兴奋性氨基酸受体拮抗剂对胆红素神经毒性的影响
作者：贲晓明 陈舜年 秦玉明 何振娟 吴圣楣
单位：贲晓明(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院儿科)；陈舜年(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院儿科)；秦玉明(上海市儿科医学研究所)何振娟(上海市儿科医学研究所)；吴圣楣(上海市儿科医学研究所)
关键词：兴奋性氨基酸拮抗剂；腺苷三磷酸；核黄疸
中华儿科杂志000305 【摘要】 目的 探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂磷酸甲基谷氨酰氨酸(GAPA)对胆红素神经毒性的影响。方法 在制作胆红素脑病动物模型基础上予GAPA干预，观察对照组、模型组、模型干预组新生豚鼠(每组10只)干预后4、8 h脑组织超微结构、脑组织ATP含量与含水量。结果 模型组脑组织ATP含量在4、8 h分别为(2.7±0.7) μmol/g与(2.3±0.7) μmol/g，显著低于对照组(4.3±0.6) μmol/g与(4.1±0.6) μmol/g；GAPA干预组脑组织ATP含量在干预后4、8 h分别为(2.6±0.9) μmol/g与(2.5±0.8) μmol/g，显著低于对昭组，但与模型组比较，差异无显著性。胆红素脑病脑组织含水量显著增高，GAPA显著减轻胆红素毒性脑水肿,脑组织超微结构变化亦与此相符。结论 沉积于脑组织胆红素可抑制神经元能量代谢,致脑细胞水肿;兴奋性氨基酸受体拮抗剂GAPA可减轻脑水肿,但不影响能量代谢变化，其作用环节介于能量代谢变化与脑水肿之间。
, 百拇医药
The effect of NMDA receptor antagonist on the bilirubin neurotoxicity
BEN Xiaoming
(Department of Pediatrics， Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
CHEN Shunnian, QIAN Yuming
【Abstract】 Objective To explore the effect of NMDA receptor antagonist glutamyl amino-methyl phosphonic acid (GAPA) on the bilirubin neurotoxicity. Methods On the basis of bilirubin-induced encephalopathy model in guinea-pig, 10 μg/g of GAPA was injected intraperitoneal. After 4 and 8 hours the ATP content in the rat brain tissue was measured with fluorescence assay, and the degree of the brain edema was assessed by wet/dry weight ratios of the brain tissue. The ultrastructure change in the brain tissue was observed as well. Results The brain ATP production in bilirubin induced neurotoxicity guinea-pig decreased within 4 hours after exposure to bilirubin, and secondary brain edema could be found 8 hours later; GAPA could prevent the secondary brain edema effectively ,but could not prevent the ATP decreasing significantly. Conclusion NMDA receptor antagonist GAPA could prevent bilirubin induced brain edema, but could not improve the primary brain ATP decrease.
