小儿感染庚型肝炎病毒后肝脏病毒核酸分布与临床关系的研究
作者：张鸿飞 赵景民 杨晓晋 陈菊梅 朱世殊 程云 徐志强 陈大为 包鹤梅
单位：张鸿飞 赵景民 杨晓晋 陈菊梅 朱世殊 程云 徐志强 陈大为 包鹤梅(100039 北京，中国人民解放军第三Ο二医院儿科)
关键词：肝炎；病毒性；人；原位杂交；肝病病毒；RNA；病毒
中华儿科杂志000309 【摘要】 目的 探讨小儿庚型肝炎病毒感染、肝脏庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV RNA)分布与其他HGV标志、肝脏病理损害及与临床的关系。方法 应用原位杂交(ISH)检测17例小儿乙型肝炎患儿肝脏HGV RNA。结果 17例血清抗-HGV阳性者，其中肝脏HGV RNA阳性9例(9/17，53 %)。肝脏HGV RNA分布在汇管区周围，在肝小叶呈散在分布，多呈胞浆型；肝脏HGV RNA阳性组病变和阴性组比较以轻度(G2级以下)为多，与肝纤维化无关；与肝脏HGAg无相关性，与抗-HGV相关(P=0.013)；与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清胆红素(SB)和蛋白电泳的γ球蛋白升高无相关性。结论HGV即使有一定的致病性，其致病力也很弱。对HGV的致病性还需做进一步深入研究。
, 百拇医药
The relationship between the distribution of viral nucleic acid and clinics in children with hepatitis G
ZHANG Hongfei, ZHAO Jingmin, YANG Xiaojin
(Department of Pediatrics, No. 302 Hospital of PLA. Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective To explore possible relationship between the distribution of HGV RNA and other marks in liver of chidren with hepatitis G. Methods HGV RNA in liver tissue of 17 children with hepatitis was detected by using in situ hybridization. Results Dominant staining for HGV RNA was found around portal area, while little in hepatic lobules in cytoplasm type. There was no obvious relation between the quantities of HGV RNA and lesions of liver cells, fibrosis of liver,quantities of HGAg as well as the levels of ALT,serum bilirubin and globulines. However, there was important relation between the quantities of HGV RNA and midium or high level of anti-HGV in sera. Conclusion Because the lesions of liver did not relate to the distribution of HGV RNA, HGV has little pathogenicity in human.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis, viral, human; In situ hybridization; Hepatitis viruses; RNA, viral
有关成人庚型肝炎病毒感染时，肝组织中庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV RNA)的原位杂交(in situs hybridization,ISH)特征与肝脏病理损害、血清HGV RNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清胆红素(SB)和蛋白电泳的γ球蛋白等的关系已有报道[1-3]，但儿童方面的研究尚未见报道[4]。本研究对17例经血清和肝脏HGV RNA，肝脏HGAg进行检测，并结合临床及病理改变进行研究，现将结果报告如下。
对象和方法
一、对象
17例均为本院小儿肝病科住院患儿，平均年龄7.1岁(1～14岁)，平均病程1.6年，男3例，女4例。全部病例经病毒血清学和肝脏病理组织学检查确诊为小儿乙型病毒性肝炎，其诊断依据为1995年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案[5]。
, 百拇医药
二、方法
1.常规检测血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、抗甲型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)、抗戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV)、抗丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)、抗EB病毒IgM抗体(抗-EBVIgM)、抗巨细胞病毒IgM抗体(抗-CMVIgM)。除HBV DNA和HCV RNA采用PCR法外，其余各项均采用ELISA法，由本院免疫室、病毒室制备并检测。
