原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞IL-13的表达及意义
作者：张爱华 陈荣华 吴元俊 潘晓勤 黄文彦 蔡毅
单位：张爱华 陈荣华 吴元俊 潘晓勤 黄文彦 蔡毅(210029 南京医科大学小儿肾脏病研究中心)
关键词：
中华儿科杂志000316 白细胞介素13(IL-13)是新近发现的一种主要由Th2细胞产生的抗炎性细胞因子，能有效地抑制单核巨噬细胞、中性粒细胞及Th1细胞合成炎性细胞因子，在脓毒性休克和类风湿性关节炎中发挥着重要的抗炎作用[1]。我们应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)及ELISA法检测了50例原发性肾病综合征(PNS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)在PHA刺激下IL-13 mRNA及培养上清中蛋白水平的变化，以探讨其在PNS发病机制中的作用。
对象
, 百拇医药
PNS患儿50例，男30例，女20例，平均年龄7.8岁(3～13岁)。其中单纯性肾病(SNS)27例，肾炎性肾病(NNS)23例；初发28例，均未使用激素治疗，复发22例，既往曾使用激素，但近两周内未使用激素治疗；此外，初发患儿根据对激素治疗反应分为激素敏感组和激素耐药组，激素敏感组为泼尼松2 mg/(kg。d)，治疗8周尿蛋白转阴的患儿，共18例；激素耐药组为泼尼松2 mg/(kg。d)，治疗8周尿蛋白仍>(++)，共10例。PNS的诊断符合全国儿科肾脏病科研协作组制定的诊断标准。于患儿入院后在激素治疗前尿蛋白阳性(肾病期)以及经治疗尿蛋白转阴两周后(缓解期)收集外周静脉血标本。30例正常健康体检儿童作为对照组，男16例，女14例，平均年龄6.0岁(1.5～12岁)。
方法
1.PBMC分离及培养：按泛影葡胺-聚蔗糖法分离出PBMC，调整细胞浓度至2×106/ml。在PHA终浓度为20 μg/ml，37℃和5% CO2条件下培养24 h，收集培养细胞，抽提细胞总RNA，培养48 h，收集上清液置-70℃保存待检。
, 百拇医药
2.细胞总RNA提取及cDNA合成：按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)一步法提取细胞总RNA，经Genequant(PharmaciaLKB公司产品)检测总RNA的产量和纯度，吸光度(A) 260/280比值大于1.8。在PCR扩增仪(PE公司产品)上进行逆转录反应，反应体系为：细胞总RNA 1 μg，200 U逆转录酶，20 U RNasin，0.5 mmol/L dNTPs，0.1 μg Oligo(dT)15，总反应体积为20 μl，37 ℃反应1 h，95℃5 min，灭活逆转录酶。
3.PCR反应：取逆转录后的原液10 μl，依次加入0.5 mmol/L dNTPs，3 mmol/L MgCl2，以及β-actin和IL-13特异性引物0.2 mmol/L，1U Ampli Taq DNA聚合酶。总反应体积为50 μl。92℃30秒，56℃30秒，72℃1 min，反应30个循环。 IL-13引物序列为：上游引物：5′-CCCAGAACCAGAAAGGCTCCG-3′；下游引物： 5′-CAGTTGAACCGTCCCTGCCG-3′。以持家基因β-actin作为内参照，其引物序列为：上游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′ ，下游引物：5′-CTACAA-TGAGCTGCGTGTTGGC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
, 百拇医药
4.PCR产物半定量分析：取PCR产物10 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，UVP凝胶图像扫描系统(美国UVP公司产品)对IL-13和β-actin扩增产物的电泳条带进行密度扫描，由计算机计算出各自的积分A值，以A IL-13/β-actin表示IL-13 mRNA相对表达强度。
5.培养上清中IL-13蛋白检测：应用特异性双抗体夹心ELISA法检测培养上清中IL-13浓度，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。按说明书操作。
6.统计学处理：采用t检验进行统计学处理。
结果
1.PNS患儿与正常对照组IL-13水平的比较：PNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.50±0.17 和(49±14) ng/L；正常对照组为0.36±0.15 和(35±4) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝2.69、3.72，P均<0.01)。
, 百拇医药
2.不同病期PNS患儿 IL-13水平的比较：PNS患儿缓解期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.37±0.13 和(38±8)ng/L，与肾病期相比差异有显著意义(t分别=3.56、4.21 ，P均<0.01)。
