晰、明亮，而且在未培养的间期核中，也表现为信号集中、荧光强，杂交率高达97%以上的特点。选用该探针对未培养的淋巴细胞进行杂交能可靠有效地区别出二倍体和非整倍体。13/21 α卫星探针DNA片段重复几百到几千次不等，故杂交信号强，不论在分裂中期还是间期核中都分布集中，既具有染色体的特异性，又能够在某一条染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交信号，有利于迅速而准确计数。该探针不足之处是不能把13号与21号染色体分开，但21、13、18、XY染色体畸变占染色体数目异常的95%[3]，且唐氏综合征的群体发病率居于首位，高于其他染色体数目异常发病率的8倍至数十倍。45%以上的13三体综合征患儿在出生后1个月内死亡，仅有5%的患儿可存活5年，而且13三体综合征的临床表现除严重的智力障碍外，全身其他器官畸形比唐氏综合征更严重[4]。因此在临床中遇到智力低下患儿的鉴别诊断时，应用13/21 α卫星探针来排除唐氏综合征患儿的方法是完全可行的。
, http://www.100md.com 本组患儿经细胞遗传学分析均属标准型唐氏综合征，由于该探针设计特点是针对着丝粒DNA，我们认为对于唐氏综合征易位型，只要易位区带累及到着丝粒，不论在中期染色体或间期核内均应有5个信号点，包括罗伯逊易位中的双着丝粒。但是如果易位是在21号染色体的末端或不含着丝粒的其他片段，则信号只能出现4点。在唐氏综合征嵌合型中的信号分布，则随患儿体内2种细胞系所占比例而定。正常细胞系比例大，含4个信号的细胞比例则大。唐氏综合征细胞干系比例大，则含5个信号的细胞比例大。由于该类型仅占唐氏综合征发病率的2.7%[4]，因此而造成检测结果出现假阴性的机率是极小的。
Rlinger等[5]提出唐氏综合征间期FISH诊断标准，含5个信号核的比例小于23%为二倍体，大于或等于42%为三倍体，23%～42%为不确定。我们的结果显示，5个信号点在对照组最多不超过2.7%，在唐氏综合征组最少也有62.7%，并没有出现23.0%～42.0%无法确定的比例区段。因此对13/21α卫星探针来说，诊断唐氏综合征的标准为≥60.0%有5个信号点。正常二倍体5个信号点应小于3.0%。
, http://www.100md.com
我们的结果与苏光等[6]的报道接近，但不论是唐氏综合征组出现的5个信号点，还是正常组出现4个信号点的平均百分比均要高。我们分析，虽然同样是未培养的外周抗凝血，他们是直接制片。而我们采用淋巴细胞分离液提取白细胞，然后低渗，预固定，固定处理，这有利于提高和纯化白细胞成份，经低渗后使细胞核的体积增大变得疏松，而更有利于探针与靶细胞的杂交。我们对方法的稍加改良，虽然操作增多了一点，但杂交效果明显提高，使该探针运用于唐氏综合征快速诊断更具优势。
该方法所用试剂虽多为国外生产，不过基因有限公司在国内均有代理。当然该方法的推广与普及有赖于探针价格降低及更多采用自己配制的试剂来代替其他进口试剂。
基金项目：广东省科委重点科技基金资助项目(9658)
参考文献：
[1]Cremer T, Tesin D. Rapid interphase and metaphase assessment of specific chromosomal changes in neuroectodermal tumor cells by in situ hybridization with chemically modified DNA probes. Exp Cell Res, 1988, 176:199-220.
, 百拇医药
[2]Davies AF, Barber L, Murer-Drlando M, et al. FISH detection of drisomy 21 in interphas by the simultaneous use of two differentially labelled cosmid contigs. Am J Med Genet, 1994, 31:679-685.
[3]Roger V, Robert R, Flandermeyer R, et al. Prenatal diagnosis with repetitive in situ hybridization probes. Am J Med Genet, 1992, 43: 848-854.
[4]夏家辉, 李麓芸, 主编. 染色体病. 北京: 科学出版社, 1989. 175-176.
[5]Klinger K, Langes G, Shook D, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by sing fluorescence in situ hybridization (FISH). J Hum Genet, 1992, 51:55-65.
