体外培养星形胶质细胞缺氧再给氧后热休克蛋白70的表达
作者：熊晖 梁卫兰 母得志 吴希如
单位：熊晖(100034 北京医科大学第一医院儿科)；梁卫兰(100034 北京医科大学第一医院儿科)；母得志(100034 北京医科大学第一医院儿科)；吴希如(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：星形细胞；细胞低氧；热休克蛋白质类70；基因表达；小鼠
中华儿科杂志000413 【摘要】 目的 探讨体外培养星形胶质细胞缺氧再给氧后热休克蛋白70(HSP70)表达的变化特点及其所起的作用。方法 取生后1～2 d的新生昆明小鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养，培养2周左右进行缺氧实验。缺氧时间分别为0、3、6、12、24、48 h，并取缺氧24 h后再给氧0、3、6、12、24、48 h的星形胶质细胞进行细胞免疫组化、原位杂交，观察HSP70表达的变化。结果 原位杂交显示缺氧3 h即有HSP70 mRNA的表达， 6 h达高峰，12 h仍较明显，24 h后逐渐下降，48 h表达显著降低，但仍高于对照组(即缺氧0小时组)。而用免疫组化方法在缺氧后仅能检出少量阳性的HSP70核蛋白。缺氧24 h后再给氧也有HSP70 mRNA的表达，于再给氧6 h达高峰，12 h逐渐下降，同时免疫组化可见应激蛋白HSP70的检出，为核内表达，于再给氧12 h达高峰。结论 缺氧可引起HSP70 mRNA的表达增强，直至随后再给氧时才有应激蛋白HSP70的合成，HSP70可能对于星形胶质细胞缺氧再给氧引起的损伤具有保护作用。
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The expression of heat shock protein 70 in cultured mouse astrocytes after hypoxia/reoxygenation
XIONG Hui, LIANG Weilan, MU Dezhi
(Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of heat shock protein 70(HSP70) mRNA and the immunoreactivity in cultured mouse astrocytes after exposure to hypoxia/reoxygenation. Methods Mouse cerebral cortical astrocytes from 1-2 days newborn Kunming mice were undergone the pure culture and exposed to hypoxia. The duration of hypoxia was 3, 6, 12, 24 and 48 hours. After 24 hours hypoxia, the reoxygenation time was 0, 3, 6, 12, 24 and 48 hours. The expressions of HSP70 mRNA and HSP70 protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemiscal methods, respectively. Results The HSP70 mRNA expression was shown by in situ hybridization 3 hours after hypoxia, and the expression of HSP70 mRNA increased with lengthening hypoxic time. The peak time of the HSP70 mRNA expression was 6 hours. There was no HSP70 mRNA expression in controls. The expression of HSP70 protein could hardly be detected after hypoxic. After the treatment of reoxygenation in astrocytes, the expression of HSP70 mRNA could be detected, and the expression of HSP70 protein could also be detected. Conclusion Although the hypoxia could induce the expression of HSP70 mRNA, the synthesis of HSP70 protein could only be observed after reoxygenation. It is possible that HSP70 might play a protective role in hypoxia/reoxygenation of astrocytes.
, 百拇医药
【Key words】 Astrocytes; Cell hypoxia; Heat-shock proteins 70; Gene expression; Mice