2.抗庚型肝炎病毒抗体(抗-HGV)采用ELISA法，HGV RNA用PCR法。本院免疫研究室制备试剂盒并检测。
3.肝脏HGAg免疫组化检测：本组病例均采用1 s肝穿法获取肝组织做光镜组织学分型。切片常规脱蜡，去内源酶；滴加抗-HGV(本院免疫室程云提供)；加生物素化兔抗鼠IgG(DAK公司)，加抗碱性磷酸酶(DAK公司)；底物显色，封片，判读结果。
, 百拇医药
4.肝组织HGV RNA的ISH检测：寡核苷酸探针系北京医科大学附属人民医院肝病研究所惠赠。用串端转移酶催化地高辛偶联的dd-UTP和寡核苷酸探针相结合(Dig-oligonucleotide-3-endlabaling kid, Boehriner Mannhei公司)，对肝组织行DNA RNA非同位素地高辛标记的ISH检测。
5.统计学方法：统计学分析一致性检验采用精确法，差异性检验采用McHcmarχ2。
结果
一、临床资料
本组17例，血清HBsAg均阳性，血清HBV DNA 4例阳性，血清抗-HAVIgM、抗-HEV、抗-HCV、HCV RNA、抗-EBVIgM、抗-CMVIgM均阴性。
肝脏HGV RNA阳性组9例，男7例，女2例，平均年龄7.6岁，平均病程1.8年，4例无症状起病，2例有输血史，9例有反复注射史。肝脏HGV RNA阴性组8例，平均年龄6.4岁，男6例，女2例，平均病程1.3年，无症状起病1例，有输血史1例，有反复注射史5例。两组在年龄、性别、平均病程、起病方式及有无输血、注射史方面差异无显著性。
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二、肝脏HGV RNA分布与病变的关系
结果表明，本组病例肝脏HGV RNA分布在汇管区周围，在肝小叶呈散在分布(图1)，在病灶中点灶状坏死和碎屑样坏死周边较多，多呈胞浆型，偶见核型，病变细胞与HGV RNA阳性表达呈负相关性。肝脏HGV RNA阳性组的病变以轻度较多，病变全部在G2级以下，阴性组有2例病变为G3级。还观察到肝脏HGV RNA表达与肝脏纤维化无相关性(表1)。
三、肝脏HGV RNA与其他HGV指标
从表2可见，肝脏在HGV RNA表达与肝脏HGAg的分布无相关性(χ2=5.14,P<0.05)。血清抗-HGV与肝脏HGV RNA表达有相关性，中、高滴度时(>++)与肝脏HGV RNA表达关系不明显。血清HGV RNA与肝脏HGV RNA表达相关性不明显。
, 百拇医药
四、肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系
图1 HGV RNA 主要在汇管区周围肝细胞胞浆内检出，肝小叶内少数肝细胞呈散在阳性，核酸原位杂交 ，×400
表1 肝脏HGV RNA表达与病理改变的关系(例数) 肝脏
HGV RNA
例数
病变程度
肝纤维化分期
G1
G2
, 百拇医药
G3
S0-1
S2
S3
S4
阳性
9
7
2
0
6
0
, 百拇医药
1
2
阴性
8
3
3
2
5
1
2
0
注：9例肝脏HGV RNA(+)中G1为7例，8例(-)中G1为3例，χ2=2.84，P>0.05表2 肝脏HGV RNA与其他HGV指标的关系(例数) HGV指标
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肝脏HGV RNA(例数)
一致性
精确法P值
差异性
χ2值
阳性
阴性
合计
肝脏HGAg
阳性
2
0
2
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阴性
7
8
15
0.265
5.14*
血抗-HGV
≥++
5
0
5
≤+
3
, 百拇医药
8
12
0.013
1.33
血HGV RNA
阳性
4
1
5
阴性
5
7
12
0.183
, 百拇医药
1.5
* P<0.05 从表3可见，肝脏HGV RNA的表达与血清ALT升高，血清胆红素(SB)升高，血清蛋白电泳(EP)γ球蛋白异常均无相关性。
表3 肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系(例数) 肝脏
HGV
RNA
例数
ALT升高
SB升高
EP-γ球蛋白
<3倍
, 百拇医药 3～5
倍
>5倍
不高
<3倍
3～5
倍
正常
>21%
阳性
9
6
2
1
, 百拇医药
7
1
1
8
1
阴性
8
6
1
1
7
1
0
7
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1
讨论
本组17例HGV感染的慢性乙型肝炎患儿，血清抗-HGV均阳性。同期检测肝脏HGV RNA。HGV RNA阳性9例(9/17,53%)。本研究结果说明以下观点。
一、肝脏HGV RNA分布及与肝脏病变的关系
肝脏HGV RNA多分布在汇管区，在肝小叶呈散在分布，多为胞浆型，偶见核型，病变细胞与HGV RNA表达呈负相关，结果示病毒核酸分布与病变活动有一定分离，即肝脏HGV RNA阳性组比阴性组病变轻，HGV RNA表达也与肝脏纤维化分期无关。
二、肝脏HGV RNA与其他HGV指标的关系
肝脏HGV RNA表达与肝脏HGAg分布无相关性(P=0.265)。亦说明两者意义不尽相同。HGV RNA更直接反应HGV在肝脏的复制状况，本组结果表明，肝脏HGV RNA阳性检出(53%)高于HGAg(2/17例,12 %，χ2=5.14，P<0.05)。血清抗-HGV滴度与肝脏HGV RNA表达有正相关性(P=0.013)。本组血清HGV RNA检出5例(5/17例，29%)低于肝脏的检出，但差异无显著性(P>0.05)。推测与例数较少有关。