, 百拇医药
【Key words】 Excitatory amino acid antagonists; Adenosine triphosphate; Kernicterus
新生儿高胆红素血症是新生儿临床常见病症， 并发胆红素脑病可致新生儿死亡,幸存者常留有神经系统后遗症, 合理科学防治胆红素脑病对于优生优育有重要价值。近年来研究表明，兴奋性氨基酸受体过度活化参与介导胆红素脑病的发生[1]。为进一步探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂对其干预作用,我们在既往成功制作胆红素脑病动物模型基础上进行了初步研究[2,3]。
材料和方法
一、实验动物
生后5～7 d豚鼠，重40～50 g,雌雄不拘，购自上海生物制品研究所实验动物中心, 共30只,随机分为3组：对照组、模型组、模型干预组，每组10只。
, http://www.100md.com
二、模型制作
避光称取晶体胆红素 (Sigma 公司) 20 mg溶于1 ml 0.5 mol NaOH中，加入双蒸水9 ml,用0.5 mol HCl调节pH值至8.5,配制胆红素溶液;对照组豚鼠腹腔给予生理盐水0.5 ml,模型组与模型干预组豚鼠腹腔给予胆红素200 μg/g[1，2]。
三、干预程序
取Sigma 公司产磷酸甲基谷氨酰氨酸 (glutamyl amino-methyl phosphonic acid, GAPA) 10 mg溶于1 ml 0.5 mol 的NaOH中，加入双蒸水9 ml,用0.5 mol HCl调节pH值至8.5, 配制GAPA 溶液(1 mg/ml)。造模后4 h,给予对照组与模型组豚鼠腹腔注射生理盐水各0.5 ml, 模型干预组豚鼠腹腔内给予GAPA 10 mg/kg治疗(1 mg/ml 溶液相当于0.5 ml/50 g)[1] 。
, http://www.100md.com
四、疗效观察
干预治疗后4、8 h观察豚鼠变化：
1.脑组织ATP含量: 豚鼠断头取脑，于皮层及脑干区域距正中1 mm处两侧分别取脑组织共4块作病理切片,其余脑组织沿正中切开;一侧称重后置丙酮中漂洗 ，Tris- HCl缓冲液中捣碎, 离心抽提上清液加入荧光素酶-荧光素复合物(上海振生公司产品)，FG 300 型发光光度计测荧光强度,按标准曲线换算样本 ATP 含量[4]。
2.脑组织含水量: 上述另一侧脑组织称重后置80度烘箱烘干至恒重,按(湿重-干重)/湿重 × 100% 计算脑组织含水量。
3.脑组织形态结构:上述4块脑组织,同侧两块立即冰冻切片，光镜下观察;对侧两块置于戊二醛溶液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋,超薄切片，电镜观察。
, 百拇医药
五、统计学处理
方差分析方法，两组间比较用q检验。
结果
一、脑组织ATP含量
模型组脑组织ATP含量在干预后4、8 h均显著低于对照组(P<0.05)；GAPA干预组脑组织ATP含量亦显著低于对照组(P<0.05)，但与模型组比较差异无显著性(PM/T>0.05)(表1)。
表1 各组豚鼠干预后不同时间脑组织ATP含量(
±s) 组别
鼠数
(只)
, http://www.100md.com
脑组织ATP含量(μmol/g)
干预后4 h
干预后8 h
对照组
10
4.3±0.6
4.1±0.6
模型组
10
2.7±0.7*
2.3±0.7*
干预组
, http://www.100md.com
10
2.6±0.9*
2.5±0.8*
F值
3.49
3.51
P值
<0.05
<0.05
注：q检验：*模型组、干预组与对照组比较，P<0.05；模型组与干预组比较，P>0.05
二、脑组织含水量
, http://www.100md.com
模型组脑组织含水量在干预后8 h显著增高(P<0.05)，GAPA干预治疗可显著减轻胆红素毒性脑水肿(P<0.05)(表2)。
表2 各组豚鼠干预后不同时间脑组织含水量(±s，%) 组别
鼠数
(只)
脑组织含水量
干预后4 h
干预后8 h
对照组
10
82±12
, 百拇医药
84±12
模型组
10
86±17
89±17*
干预组
10
85±16
84±16*
F值
3.28
3.42
, http://www.100md.com P值
>0.05
<0.05
注：q检验：*模型组与干预组、对照组比较，P<0.05；对照组与干预组比较，P>0.05
三、脑组织形态结构
1. 脑组织冰冻切片光镜观察显示:GAPA干预后4 h,模型组与干预组豚鼠脑组织可见胆红素沉积;干预后8 h 部分神经元胞体可见胆红素黄染。