3.PNS患儿SNS组和NNS组肾病期IL-13水平的比较：NNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.55±0.16 和(53±14) ng/L；SNS患儿为0.46±0.18 和(45±13) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝3.40、4.77，P均<0.05)。
4.PNS患儿初发组与复发组肾病期IL-13水平的比较：初发患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.46±0.18 和(46±3) ng/L，复发患儿为0.55±0.15 和(53±13) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝1.97、1.78，P均<0.05)。
5.初发患儿激素敏感组和激素耐药组IL-13水平的比较：初发患儿肾病期激素敏感组IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.42±0.16 和(42±11) ng/L；激素耐药组为0.53±0.19 和(53±14) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝1.72、2.27，P均<0.05)。
, 百拇医药
讨论
自1974年Shalhoub首次提出微小病变型肾病综合征与T细胞免疫功能紊乱有关以来，已研究证实细胞免疫在肾病综合征发病机制中发挥着重要的作用。近年来，对于肾病综合征时Th细胞亚群Th1/Th2免疫功能的研究开始引起人们的关注。IL-13是一种主要由活化的Th2细胞产生的具有抗炎作用的细胞因子，体内外的研究发现，IL-13对单核巨噬细胞分泌的炎性细胞因子具有普遍的抑制作用，这些炎症因子主要有：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α，巨噬细胞炎性趋化蛋白-1α(MIP-1α)等，并能促进单核巨噬细胞和中性粒细胞IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)的产生[1]。而在肾小球肾炎的炎症反应中，肾脏炎症被启动后，白细胞和血小板通过释放炎症介质而活化肾脏固有细胞，而肾脏固有细胞一旦被活化，又可产生一系列“自身灭活”或“自身抑制”因子，这种自我调节构成了抑制肾脏炎症的防御系统，抗炎症性细胞因子是其中的一个重要部分[2]。
, 百拇医药
本研究结果证实，PNS患儿肾病期IL-13mRNA和蛋白水平显著高于缓解期和正常对照组，进一步研究发现，NNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平显著高于SNS患儿，且IL-13在初发与复发及激素敏感患儿与激素耐药患儿之间有显著差异。Lakkis等应用 RT-PCR研究IL-13 mRNA在抗肾小球基底膜抗体诱导的肾小球肾炎肾组织中表达时发现，肾小球局部IL-13 mRNA在炎症诱导后48小时内表达增加，而对照组肾组织中无IL-13 mRNA的表达[3]。Matsumoto[4]研究证实IL-13可显著抑制自发性以及LPS活化的IgA肾病患者外周血单核细胞TNF和IL-8的产生。此外，IL-13还可抑制TNF-α、IL-1β、IFN-γ及LPS激活的肾小球系膜细胞一氧化氮(NO)的产生及NO合酶(iNOS)mRNA的表达[5]。这些研究结果表明：IL-13作为一种抗炎性细胞因子，可通过抑制单核巨噬细胞炎性细胞因子的产生和肾小球系膜细胞NO的合成而在肾小球肾炎炎症反应中发挥抗炎作用。对于IL-13产生增多的原因，我们认为肾脏固有细胞以及局部浸润的单核巨噬细胞分泌的炎症介质可促使PBMC活化，从而诱导IL-13产生增多。
, 百拇医药
基金项目：江苏省卫生厅科研基金(H9709)
参考文献
1，张爱华，蔡毅.白细胞介素-13与肾脏疾病.国外医学泌尿系统分册，1998，18:118-121.
2，候凡凡.细胞因子与肾脏疾病.中华肾脏病杂志，1999，15:205-206.
3，Lakkis FG，Cruet EN. Cloning of rat interleukin-13 (IL-13) cDNA and analysis of IL-13 gene expression in experimental glomerulonephritis. Biochem Biophys Res Commun，1993,197:612-618.
4，Matsumoto K.Interleukin-13 inhibits cytokine secretion by blood monocytes from patients with IgA nephropathy. Nephron, 1997,75: 295-302.
5，Saura M, Martinez DR, Minty S, et al. Interleukin-13 inhibits inducible nitric oxide syntheses expression in human mesangial cells. Biochem J, 1996,313:641-646.