[6]苏光, 乔惠珍, 于慧敏, 等. 未培养外周血间期分子细胞遗传学研究. 中国优生与遗传杂志， 1998, 6(3): 32-34.
收稿日期：1999-04-06, http://www.100md.com
单位：李文典 叶兹礼 周玉球 吴玉萍 肖鸽飞 朱兰芳：广东省珠海市妇幼保健院医学遗传研究所 519000
关键词：
中华儿科杂志000121 唐氏综合征(也称先天愚型，21三体综合征)是人类常染色体最常见的异常，在智力低下的患儿鉴别诊断中，唐氏综合征的诊断都是采用传统的细胞遗传学检查。但需要进行细胞培养、染色体核型分析，不仅整个实验周期长，而且影响培养成功的因素很多，使一般条件的实验室开展这项检查受到限制。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization ,FISH)技术问世后，特别是在应用于间期核检测染色体非整体得到证实以来[1]，FISH技术发展迅猛且日臻完善。人类22对常染色体和X、Y性染色体的不同类型的探针均已能制备，如着丝粒α卫星探针、染色体特异性探针池、单一序列探针和端粒探针等。我们选用13/21 α卫星探针，因其DNA片段可重复几百次到几千次，杂交信号强，特异性高，在间期核中分布集中。具有操作简便、杂交率高，适合于染色体数目异常的唐氏综合征的快速诊断。
, 百拇医药
材料：唐氏综合征患儿来自我院遗传咨询门诊，从1996年1月～1998年12月经细胞遗传学检查确认为唐氏综合征患儿10例，其中男6例，女4例。年龄最小3 d，最大7岁。对照组为我院正常婚检人群作血常规检查的标本。
方法：1. 中期染色体的制备：对照组及唐氏综合征患儿组肝素抗凝静脉血0.5 ml左右，接种RPMI 1640液体培养基，经72 h培养后，按常规细胞遗传学处理，制备染色体玻片，备用。
2. 未培养间期核的制备：对照组及唐氏综合征患儿组肝素抗凝静脉血1～2 ml，经淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离，提取白细胞，直接低渗、预固定、固定。以细胞核均匀分散、尽可能不重叠的浓度滴片，空气干燥备用。
3. 荧光原位杂交：(1) 标本玻片预处理：将备用玻片置37℃ pH值为7.0的2×SSC(氯化钠，枸椽酸钠溶液)中水浴30 min后，室温下分别以70%、80%、95%的酒精脱水2 min，空气干燥。(2) 玻片变性：将标本玻片置已预热至70℃的pH值为7.0的70%甲酰胺/2×SSC溶液中变性2 min，立即在70%、80%、95%系列冷酒精(-20℃)中脱水2 min，空气干燥。(3) 13/21 α卫星探针(Oncor公司)变性：探针置于37℃预温5 min，旋涡混匀器混匀后高速离心2～3 s，将1.5 μl探针加到30 μl Hybrisol VI(杂交液6，Oncor公司) 杂交液中，在微型离心管中混匀，70℃水浴变性5 min，离心2～3 s，置4℃冰浴中备用。(4)标本玻片杂交：将25 mm×25 mm的基因框贴于已变性的玻片上，取30 μl探针杂交混合液置于已变性的玻片上，盖上塑料盖片置37℃湿盒中孵育16 h，去除塑料盖片及基因框。将去除盖片的玻片投入预热71℃，0.25×SSC中5 min，然后置于1×PBS(磷酸盐缓冲液)中室温下2 min。取出玻片加入20 μl异硫氰酸荧光素抗地高辛抗体检测试剂(FITC/Anit-Digoxigenin)，盖上玻璃盖片，37℃湿盒避光温育5 min。移去盖片，在1×PBS室温下洗3次各2 min，加入20 μl兔抗羊抗体 (rabbit anti-sheep)。盖上盖玻片，37℃湿盒中孵育15 min，移去盖片，在1×PBD中室温下洗3次，每次2 min，加抗兔抗体 (FITC/anti-rabbit) 20 μl，37℃湿盒中避光孵育15 min，移去盖片，再用1×PBS室温下洗3次每次2 min，加10 μl碘化丙啶(PI)复染。将玻片置BH2-RFCA型奥林巴斯荧光显微镜下，激发波长490 nm，阻滞波长515 nm，观察杂交信号，并用ASA 400彩色胶卷照相记录。
, 百拇医药