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三、肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系
肝脏HGV RNA表达与血清ALT异常，血清胆红素升高，蛋白电泳γ球蛋白升高均无相关性。以上结果表明，HGV感染即使有一定的致病性，也很弱，对其致病性还需做进一步深入研究。
参考文献
1，Laskus T,Radkowski M,Wang LF,et al.Lack of evidence for hepatitis G virus replication in the liver of patients coinfected with hepatitis C and G viruses.J Viral,1997,71:7804-7806.
2，Medejon A,Fogeda M,Bartolome J,et al.GB virus C RNA in serum, liver and peripheral blood monoclear cells from patients with chronic hepatitis B,C and D.Gastroenterology,1997,113:573- 578.
, 百拇医药
3，杨志国,许家璋,陈万荣,等.庚型肝炎肝脏免疫组化研究.中华传染病杂志,1998,16:91-92.
4，Lopez-Alcorocho JM,Millan A,Garcia-Trevijano ER,et al.Detection of hepatitis GB virus type C RNA in serum and liver from children with chronic viral hepatitis B and C.Hepatology,1997,25:1258-1260.
5，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241-242.
(收稿日期：1999-06-23), 百拇医药
单位：张鸿飞 赵景民 杨晓晋 陈菊梅 朱世殊 程云 徐志强 陈大为 包鹤梅(100039 北京，中国人民解放军第三Ο二医院儿科)
关键词：肝炎；病毒性；人；原位杂交；肝病病毒；RNA；病毒
中华儿科杂志000309 【摘要】 目的 探讨小儿庚型肝炎病毒感染、肝脏庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV RNA)分布与其他HGV标志、肝脏病理损害及与临床的关系。方法 应用原位杂交(ISH)检测17例小儿乙型肝炎患儿肝脏HGV RNA。结果 17例血清抗-HGV阳性者，其中肝脏HGV RNA阳性9例(9/17，53 %)。肝脏HGV RNA分布在汇管区周围，在肝小叶呈散在分布，多呈胞浆型；肝脏HGV RNA阳性组病变和阴性组比较以轻度(G2级以下)为多，与肝纤维化无关；与肝脏HGAg无相关性，与抗-HGV相关(P=0.013)；与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清胆红素(SB)和蛋白电泳的γ球蛋白升高无相关性。结论HGV即使有一定的致病性，其致病力也很弱。对HGV的致病性还需做进一步深入研究。
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The relationship between the distribution of viral nucleic acid and clinics in children with hepatitis G
ZHANG Hongfei, ZHAO Jingmin, YANG Xiaojin
(Department of Pediatrics, No. 302 Hospital of PLA. Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective To explore possible relationship between the distribution of HGV RNA and other marks in liver of chidren with hepatitis G. Methods HGV RNA in liver tissue of 17 children with hepatitis was detected by using in situ hybridization. Results Dominant staining for HGV RNA was found around portal area, while little in hepatic lobules in cytoplasm type. There was no obvious relation between the quantities of HGV RNA and lesions of liver cells, fibrosis of liver,quantities of HGAg as well as the levels of ALT,serum bilirubin and globulines. However, there was important relation between the quantities of HGV RNA and midium or high level of anti-HGV in sera. Conclusion Because the lesions of liver did not relate to the distribution of HGV RNA, HGV has little pathogenicity in human.
