AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞生长抑制作用的观察
作者：肖慧捷
单位：肖慧捷(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000219 N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(N-Acetyl-Seryl-Aspartyl-Lysyl-Proline，AcSDKP)这一四肽链是Frindek等[1]于1977年首次从胎牛骨髓中提取的一种生理性造血细胞生长抑制因子,它可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其停留在G0期而发挥其生长抑制作用。随后的研究发现，AcSDKP对非造血细胞如淋巴细胞也有生长抑制作用[2,3]。但目前我们尚不知AcSDKP在肾脏细胞增殖中是否起作用,本研究观察了AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑制作用。借以探索一种新的抑制肾脏细胞慢性增殖的思路和方法。
, http://www.100md.com 材料和方法
1.细胞培养：将在-70℃液氮内冻存的大鼠肾间质成纤维细胞复苏转种至5个含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基、直径为90 mm塑料培养皿中，放入CO2恒温培养箱孵育。细胞培养孵育箱箱温为37℃,含5%C02、95%空气。一般数小时即可见成纤维细胞贴壁，2～3 d布满培养皿底部，此时的成纤维细胞极纯，可用来作研究。
2.反应物：合成的AcSDKP，购自BEX CO.,LTDTOKYO公司。用双蒸水将其配制成不同浓度备用。Alamar blue：购自Mfg By AccuMed公司，专利号5,501.959。
3.成纤维细胞增生系列：将培养皿中成纤维细胞调配至2.5×104/ml的浓度，种植在96孔塑料细胞培养基中,将浓度(mol/L)分别为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5的AcSDKP加入到培养皿中共同孵育24～48 h以上。
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4.Alamar blue测定法：将与AcSDKP共同孵育24及48 h后的成纤维细胞培养基中,加入Alarm blue共同孵育4 h后，用Bio-RAD-Model 550微板测定仪测定其吸光度(A)(吸收光谱570～590 nm)。空白对照组：为成纤维细胞本身。
统计学分析:采用t检验法及F和Duwnett检验法。
结果
1.成纤维细胞在AcSDKP 1 μmol/L的浓度中孵育24及48 h后,分别测定其吸光度(A)值，发现24 h Alarm blue的A值与对照组差异无显著意义。当孵育48 h后,其A值与对照组差异有非常显著意义(P<0.001)。
2.不同浓度的AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑制作用具有随浓度而变化的特性；将成纤维细胞分别孵育在浓度(mol/L)10-9、10-8、10-7、10-6、10-5的AcSDKP中，测定其48 h的A值时发现,当AcSDKP为10-7、10-6、10-5mol/L时与对照组差异有显著意义(P<0.05)，AcSDKP对细胞的生长、抑制作用具有随浓度而变化的特性,当AcSDKP的浓度高于10-5 mol/L或低于10-8 mol/L时,其抑制作用消失,最大抑制浓度为10-6 mol/L，最大抑制率约33%(10-6 mol/L)。
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讨论
肾脏细胞增生是肾小球纤维化和硬化的早期病理过程。它受细胞增殖调节因子影响。细胞生长与否取决于促生长因子与细胞生长抑制因子之间复杂的平衡调节。在肾脏间质中成纤维细胞起骨架作用，而且通过自分泌及旁分泌机制参与了肾小球纤维化及硬化过程。至今为止,我们对于细胞生长负性调节因子所知甚少。在本研究中,我们观察了一种生理性细胞生长抑制因子AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑长抑制作用。结果发现AcSDKP对肾间质成纤维细胞具有生长抑制作用,而且其生长、抑制作用具有随浓度而变化的特性,当AcSDKP的浓度高于10-5 mol/L或低于10-8 mol/L时,其抑制作用消失,最大抑制浓度为10-6 mol/L。最大抑制率约33%。本研究表明AcSDKP的生长抑制作用不仅仅局限于造血干细胞，它对于其他细胞如肾脏间质中成纤维细胞也有生长抑制作用,它可能对抑制肾脏细胞增生也起一定调节作用。肾脏疾病慢性化进程中AcSDKP是否参与作用是一个很令人感兴趣的问题。本研究为阻滞肾脏细胞慢性增生、纤维化提供了一种新思路和方法。
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志谢 本研究主要工作在东京女子医科大学完成。特此向日本老师岩本典子、吉冈俊正、白发宏司、伊藤克己志谢
基金项目：日中医学会川医学奖学金、川医学生同学会基金资助项目(026)
参考文献
1.Frindek E, Guigon M. Inhibition of CFU entry into cycle by a bone marrow extract. Exp Hematol, 1977, 5:74-76.
2.Lenfant M, Wdzieczak-Bakala J, Guittet E . Inhibitor of hematopoietic pluripotent stem cell proliferation: purification and determination of its structure. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:779-782.
3.Li J, Volkov L, Comte L, et al. Production and consumption of the tetrapeptide AcSDKP, a negative regulator of hematopoietic stem cells, by hematopoietic microenvironmental cells. Exp Hematol, 1997,25:140-146.