2. 脑组织超薄切片电镜观察显示:GAPA干预后8 h,干预组豚鼠神经元及其线粒体肿胀，但与同期模型组比较明显减轻。
讨论
N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate, NMDA)受体是中枢神经系统兴奋性氨基酸受体亚类,谷氨酸是NMDA受体的内源性配基。谷氨酸活化NMDA 受体可开放受体联结离子通道，Na+、Ca2+内流，细胞去极化。在脑能量代谢障碍、ATP 贮备耗竭时，谷氨酸神经递质代谢转运障碍和在神经组织聚集，NMDA受体过度活化致神经细胞Na+、Ca2+超载是神经细胞损伤重要机制。在同种病理状态下,NMDA受体拮抗剂与Ca2+通道拮抗剂已成为其干预治疗的重要措施[5]。
, http://www.100md.com
新生儿时期，由于胆红素产生较多, 肝脏对胆红素摄取与转化能力较低,加之胆红素肠肝循环,易发生新生儿高胆红素血症;在病理状态下，由于胆红素白蛋白结合度降低，血浆游离胆红素增多,过量胆红素可通过开放的血脑屏障沉积于脑组织,致神经细胞毒性损伤。胆红素对神经细胞毒性作用机制与线粒体生物氧化抑制、ATP 储备降低有关。1989年Palmer等用核磁共振在体检测与高效液相色谱离体检测胆红素毒性脑组织能量代谢水平，显示ATP贮备耗竭，由此提出NMDA 受体过度活化参与介导胆红素脑病发生的设想。1990年John 等通过显微图像定量分析系统，观察外源性NMDA 对胆红素毒性脑组织损伤作用,显示NMDA 损伤易感性，初步证实NMDA受体过度活化参与介导胆红素脑病的发生[3]。
为进一步明确NMDA受体活性在胆红素神经毒性发生中的作用,并探讨干预治疗措施,我们采用GAPA作为竞争性配体,观察NMDA受体拮抗剂对胆红素神经毒性的影响, 结果显示:胆红素脑病模型组与干预组脑组织ATP 含量均显著低于对照组(P<0.05),而模型组与干预组之间脑组织 ATP含量差异无显著性(P>0.05)。上述结果表明:胆红素沉积于脑组织可抑制神经元能量代谢,而这种毒性作用并不受NMDA受体拮抗剂的干预影响。此外，本研究结果显示:胆红素脑病模型组脑组织含水量在干预后8 h显著高于对照组(P<0.05),同时干预组脑组织含水量在干预后8 h与模型组比较明显降低，差异有显著性(P<0.05),且组织超微结构变化亦与此相符,而干预后4 h脑组织含水量变化无显著性。提示胆红素神经毒性时间依赖性,脑组织含水量变化落后于脑组织能量代谢的变化,NMDA受体拮抗剂对胆红素神经毒性的影响与阻碍脑水肿的发生相关,其环节在于能量代谢变化与脑水肿之间。因此,我们究认为:沉积于脑组织的胆红素可抑制神经元能量代谢,继而导致脑细胞水肿;NMDA受体拮抗剂GAPA 对胆红素神经毒性的影响，在于阻碍继发性脑水肿的发生。
, http://www.100md.com
基金项目：上海科学技术发展基金项目 (954119025)
参考文献
1，Mcdonald JW, Shapiro SM, Silverstein FS, et al. Excitatory amino acid neurotransmitter systems contribute to the pathophysiology of bilirubin encephalopathy. Ann Neurol, 1990, 28: 413.
2，陈舜年，贲晓明，夏振伟. 胆红素脑病动物模型制作与鉴定. 新生儿科杂志， 1997, 12 ：166-169.
3，Wennberg RP, Hance AJ. Experimental bilirubin encephalopathy. Pediatr Res, 1986, 20: 789-792.
, 百拇医药
4，Wennberg RP, Johanson BB, Folbrearova J, et al. Bilirubin induced changes in brain energy metabolism after osmotic opening of the blood brain barrier. Pediatr Res, 1991， 30: 473-478.
5，Clark GD. Role of excitatory amino acids in brain injury caused by hypoxic -ischemia, status epilepticus, and hypoglycemia. Clin Perinatol， 1989, 16: 459-474.