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【Key words】 Hepatitis, viral, human; In situ hybridization; Hepatitis viruses; RNA, viral
有关成人庚型肝炎病毒感染时，肝组织中庚型肝炎病毒核糖核酸(HGV RNA)的原位杂交(in situs hybridization,ISH)特征与肝脏病理损害、血清HGV RNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清胆红素(SB)和蛋白电泳的γ球蛋白等的关系已有报道[1-3]，但儿童方面的研究尚未见报道[4]。本研究对17例经血清和肝脏HGV RNA，肝脏HGAg进行检测，并结合临床及病理改变进行研究，现将结果报告如下。
对象和方法
一、对象
17例均为本院小儿肝病科住院患儿，平均年龄7.1岁(1～14岁)，平均病程1.6年，男3例，女4例。全部病例经病毒血清学和肝脏病理组织学检查确诊为小儿乙型病毒性肝炎，其诊断依据为1995年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案[5]。
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二、方法
1.常规检测血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、抗甲型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)、抗戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV)、抗丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)、抗EB病毒IgM抗体(抗-EBVIgM)、抗巨细胞病毒IgM抗体(抗-CMVIgM)。除HBV DNA和HCV RNA采用PCR法外，其余各项均采用ELISA法，由本院免疫室、病毒室制备并检测。
2.抗庚型肝炎病毒抗体(抗-HGV)采用ELISA法，HGV RNA用PCR法。本院免疫研究室制备试剂盒并检测。
3.肝脏HGAg免疫组化检测：本组病例均采用1 s肝穿法获取肝组织做光镜组织学分型。切片常规脱蜡，去内源酶；滴加抗-HGV(本院免疫室程云提供)；加生物素化兔抗鼠IgG(DAK公司)，加抗碱性磷酸酶(DAK公司)；底物显色，封片，判读结果。
, 百拇医药
4.肝组织HGV RNA的ISH检测：寡核苷酸探针系北京医科大学附属人民医院肝病研究所惠赠。用串端转移酶催化地高辛偶联的dd-UTP和寡核苷酸探针相结合(Dig-oligonucleotide-3-endlabaling kid, Boehriner Mannhei公司)，对肝组织行DNA RNA非同位素地高辛标记的ISH检测。
5.统计学方法：统计学分析一致性检验采用精确法，差异性检验采用McHcmarχ2。
结果
一、临床资料
本组17例，血清HBsAg均阳性，血清HBV DNA 4例阳性，血清抗-HAVIgM、抗-HEV、抗-HCV、HCV RNA、抗-EBVIgM、抗-CMVIgM均阴性。
肝脏HGV RNA阳性组9例，男7例，女2例，平均年龄7.6岁，平均病程1.8年，4例无症状起病，2例有输血史，9例有反复注射史。肝脏HGV RNA阴性组8例，平均年龄6.4岁，男6例，女2例，平均病程1.3年，无症状起病1例，有输血史1例，有反复注射史5例。两组在年龄、性别、平均病程、起病方式及有无输血、注射史方面差异无显著性。
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二、肝脏HGV RNA分布与病变的关系
结果表明，本组病例肝脏HGV RNA分布在汇管区周围，在肝小叶呈散在分布(图1)，在病灶中点灶状坏死和碎屑样坏死周边较多，多呈胞浆型，偶见核型，病变细胞与HGV RNA阳性表达呈负相关性。肝脏HGV RNA阳性组的病变以轻度较多，病变全部在G2级以下，阴性组有2例病变为G3级。还观察到肝脏HGV RNA表达与肝脏纤维化无相关性(表1)。
三、肝脏HGV RNA与其他HGV指标
从表2可见，肝脏在HGV RNA表达与肝脏HGAg的分布无相关性(χ2=5.14,P<0.05)。血清抗-HGV与肝脏HGV RNA表达有相关性，中、高滴度时(>++)与肝脏HGV RNA表达关系不明显。血清HGV RNA与肝脏HGV RNA表达相关性不明显。
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四、肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系
图1 HGV RNA 主要在汇管区周围肝细胞胞浆内检出，肝小叶内少数肝细胞呈散在阳性，核酸原位杂交 ，×400
表1 肝脏HGV RNA表达与病理改变的关系(例数) 肝脏
HGV RNA
例数
病变程度
肝纤维化分期
G1
G2
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G3
S0-1
S2
S3
S4
阳性
9
7
2
0
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1