4. 间期核计数杂交信号的规则：每例随机分析500个间期核，镜下必须是核膜完整，单个核分布较均匀，核内杂交信号明亮清晰无重叠(信号间距大于信号直径)，信号弥散及微弱均不作统计，油镜下分别统计0、1、2、3、4、≥5个杂交信号的核数[2]。
结果：1. 13/21 α卫星探针与外周血未培养的间期核杂交，对照组83.3%的核含有4个杂交信号(图1)，唐氏综合征组81.5%的核含有5个杂交信号(图2)，二组总和的杂交率分别为96.7%和97.5%，平均高达97.0%以上。二组含不同数目杂交信号的间期核的平均百分比及范围见表1。
图1 与未培养的正常个体淋巴细胞间期核杂交示间期核中有4个杂交信号
, 百拇医药
图2 与未培养的患儿淋巴细胞间期核杂交示间期核中有5个杂交信号
表1 13/21α卫星探针在对照组及唐氏综合征组未
培养淋巴细胞杂交间期核中的信号分布平均值及范围(%) 组别
例数
分析核
总数
杂交信号数
核型
0
1
2
3
, http://www.100md.com
4
≥5
对照组
5
2500
3.2
0.3
3.7
8.1
83.3
1.3
(0.8～5.2)
(0.1～1.1)
, 百拇医药
(1.5～4.3)
(4.2～10.1)
(71.5～93.2)
(0～2.7)
46，XX，(XY)
唐氏综
10
5000
2.7
0.2
3.1
4.5
, 百拇医药 8.2
81.5
合征组
(0.7～4.6)
(0.1～1.4)
(0.9～4.8)
(2.6～5.9)
(6.7～11.3)
(62.7～95.7)
47，XX，(XY)
2. 13/21 α卫星探针与培养后的中期分裂相杂交，在D组和G组染色体着丝粒处有淡绿色杂交信号，对照组可见4条染色体的着丝粒处有信号(图3)。唐氏综合征组可见5条染色体的着丝粒处有信号，其中3条染色体的长度清楚显示出是属于G组(图4)。与我们用G显带确诊的唐氏综合征结果完全一致。
, 百拇医药
图3与培养的正常个体淋巴细胞中期分裂相杂交示
4条具端着丝粒的染色体的着丝粒部位有杂交信号
图4与培养的患儿淋巴细胞中期分裂相杂交示5条
具端着丝粒的染色体的着丝粒部位有杂交信号
讨论：细胞培养及核型分析已广泛应用于诊断染色体结构和数目异常引起的疾病，但是这一技术不仅需要繁琐和较长的培养周期，而且由于受种种因素的影响，最终的培养结果并不一定能满足核型分析的要求，而无法确诊。
FISH技术作为一种细胞与分子相结合的新方法不但简便、敏感、特异、快速和准确，而且不论在中期分裂相中还是在未培养的间期核中均能进行。该技术在遗传学领域里的基础研究或应用学科中都日益受到关注。目前用于FISH的探针有着丝粒α卫星探针、单一序列探针、涂色探针和末端探针等，因具有各自的不同特点，对于不同的研究目的而有所侧重。如单一序列探针，DNA片段小，探针越小，杂交位点信号相对弱，检出率越低；涂色探针，由于整条染色体显色、特异性不强，杂交时容易产生整张片都显示荧光，而必须采用染色体原位抑制杂交技术(CISS)。如何准确把握竞争DNA的剂量，增加了该技术操作的难度。
, 百拇医药
本研究结果表明，不仅在中期染色体的着丝粒上信号清晰、明亮，而且在未培养的间期核中，也表现为信号集中、荧光强，杂交率高达97%以上的特点。选用该探针对未培养的淋巴细胞进行杂交能可靠有效地区别出二倍体和非整倍体。13/21 α卫星探针DNA片段重复几百到几千次不等，故杂交信号强，不论在分裂中期还是间期核中都分布集中，既具有染色体的特异性，又能够在某一条染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交信号，有利于迅速而准确计数。该探针不足之处是不能把13号与21号染色体分开，但21、13、18、XY染色体畸变占染色体数目异常的95%[3]，且唐氏综合征的群体发病率居于首位，高于其他染色体数目异常发病率的8倍至数十倍。45%以上的13三体综合征患儿在出生后1个月内死亡，仅有5%的患儿可存活5年，而且13三体综合征的临床表现除严重的智力障碍外，全身其他器官畸形比唐氏综合征更严重[4]。因此在临床中遇到智力低下患儿的鉴别诊断时，应用13/21 α卫星探针来排除唐氏综合征患儿的方法是完全可行的。