(收稿日期：1999-03-24), http://www.100md.com
单位：贲晓明(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院儿科)；陈舜年(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院儿科)；秦玉明(上海市儿科医学研究所)何振娟(上海市儿科医学研究所)；吴圣楣(上海市儿科医学研究所)
关键词：兴奋性氨基酸拮抗剂；腺苷三磷酸；核黄疸
中华儿科杂志000305 【摘要】 目的 探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂磷酸甲基谷氨酰氨酸(GAPA)对胆红素神经毒性的影响。方法 在制作胆红素脑病动物模型基础上予GAPA干预，观察对照组、模型组、模型干预组新生豚鼠(每组10只)干预后4、8 h脑组织超微结构、脑组织ATP含量与含水量。结果 模型组脑组织ATP含量在4、8 h分别为(2.7±0.7) μmol/g与(2.3±0.7) μmol/g，显著低于对照组(4.3±0.6) μmol/g与(4.1±0.6) μmol/g；GAPA干预组脑组织ATP含量在干预后4、8 h分别为(2.6±0.9) μmol/g与(2.5±0.8) μmol/g，显著低于对昭组，但与模型组比较，差异无显著性。胆红素脑病脑组织含水量显著增高，GAPA显著减轻胆红素毒性脑水肿,脑组织超微结构变化亦与此相符。结论 沉积于脑组织胆红素可抑制神经元能量代谢,致脑细胞水肿;兴奋性氨基酸受体拮抗剂GAPA可减轻脑水肿,但不影响能量代谢变化，其作用环节介于能量代谢变化与脑水肿之间。
, 百拇医药
The effect of NMDA receptor antagonist on the bilirubin neurotoxicity
BEN Xiaoming
(Department of Pediatrics， Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
CHEN Shunnian, QIAN Yuming
【Abstract】 Objective To explore the effect of NMDA receptor antagonist glutamyl amino-methyl phosphonic acid (GAPA) on the bilirubin neurotoxicity. Methods On the basis of bilirubin-induced encephalopathy model in guinea-pig, 10 μg/g of GAPA was injected intraperitoneal. After 4 and 8 hours the ATP content in the rat brain tissue was measured with fluorescence assay, and the degree of the brain edema was assessed by wet/dry weight ratios of the brain tissue. The ultrastructure change in the brain tissue was observed as well. Results The brain ATP production in bilirubin induced neurotoxicity guinea-pig decreased within 4 hours after exposure to bilirubin, and secondary brain edema could be found 8 hours later; GAPA could prevent the secondary brain edema effectively ,but could not prevent the ATP decreasing significantly. Conclusion NMDA receptor antagonist GAPA could prevent bilirubin induced brain edema, but could not improve the primary brain ATP decrease.