(收稿日期：1999-07-13), 百拇医药
单位：张爱华 陈荣华 吴元俊 潘晓勤 黄文彦 蔡毅(210029 南京医科大学小儿肾脏病研究中心)
关键词：
中华儿科杂志000316 白细胞介素13(IL-13)是新近发现的一种主要由Th2细胞产生的抗炎性细胞因子，能有效地抑制单核巨噬细胞、中性粒细胞及Th1细胞合成炎性细胞因子，在脓毒性休克和类风湿性关节炎中发挥着重要的抗炎作用[1]。我们应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)及ELISA法检测了50例原发性肾病综合征(PNS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)在PHA刺激下IL-13 mRNA及培养上清中蛋白水平的变化，以探讨其在PNS发病机制中的作用。
对象
, 百拇医药
PNS患儿50例，男30例，女20例，平均年龄7.8岁(3～13岁)。其中单纯性肾病(SNS)27例，肾炎性肾病(NNS)23例；初发28例，均未使用激素治疗，复发22例，既往曾使用激素，但近两周内未使用激素治疗；此外，初发患儿根据对激素治疗反应分为激素敏感组和激素耐药组，激素敏感组为泼尼松2 mg/(kg。d)，治疗8周尿蛋白转阴的患儿，共18例；激素耐药组为泼尼松2 mg/(kg。d)，治疗8周尿蛋白仍>(++)，共10例。PNS的诊断符合全国儿科肾脏病科研协作组制定的诊断标准。于患儿入院后在激素治疗前尿蛋白阳性(肾病期)以及经治疗尿蛋白转阴两周后(缓解期)收集外周静脉血标本。30例正常健康体检儿童作为对照组，男16例，女14例，平均年龄6.0岁(1.5～12岁)。
方法
1.PBMC分离及培养：按泛影葡胺-聚蔗糖法分离出PBMC，调整细胞浓度至2×106/ml。在PHA终浓度为20 μg/ml，37℃和5% CO2条件下培养24 h，收集培养细胞，抽提细胞总RNA，培养48 h，收集上清液置-70℃保存待检。
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2.细胞总RNA提取及cDNA合成：按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)一步法提取细胞总RNA，经Genequant(PharmaciaLKB公司产品)检测总RNA的产量和纯度，吸光度(A) 260/280比值大于1.8。在PCR扩增仪(PE公司产品)上进行逆转录反应，反应体系为：细胞总RNA 1 μg，200 U逆转录酶，20 U RNasin，0.5 mmol/L dNTPs，0.1 μg Oligo(dT)15，总反应体积为20 μl，37 ℃反应1 h，95℃5 min，灭活逆转录酶。
3.PCR反应：取逆转录后的原液10 μl，依次加入0.5 mmol/L dNTPs，3 mmol/L MgCl2，以及β-actin和IL-13特异性引物0.2 mmol/L，1U Ampli Taq DNA聚合酶。总反应体积为50 μl。92℃30秒，56℃30秒，72℃1 min，反应30个循环。 IL-13引物序列为：上游引物：5′-CCCAGAACCAGAAAGGCTCCG-3′；下游引物： 5′-CAGTTGAACCGTCCCTGCCG-3′。以持家基因β-actin作为内参照，其引物序列为：上游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′ ，下游引物：5′-CTACAA-TGAGCTGCGTGTTGGC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
, 百拇医药
4.PCR产物半定量分析：取PCR产物10 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，UVP凝胶图像扫描系统(美国UVP公司产品)对IL-13和β-actin扩增产物的电泳条带进行密度扫描，由计算机计算出各自的积分A值，以A IL-13/β-actin表示IL-13 mRNA相对表达强度。
5.培养上清中IL-13蛋白检测：应用特异性双抗体夹心ELISA法检测培养上清中IL-13浓度，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。按说明书操作。
6.统计学处理：采用t检验进行统计学处理。
结果
1.PNS患儿与正常对照组IL-13水平的比较：PNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.50±0.17 和(49±14) ng/L；正常对照组为0.36±0.15 和(35±4) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝2.69、3.72，P均<0.01)。
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2.不同病期PNS患儿 IL-13水平的比较：PNS患儿缓解期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.37±0.13 和(38±8)ng/L，与肾病期相比差异有显著意义(t分别=3.56、4.21 ，P均<0.01)。