, http://www.100md.com 本组患儿经细胞遗传学分析均属标准型唐氏综合征，由于该探针设计特点是针对着丝粒DNA，我们认为对于唐氏综合征易位型，只要易位区带累及到着丝粒，不论在中期染色体或间期核内均应有5个信号点，包括罗伯逊易位中的双着丝粒。但是如果易位是在21号染色体的末端或不含着丝粒的其他片段，则信号只能出现4点。在唐氏综合征嵌合型中的信号分布，则随患儿体内2种细胞系所占比例而定。正常细胞系比例大，含4个信号的细胞比例则大。唐氏综合征细胞干系比例大，则含5个信号的细胞比例大。由于该类型仅占唐氏综合征发病率的2.7%[4]，因此而造成检测结果出现假阴性的机率是极小的。
Rlinger等[5]提出唐氏综合征间期FISH诊断标准，含5个信号核的比例小于23%为二倍体，大于或等于42%为三倍体，23%～42%为不确定。我们的结果显示，5个信号点在对照组最多不超过2.7%，在唐氏综合征组最少也有62.7%，并没有出现23.0%～42.0%无法确定的比例区段。因此对13/21α卫星探针来说，诊断唐氏综合征的标准为≥60.0%有5个信号点。正常二倍体5个信号点应小于3.0%。
, http://www.100md.com
我们的结果与苏光等[6]的报道接近，但不论是唐氏综合征组出现的5个信号点，还是正常组出现4个信号点的平均百分比均要高。我们分析，虽然同样是未培养的外周抗凝血，他们是直接制片。而我们采用淋巴细胞分离液提取白细胞，然后低渗，预固定，固定处理，这有利于提高和纯化白细胞成份，经低渗后使细胞核的体积增大变得疏松，而更有利于探针与靶细胞的杂交。我们对方法的稍加改良，虽然操作增多了一点，但杂交效果明显提高，使该探针运用于唐氏综合征快速诊断更具优势。
该方法所用试剂虽多为国外生产，不过基因有限公司在国内均有代理。当然该方法的推广与普及有赖于探针价格降低及更多采用自己配制的试剂来代替其他进口试剂。
基金项目：广东省科委重点科技基金资助项目(9658)
参考文献：
[1]Cremer T, Tesin D. Rapid interphase and metaphase assessment of specific chromosomal changes in neuroectodermal tumor cells by in situ hybridization with chemically modified DNA probes. Exp Cell Res, 1988, 176:199-220.
, 百拇医药
[2]Davies AF, Barber L, Murer-Drlando M, et al. FISH detection of drisomy 21 in interphas by the simultaneous use of two differentially labelled cosmid contigs. Am J Med Genet, 1994, 31:679-685.
[3]Roger V, Robert R, Flandermeyer R, et al. Prenatal diagnosis with repetitive in situ hybridization probes. Am J Med Genet, 1992, 43: 848-854.
[4]夏家辉, 李麓芸, 主编. 染色体病. 北京: 科学出版社, 1989. 175-176.
[5]Klinger K, Langes G, Shook D, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by sing fluorescence in situ hybridization (FISH). J Hum Genet, 1992, 51:55-65.
[6]苏光, 乔惠珍, 于慧敏, 等. 未培养外周血间期分子细胞遗传学研究. 中国优生与遗传杂志， 1998, 6(3): 32-34.
收稿日期：1999-04-06, http://www.100md.com