2
阴性
8
3
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注：9例肝脏HGV RNA(+)中G1为7例，8例(-)中G1为3例，χ2=2.84，P>0.05表2 肝脏HGV RNA与其他HGV指标的关系(例数) HGV指标
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肝脏HGV RNA(例数)
一致性
精确法P值
差异性
χ2值
阳性
阴性
合计
肝脏HGAg
阳性
2
0
2
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阴性
7
8
15
0.265
5.14*
血抗-HGV
≥++
5
0
5
≤+
3
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8
12
0.013
1.33
血HGV RNA
阳性
4
1
5
阴性
5
7
12
0.183
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1.5
* P<0.05 从表3可见，肝脏HGV RNA的表达与血清ALT升高，血清胆红素(SB)升高，血清蛋白电泳(EP)γ球蛋白异常均无相关性。
表3 肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系(例数) 肝脏
HGV
RNA
例数
ALT升高
SB升高
EP-γ球蛋白
<3倍
, 百拇医药 3～5
倍
>5倍
不高
<3倍
3～5
倍
正常
>21%
阳性
9
6
2
1
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7
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8
1
阴性
8
6
1
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讨论
本组17例HGV感染的慢性乙型肝炎患儿，血清抗-HGV均阳性。同期检测肝脏HGV RNA。HGV RNA阳性9例(9/17,53%)。本研究结果说明以下观点。
一、肝脏HGV RNA分布及与肝脏病变的关系
肝脏HGV RNA多分布在汇管区，在肝小叶呈散在分布，多为胞浆型，偶见核型，病变细胞与HGV RNA表达呈负相关，结果示病毒核酸分布与病变活动有一定分离，即肝脏HGV RNA阳性组比阴性组病变轻，HGV RNA表达也与肝脏纤维化分期无关。
二、肝脏HGV RNA与其他HGV指标的关系
肝脏HGV RNA表达与肝脏HGAg分布无相关性(P=0.265)。亦说明两者意义不尽相同。HGV RNA更直接反应HGV在肝脏的复制状况，本组结果表明，肝脏HGV RNA阳性检出(53%)高于HGAg(2/17例,12 %，χ2=5.14，P<0.05)。血清抗-HGV滴度与肝脏HGV RNA表达有正相关性(P=0.013)。本组血清HGV RNA检出5例(5/17例，29%)低于肝脏的检出，但差异无显著性(P>0.05)。推测与例数较少有关。
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三、肝脏HGV RNA与血清生化指标的关系
肝脏HGV RNA表达与血清ALT异常，血清胆红素升高，蛋白电泳γ球蛋白升高均无相关性。以上结果表明，HGV感染即使有一定的致病性，也很弱，对其致病性还需做进一步深入研究。
参考文献
1，Laskus T,Radkowski M,Wang LF,et al.Lack of evidence for hepatitis G virus replication in the liver of patients coinfected with hepatitis C and G viruses.J Viral,1997,71:7804-7806.
2，Medejon A,Fogeda M,Bartolome J,et al.GB virus C RNA in serum, liver and peripheral blood monoclear cells from patients with chronic hepatitis B,C and D.Gastroenterology,1997,113:573- 578.
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3，杨志国,许家璋,陈万荣,等.庚型肝炎肝脏免疫组化研究.中华传染病杂志,1998,16:91-92.
4，Lopez-Alcorocho JM,Millan A,Garcia-Trevijano ER,et al.Detection of hepatitis GB virus type C RNA in serum and liver from children with chronic viral hepatitis B and C.Hepatology,1997,25:1258-1260.
5，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241-242.
(收稿日期：1999-06-23), 百拇医药