3.PNS患儿SNS组和NNS组肾病期IL-13水平的比较：NNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.55±0.16 和(53±14) ng/L；SNS患儿为0.46±0.18 和(45±13) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝3.40、4.77，P均<0.05)。
4.PNS患儿初发组与复发组肾病期IL-13水平的比较：初发患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.46±0.18 和(46±3) ng/L，复发患儿为0.55±0.15 和(53±13) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝1.97、1.78，P均<0.05)。
5.初发患儿激素敏感组和激素耐药组IL-13水平的比较：初发患儿肾病期激素敏感组IL-13 mRNA和蛋白水平分别为0.42±0.16 和(42±11) ng/L；激素耐药组为0.53±0.19 和(53±14) ng/L，两组差异有显著意义(t分别＝1.72、2.27，P均<0.05)。
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讨论
自1974年Shalhoub首次提出微小病变型肾病综合征与T细胞免疫功能紊乱有关以来，已研究证实细胞免疫在肾病综合征发病机制中发挥着重要的作用。近年来，对于肾病综合征时Th细胞亚群Th1/Th2免疫功能的研究开始引起人们的关注。IL-13是一种主要由活化的Th2细胞产生的具有抗炎作用的细胞因子，体内外的研究发现，IL-13对单核巨噬细胞分泌的炎性细胞因子具有普遍的抑制作用，这些炎症因子主要有：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α，巨噬细胞炎性趋化蛋白-1α(MIP-1α)等，并能促进单核巨噬细胞和中性粒细胞IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)的产生[1]。而在肾小球肾炎的炎症反应中，肾脏炎症被启动后，白细胞和血小板通过释放炎症介质而活化肾脏固有细胞，而肾脏固有细胞一旦被活化，又可产生一系列“自身灭活”或“自身抑制”因子，这种自我调节构成了抑制肾脏炎症的防御系统，抗炎症性细胞因子是其中的一个重要部分[2]。
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本研究结果证实，PNS患儿肾病期IL-13mRNA和蛋白水平显著高于缓解期和正常对照组，进一步研究发现，NNS患儿肾病期IL-13 mRNA和蛋白水平显著高于SNS患儿，且IL-13在初发与复发及激素敏感患儿与激素耐药患儿之间有显著差异。Lakkis等应用 RT-PCR研究IL-13 mRNA在抗肾小球基底膜抗体诱导的肾小球肾炎肾组织中表达时发现，肾小球局部IL-13 mRNA在炎症诱导后48小时内表达增加，而对照组肾组织中无IL-13 mRNA的表达[3]。Matsumoto[4]研究证实IL-13可显著抑制自发性以及LPS活化的IgA肾病患者外周血单核细胞TNF和IL-8的产生。此外，IL-13还可抑制TNF-α、IL-1β、IFN-γ及LPS激活的肾小球系膜细胞一氧化氮(NO)的产生及NO合酶(iNOS)mRNA的表达[5]。这些研究结果表明：IL-13作为一种抗炎性细胞因子，可通过抑制单核巨噬细胞炎性细胞因子的产生和肾小球系膜细胞NO的合成而在肾小球肾炎炎症反应中发挥抗炎作用。对于IL-13产生增多的原因，我们认为肾脏固有细胞以及局部浸润的单核巨噬细胞分泌的炎症介质可促使PBMC活化，从而诱导IL-13产生增多。
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基金项目：江苏省卫生厅科研基金(H9709)
参考文献
1，张爱华，蔡毅.白细胞介素-13与肾脏疾病.国外医学泌尿系统分册，1998，18:118-121.
2，候凡凡.细胞因子与肾脏疾病.中华肾脏病杂志，1999，15:205-206.
3，Lakkis FG，Cruet EN. Cloning of rat interleukin-13 (IL-13) cDNA and analysis of IL-13 gene expression in experimental glomerulonephritis. Biochem Biophys Res Commun，1993,197:612-618.
4，Matsumoto K.Interleukin-13 inhibits cytokine secretion by blood monocytes from patients with IgA nephropathy. Nephron, 1997,75: 295-302.
5，Saura M, Martinez DR, Minty S, et al. Interleukin-13 inhibits inducible nitric oxide syntheses expression in human mesangial cells. Biochem J, 1996,313:641-646.
(收稿日期：1999-07-13), 百拇医药