围生期缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的研究焦点集中在神经元上，但是星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中数量最多的细胞类型，它们在HIBD中的改变是CNS中最早和最显著的。有文献报道，星形胶质细胞在缺氧及再给氧后蛋白合成增加，并有报道其在热休克及酸中毒后有热休克蛋白70(HSP70)的强烈表达[1]。分析缺氧后星形胶质细胞内诱导的应激蛋白有助于了解星形胶质细胞在缺氧缺血时存活的机制。本研究旨在探讨缺氧再给氧后星形胶质细胞内HSP70表达的变化。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
动物：昆明小鼠由北京医科大学实验动物部提供。试剂：鼠源抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体，HSP70抗体：抗诱导型HSP70(HSP72)及基础型HSP70 (HSP73)，免疫组化试剂盒(中山生物制品公司)；诱导型HSP70寡核苷酸探针：5′-CGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCACCA-TGG-3′ (美国Cybersyng公司)；地高辛DNA标记和检测试剂盒(Boehringer mannhein公司)。
二、方法
1.新生昆明小鼠大脑皮层星形胶质细胞纯培养及鉴定：基本按照梁卫兰等[2]及 Chao等[3] 的方法进行。每次取6只生后1～2 d的新生鼠行星形胶质细胞培养，共培养12次。星形胶质细胞鉴定采用间接免疫荧光法，一抗为GFAP抗体。荧光显微镜下观察，以490 nm波长的激发光观察异硫酸酯荧光素(fluorescin isothiocyanate, FITC)所标示部位，阳性者即为星形胶质细胞。免疫荧光显示星形胶质细胞阳性率为99%左右(图1)。
, 百拇医药
2.缺氧模型的建立及实验分组：将细胞培养皿置于含体积分数为5%CO2和体积分数为95%N2的有机玻璃通气槽内，并维持一定湿度，密封。此槽置于37℃温箱内[4](培养液成分无变化)。通气稳定后及取出细胞前均测定槽内氧浓度，使其保持稳定。缺氧组于缺氧一定时间后立即取出进行实验，再给氧组于缺氧后立即更换培养液，然后置CO2培养箱(体积分数为5%～8%，湿度为100%)内继续培养。实验分组：对照组(即缺氧0 h组)、缺氧组(根据缺氧时间不同分为3、6、12、24、48 h组)、缺氧后再给氧组(缺氧24 h后根据再给氧时间不同分为0、3、6、12、24、48 h组)。观察指标为HSP70 mRNA的表达和应激蛋白HSP70的表达。
3.原位杂交:每次取出2.75 μg诱导型HSP70 寡核苷酸探针，按试剂盒要求进行探针标记。杂交前各细胞爬片经梯度乙醇处理，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤后，依次加入0.5% Triton X-100及蛋白酶K处理，PBS洗涤。用0.25%乙酸酐和0.1 mol/L的三乙醇胺平衡电荷后，再用含乙酸胺的梯度乙醇脱水。晾干后每片滴加杂交液10～15 μl，于湿盒内，42℃反应24 h。用系列标准柠檬酸盐-氯化钠(SSC)洗涤阻断反应后，加入抗地高辛抗体，37℃保温1 h，用检测缓冲液洗涤并平衡，在碱性磷酸酶显色体系中，室温显色，光镜下观察，以深蓝色沉淀为杂交阳性信号。
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4.免疫组化:细胞爬片经1%牛血清白蛋白封闭，1% Triton X-100处理后，加入1∶50 的鼠源抗HSP70单克隆抗体，4℃过夜。PBS洗3遍，加入1∶100的生物素标记的马抗鼠二抗，常温1 h，PBS洗涤，加入1∶200的卵白链霉素辣根过氧化物酶(HRP),常温下1 h，0.02% 的二氨基苯联胺(DAB) (0.03% H2O2,0.05 mol/L Tris HCl, pH 7.4)显色5～10 min，以胞核黄染为阳性细胞。
5.数据处理及统计学检验:原位杂交、免疫组化结果，在显微镜下经图像分析系统进行密度扫描，测得每个视野内平均吸光度A值(曾称光密度，OD)，或经扫描后得出单位面积中的阳性信号(μm2)，再进行比较。应用SPSS统计软件处理，计量资料用均值±标准差(
±s)表示，采用随机区组方差分析，当差异有显著意义时，行两两q检验， P<0.05为显著界值。
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结果
一、缺氧再给氧后HSP70 mRNA的表达
细胞爬片原位杂交结果显示，缺氧3 h HSP70 mRNA的表达增加，杂交阳性信号主要分布在核上，缺氧6 h达高峰(图2)，与对照组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，12 h仍较明显， 24 h后逐渐下降，48 h表达显著降低，但仍高于对照组(P<0.01)。对照组未见杂交阳性信号(表1)。星形胶质细胞缺氧24 h后再给氧3 h HSP70 mRNA的表达亦有增加，杂交阳性信号主要分布在核上，并随再给氧时间延长而表达增强，至再给氧6 h达高峰(P<0.01)，12 h后逐渐下降(表1)。
表1 缺氧及再给氧后各组星形胶质细胞内HSP70
表达的动态变化(±s)(n=12) 组别及试验时间
, 百拇医药
HSP70
mRNA表达(μm2)
应激蛋白
HSP70表达(A)
缺氧组
缺氧时间(h)
0(对照组)
28±5
0.142±0.007
3
57±14*
0.147±0.008
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6
114±30*
0.148±0.008
12
101±24*
0.148±0.009
24
56±13*
0.147±0.008
48
41±11*