, 百拇医药
【Key words】 Excitatory amino acid antagonists; Adenosine triphosphate; Kernicterus
新生儿高胆红素血症是新生儿临床常见病症， 并发胆红素脑病可致新生儿死亡,幸存者常留有神经系统后遗症, 合理科学防治胆红素脑病对于优生优育有重要价值。近年来研究表明，兴奋性氨基酸受体过度活化参与介导胆红素脑病的发生[1]。为进一步探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂对其干预作用,我们在既往成功制作胆红素脑病动物模型基础上进行了初步研究[2,3]。
材料和方法
一、实验动物
生后5～7 d豚鼠，重40～50 g,雌雄不拘，购自上海生物制品研究所实验动物中心, 共30只,随机分为3组：对照组、模型组、模型干预组，每组10只。
, http://www.100md.com
二、模型制作
避光称取晶体胆红素 (Sigma 公司) 20 mg溶于1 ml 0.5 mol NaOH中，加入双蒸水9 ml,用0.5 mol HCl调节pH值至8.5,配制胆红素溶液;对照组豚鼠腹腔给予生理盐水0.5 ml,模型组与模型干预组豚鼠腹腔给予胆红素200 μg/g[1，2]。
三、干预程序
取Sigma 公司产磷酸甲基谷氨酰氨酸 (glutamyl amino-methyl phosphonic acid, GAPA) 10 mg溶于1 ml 0.5 mol 的NaOH中，加入双蒸水9 ml,用0.5 mol HCl调节pH值至8.5, 配制GAPA 溶液(1 mg/ml)。造模后4 h,给予对照组与模型组豚鼠腹腔注射生理盐水各0.5 ml, 模型干预组豚鼠腹腔内给予GAPA 10 mg/kg治疗(1 mg/ml 溶液相当于0.5 ml/50 g)[1] 。
, http://www.100md.com
四、疗效观察
干预治疗后4、8 h观察豚鼠变化：
1.脑组织ATP含量: 豚鼠断头取脑，于皮层及脑干区域距正中1 mm处两侧分别取脑组织共4块作病理切片,其余脑组织沿正中切开;一侧称重后置丙酮中漂洗 ，Tris- HCl缓冲液中捣碎, 离心抽提上清液加入荧光素酶-荧光素复合物(上海振生公司产品)，FG 300 型发光光度计测荧光强度,按标准曲线换算样本 ATP 含量[4]。
2.脑组织含水量: 上述另一侧脑组织称重后置80度烘箱烘干至恒重,按(湿重-干重)/湿重 × 100% 计算脑组织含水量。
3.脑组织形态结构:上述4块脑组织,同侧两块立即冰冻切片，光镜下观察;对侧两块置于戊二醛溶液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋,超薄切片，电镜观察。
, 百拇医药
五、统计学处理
方差分析方法，两组间比较用q检验。
结果
一、脑组织ATP含量
模型组脑组织ATP含量在干预后4、8 h均显著低于对照组(P<0.05)；GAPA干预组脑组织ATP含量亦显著低于对照组(P<0.05)，但与模型组比较差异无显著性(PM/T>0.05)(表1)。
表1 各组豚鼠干预后不同时间脑组织ATP含量(
±s) 组别鼠数
(只)
, http://www.100md.com
脑组织ATP含量(μmol/g)
干预后4 h
干预后8 h
对照组
10
4.3±0.6
4.1±0.6
模型组
10
2.7±0.7*
2.3±0.7*
干预组
, http://www.100md.com
10
2.6±0.9*
2.5±0.8*
F值
3.49
3.51
P值
<0.05
<0.05
注：q检验：*模型组、干预组与对照组比较，P<0.05；模型组与干预组比较，P>0.05
二、脑组织含水量
, http://www.100md.com
模型组脑组织含水量在干预后8 h显著增高(P<0.05)，GAPA干预治疗可显著减轻胆红素毒性脑水肿(P<0.05)(表2)。
表2 各组豚鼠干预后不同时间脑组织含水量(
±s，%) 组别鼠数
(只)
脑组织含水量
干预后4 h
干预后8 h
对照组
10
82±12
, 百拇医药
84±12
模型组
10
86±17
89±17*
干预组
10
85±16
84±16*
F值
3.28
3.42
, http://www.100md.com P值
>0.05
<0.05
注：q检验：*模型组与干预组、对照组比较，P<0.05；对照组与干预组比较，P>0.05
三、脑组织形态结构
1. 脑组织冰冻切片光镜观察显示:GAPA干预后4 h,模型组与干预组豚鼠脑组织可见胆红素沉积;干预后8 h 部分神经元胞体可见胆红素黄染。