收稿日期：1999-05-27, 百拇医药
单位：肖慧捷(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000219 N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(N-Acetyl-Seryl-Aspartyl-Lysyl-Proline，AcSDKP)这一四肽链是Frindek等[1]于1977年首次从胎牛骨髓中提取的一种生理性造血细胞生长抑制因子,它可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其停留在G0期而发挥其生长抑制作用。随后的研究发现，AcSDKP对非造血细胞如淋巴细胞也有生长抑制作用[2,3]。但目前我们尚不知AcSDKP在肾脏细胞增殖中是否起作用,本研究观察了AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑制作用。借以探索一种新的抑制肾脏细胞慢性增殖的思路和方法。
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1.细胞培养：将在-70℃液氮内冻存的大鼠肾间质成纤维细胞复苏转种至5个含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基、直径为90 mm塑料培养皿中，放入CO2恒温培养箱孵育。细胞培养孵育箱箱温为37℃,含5%C02、95%空气。一般数小时即可见成纤维细胞贴壁，2～3 d布满培养皿底部，此时的成纤维细胞极纯，可用来作研究。
2.反应物：合成的AcSDKP，购自BEX CO.,LTDTOKYO公司。用双蒸水将其配制成不同浓度备用。Alamar blue：购自Mfg By AccuMed公司，专利号5,501.959。
3.成纤维细胞增生系列：将培养皿中成纤维细胞调配至2.5×104/ml的浓度，种植在96孔塑料细胞培养基中,将浓度(mol/L)分别为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5的AcSDKP加入到培养皿中共同孵育24～48 h以上。
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4.Alamar blue测定法：将与AcSDKP共同孵育24及48 h后的成纤维细胞培养基中,加入Alarm blue共同孵育4 h后，用Bio-RAD-Model 550微板测定仪测定其吸光度(A)(吸收光谱570～590 nm)。空白对照组：为成纤维细胞本身。
统计学分析:采用t检验法及F和Duwnett检验法。
结果
1.成纤维细胞在AcSDKP 1 μmol/L的浓度中孵育24及48 h后,分别测定其吸光度(A)值，发现24 h Alarm blue的A值与对照组差异无显著意义。当孵育48 h后,其A值与对照组差异有非常显著意义(P<0.001)。
2.不同浓度的AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑制作用具有随浓度而变化的特性；将成纤维细胞分别孵育在浓度(mol/L)10-9、10-8、10-7、10-6、10-5的AcSDKP中，测定其48 h的A值时发现,当AcSDKP为10-7、10-6、10-5mol/L时与对照组差异有显著意义(P<0.05)，AcSDKP对细胞的生长、抑制作用具有随浓度而变化的特性,当AcSDKP的浓度高于10-5 mol/L或低于10-8 mol/L时,其抑制作用消失,最大抑制浓度为10-6 mol/L，最大抑制率约33%(10-6 mol/L)。
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讨论
肾脏细胞增生是肾小球纤维化和硬化的早期病理过程。它受细胞增殖调节因子影响。细胞生长与否取决于促生长因子与细胞生长抑制因子之间复杂的平衡调节。在肾脏间质中成纤维细胞起骨架作用，而且通过自分泌及旁分泌机制参与了肾小球纤维化及硬化过程。至今为止,我们对于细胞生长负性调节因子所知甚少。在本研究中,我们观察了一种生理性细胞生长抑制因子AcSDKP对大鼠肾间质成纤维细胞的生长抑长抑制作用。结果发现AcSDKP对肾间质成纤维细胞具有生长抑制作用,而且其生长、抑制作用具有随浓度而变化的特性,当AcSDKP的浓度高于10-5 mol/L或低于10-8 mol/L时,其抑制作用消失,最大抑制浓度为10-6 mol/L。最大抑制率约33%。本研究表明AcSDKP的生长抑制作用不仅仅局限于造血干细胞，它对于其他细胞如肾脏间质中成纤维细胞也有生长抑制作用,它可能对抑制肾脏细胞增生也起一定调节作用。肾脏疾病慢性化进程中AcSDKP是否参与作用是一个很令人感兴趣的问题。本研究为阻滞肾脏细胞慢性增生、纤维化提供了一种新思路和方法。
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志谢 本研究主要工作在东京女子医科大学完成。特此向日本老师岩本典子、吉冈俊正、白发宏司、伊藤克己志谢
基金项目：日中医学会川医学奖学金、川医学生同学会基金资助项目(026)
参考文献
1.Frindek E, Guigon M. Inhibition of CFU entry into cycle by a bone marrow extract. Exp Hematol, 1977, 5:74-76.
2.Lenfant M, Wdzieczak-Bakala J, Guittet E . Inhibitor of hematopoietic pluripotent stem cell proliferation: purification and determination of its structure. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:779-782.
3.Li J, Volkov L, Comte L, et al. Production and consumption of the tetrapeptide AcSDKP, a negative regulator of hematopoietic stem cells, by hematopoietic microenvironmental cells. Exp Hematol, 1997,25:140-146.
收稿日期：1999-05-27, 百拇医药