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0.140±0.006
缺氧24 h再给氧组
再给氧时间(h)
0
52±8
0.145±0.007
3
69±10*
0.163±0.008**
6
105±26*
, 百拇医药 0.173±0.008**
12
81+12
0.206±0.007*
24
61±6*
0.178±0.010**
48
34±6
0.165±0.012**
注：与各组0 小时比较：* P<0.01，** P<0.05； A：吸光度值 二、缺氧再给氧后HSP70的表达
, 百拇医药
免疫组化结果显示，对照组细胞爬片可见少量HSP70表达，其余各缺氧组无明显变化，仅能检出少量HSP70染色阳性的细胞，与对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)。而再给氧不同时间组HSP70表达增加，于再给氧3 h表达即开始增加，与对照组相比，差异有显著意义(P<0.05)。随再给氧时间延长表达渐增强，再给氧12 h达高峰(P<0.01)(图3)，24 h后逐渐下降，至48 h仍高于对照组(P<0.05)。
讨论
我们既往的实验[5，6]证实了体外培养的星形胶质细胞较神经元更能耐受缺氧损伤。本研究选择众多传递信号中的一种(HSP70)，作为抵抗损伤的分子标记物，来探讨体外培养的新生小鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧损伤即刻及随后再给氧时HSP70表达的变化及其可能的作用。已证实热诱导下CNS中HSP70 mRNA的表达程度，小脑高于大脑胶质细胞、高于神经元[7]，而且星形胶质细胞HSP70 mRNA的体外表达较体内强烈。有学者认为，严重缺血时星形胶质细胞可合成HSP70，而且体外培养较体内培养的星形胶质细胞更易诱导HSP70的合成。而另一些学者发现，单纯缺氧条件下培养的星形胶质细胞也存在HSP78、94和HSP150等的合成。
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本实验结果表明，用免疫组化法于正常对照组中可检测到少量HSP70蛋白，而在缺氧3～48 h内仅能检测出少量HSP70，与对照组相比差异无显著意义。再给氧时存在HSP70的表达，与对照组相比，差异有显著意义，且随再给氧时间延长而表达增强，再给氧12 h达高峰(P<0.01)，但不是所有的细胞均为免疫阳性细胞。HSP70包括HSP72和HSP73，本实验使用的HSP70单抗既抗HSP72又抗HSP73，因此对照组中检测到的HSP70主要是HSP73，而缺氧组中的是HSP72还是HSP73，须进一步用抗HSP72和HSP73的抗体加以鉴别。也有文献报道，体外培养星形胶质细胞缺氧后可诱导其他热休克蛋白表达，而无HSP70产生。本实验结果也表明缺氧后培养的星形胶质细胞内无HSP70的合成，但却发现有HSP70 mRNA的表达，是否因为其他热休克蛋白的产生抑制或拮抗了HSP70的翻译合成？原位杂交结果显示再给氧后3 h即有HSP70 mRNA的表达，6 h达高峰，12 h逐渐下降，与单纯缺氧组相比，其表达时间短、程度轻，也呈现一个先上升后下降的过程。这提示缺氧再给氧时星形胶质细胞内HSP70合成主要与HSP70基因翻译合成增加有关。缺氧再给氧后谷氨酸摄取功能下降导致兴奋性氨基酸在细胞间质堆积，加重神经元的损伤并且可能诱导HSP70基因表达，而谷氨酰胺更是HSP70的强诱导剂。再给氧时氧自由基产生增加也可能是诱导HSP70表达的因素之一。因此，缺氧再给氧时氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸等活性物质的伴随改变，可能是星形胶质细胞产生的HSP70保护作用在单纯缺氧时与缺氧再给氧时反应不同的原因。另外，再给氧时能量代谢破坏，激活HSP70启动子，诱导HSP70表达[8]。文献报道在严重缺氧缺血损伤后长期存活的患儿脑内的CA2、CA3和CA4区有HSP70的表达。Imuta等[8]发现缺氧再给氧后星形胶质细胞内存在HSP70 mRNA和蛋白的表达，且对其具有保护作用，使其适应再给氧。再给氧对于机体非常重要，它类似于缺血后再灌注，代表另一类型的损伤，即迟发性损伤。因此，研究星形胶质细胞在缺氧和再给氧两种应激状态下的反应，对认识星形胶质细胞在缺氧缺血性脑损伤中所起的作用是很重要的。
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我们还观察到，再给氧时并不是所有的细胞均为HSP70免疫阳性细胞，是否表达HSP70的为反应性星形胶质细胞，其功能下降不明显，而无表达的细胞没有被活化，其功能有可能有所下降，也有待于进一步探讨。已证实具有HSP70免疫活性的细胞其HSP70在细胞中的定位体内与体外不同，有的发现为核染，有的发现核浆均可见。本组结果显示，HSP72 mRNA表达主要分布于核上，HSP70蛋白也主要为核表达。由于HSP70在神经元中转运很慢，需胶质细胞将HSP70转移入神经元轴突而发挥生理功能。缺氧缺血时，HSP70消耗殆尽，对神经元的保护作用消失，神经元兴奋性增高而易发生损伤。也有研究认为，神经元不合成HSP70，HSP70在星形胶质细胞内合成，然后被转运至神经元轴索，有学者观察发现星形胶质细胞内HSP70定位在神经元-星形胶质细胞混合培养中，比在纯星形胶质细胞培养中更为胞浆化[7]。