2. 脑组织超薄切片电镜观察显示:GAPA干预后8 h,干预组豚鼠神经元及其线粒体肿胀，但与同期模型组比较明显减轻。
讨论
N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate, NMDA)受体是中枢神经系统兴奋性氨基酸受体亚类,谷氨酸是NMDA受体的内源性配基。谷氨酸活化NMDA 受体可开放受体联结离子通道，Na+、Ca2+内流，细胞去极化。在脑能量代谢障碍、ATP 贮备耗竭时，谷氨酸神经递质代谢转运障碍和在神经组织聚集，NMDA受体过度活化致神经细胞Na+、Ca2+超载是神经细胞损伤重要机制。在同种病理状态下,NMDA受体拮抗剂与Ca2+通道拮抗剂已成为其干预治疗的重要措施[5]。
, http://www.100md.com
新生儿时期，由于胆红素产生较多, 肝脏对胆红素摄取与转化能力较低,加之胆红素肠肝循环,易发生新生儿高胆红素血症;在病理状态下，由于胆红素白蛋白结合度降低，血浆游离胆红素增多,过量胆红素可通过开放的血脑屏障沉积于脑组织,致神经细胞毒性损伤。胆红素对神经细胞毒性作用机制与线粒体生物氧化抑制、ATP 储备降低有关。1989年Palmer等用核磁共振在体检测与高效液相色谱离体检测胆红素毒性脑组织能量代谢水平，显示ATP贮备耗竭，由此提出NMDA 受体过度活化参与介导胆红素脑病发生的设想。1990年John 等通过显微图像定量分析系统，观察外源性NMDA 对胆红素毒性脑组织损伤作用,显示NMDA 损伤易感性，初步证实NMDA受体过度活化参与介导胆红素脑病的发生[3]。
为进一步明确NMDA受体活性在胆红素神经毒性发生中的作用,并探讨干预治疗措施,我们采用GAPA作为竞争性配体,观察NMDA受体拮抗剂对胆红素神经毒性的影响, 结果显示:胆红素脑病模型组与干预组脑组织ATP 含量均显著低于对照组(P<0.05),而模型组与干预组之间脑组织 ATP含量差异无显著性(P>0.05)。上述结果表明:胆红素沉积于脑组织可抑制神经元能量代谢,而这种毒性作用并不受NMDA受体拮抗剂的干预影响。此外，本研究结果显示:胆红素脑病模型组脑组织含水量在干预后8 h显著高于对照组(P<0.05),同时干预组脑组织含水量在干预后8 h与模型组比较明显降低，差异有显著性(P<0.05),且组织超微结构变化亦与此相符,而干预后4 h脑组织含水量变化无显著性。提示胆红素神经毒性时间依赖性,脑组织含水量变化落后于脑组织能量代谢的变化,NMDA受体拮抗剂对胆红素神经毒性的影响与阻碍脑水肿的发生相关,其环节在于能量代谢变化与脑水肿之间。因此,我们究认为:沉积于脑组织的胆红素可抑制神经元能量代谢,继而导致脑细胞水肿;NMDA受体拮抗剂GAPA 对胆红素神经毒性的影响，在于阻碍继发性脑水肿的发生。
, http://www.100md.com
基金项目：上海科学技术发展基金项目 (954119025)
参考文献
1，Mcdonald JW, Shapiro SM, Silverstein FS, et al. Excitatory amino acid neurotransmitter systems contribute to the pathophysiology of bilirubin encephalopathy. Ann Neurol, 1990, 28: 413.
2，陈舜年，贲晓明，夏振伟. 胆红素脑病动物模型制作与鉴定. 新生儿科杂志， 1997, 12 ：166-169.
3，Wennberg RP, Hance AJ. Experimental bilirubin encephalopathy. Pediatr Res, 1986, 20: 789-792.
, 百拇医药
4，Wennberg RP, Johanson BB, Folbrearova J, et al. Bilirubin induced changes in brain energy metabolism after osmotic opening of the blood brain barrier. Pediatr Res, 1991， 30: 473-478.
5，Clark GD. Role of excitatory amino acids in brain injury caused by hypoxic -ischemia, status epilepticus, and hypoglycemia. Clin Perinatol， 1989, 16: 459-474.
(收稿日期：1999-03-24), http://www.100md.com