本研究结果表明，缺氧及随后的再给氧可引起星形胶质细胞内HSP70 mRNA的表达增强，但直至再给氧才有HSP70蛋白的表达，它可能对于缺氧再给氧引起的星形胶质细胞损伤具有保护作用。再给氧时星形胶质细胞内肯定会产生一些不利的因素，但其本身也发生了一些与神经元不同的变化，如合成神经营养因子、IL-6、HSP70等，使其能够存活。星形胶质细胞的功能是保持CNS微环境稳定及促进损伤后的修复和再生。但是，缺氧损伤后的反应性星形胶质细胞增生是利是弊还存在争论。因此，进一步研究缺氧再给氧条件下神经元HSP70表达的变化及其与星形胶质细胞之间的关系，并深入研究及认识脑内尤其是发育中脑内星形胶质细胞在维持正常脑功能中的重要性及其作用机制，探索其在缺氧缺血性脑损伤中的有利和不利反应以及与之相关的因素，就可以为今后研究在脑损伤发生发展过程中适时给予干预措施，抑制不利反应，促进有利方面等，提供更多的实验依据。
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图1 星形胶质细胞鉴定(间接免疫荧光法 光镜 ×200)
图2 缺氧6 h星形胶质细胞内HSP70 mRNA表达(原位杂交法 光镜 ×250)
图3 缺氧24 h后再给氧 12 h星形胶质细胞内
HSP70蛋白的表达(免疫组化法 光镜 ×250)
基金项目：“九五”国家医学科技攻关项目基金资助项目(96-904-06-04)
参考文献
1.Narasimhan P, Swanson RA, Sagar SM, et al. Astrocyte survival and HSP70 heat shock protein induction following heat shock and acidosis. Glia, 1996, 17:147-159.
, 百拇医药
2.梁卫兰, 单巍松, 吴希如. 大鼠(小鼠)大脑皮层星形胶质细胞培养方法. 北京医科大学学报, 1994, 26:320.
3.Chao CC, Hu SX, Sheng WS, et al. Cytokine-stimulated astrocytes damage human neurous via a nitric oxide mechanism. Glia, 1996, 16:276-284.
4.Rosenbaum D, Michaelson M, Batter DK, et al. Evidence for hypoxia-induced programmed cell death of cultured neurons. Ann Neurol, 1994, 36:864-870.
5.熊晖, 梁卫兰, 吴希如. 体外培养星形胶质细胞缺氧/再给氧后谷氨酸摄取功能的变化. 北京医科大学学报, 1999, 31:137-140.
, 百拇医药
6.梁卫兰, 吴希如. N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂在缺氧性神经细胞损伤中的作用. 北京医科大学学报, 1998, 30:467-469.
7.Voisin PJ, Pardue S, Macouillard F, et al. Differential expression of heat shock 70 proteins in primary cultures from rat cerebellum. Brain Res, 1996, 739:215-234.
8.Imuta N, Ogawa S, Maeda Y, et al. Induction of 72-kDa inducible heat shock protein(HSP72) in cultured rat astrocytes after energy depletion. J Neurochem, 1998, 70:550-557.
(收稿日期：1999-08-25), 百拇医药
单位：熊晖(100034 北京医科大学第一医院儿科)；梁卫兰(100034 北京医科大学第一医院儿科)；母得志(100034 北京医科大学第一医院儿科)；吴希如(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：星形细胞；细胞低氧；热休克蛋白质类70；基因表达；小鼠
中华儿科杂志000413 【摘要】 目的 探讨体外培养星形胶质细胞缺氧再给氧后热休克蛋白70(HSP70)表达的变化特点及其所起的作用。方法 取生后1～2 d的新生昆明小鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养，培养2周左右进行缺氧实验。缺氧时间分别为0、3、6、12、24、48 h，并取缺氧24 h后再给氧0、3、6、12、24、48 h的星形胶质细胞进行细胞免疫组化、原位杂交，观察HSP70表达的变化。结果 原位杂交显示缺氧3 h即有HSP70 mRNA的表达， 6 h达高峰，12 h仍较明显，24 h后逐渐下降，48 h表达显著降低，但仍高于对照组(即缺氧0小时组)。而用免疫组化方法在缺氧后仅能检出少量阳性的HSP70核蛋白。缺氧24 h后再给氧也有HSP70 mRNA的表达，于再给氧6 h达高峰，12 h逐渐下降，同时免疫组化可见应激蛋白HSP70的检出，为核内表达，于再给氧12 h达高峰。结论 缺氧可引起HSP70 mRNA的表达增强，直至随后再给氧时才有应激蛋白HSP70的合成，HSP70可能对于星形胶质细胞缺氧再给氧引起的损伤具有保护作用。
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The expression of heat shock protein 70 in cultured mouse astrocytes after hypoxia/reoxygenation
XIONG Hui, LIANG Weilan, MU Dezhi
(Department of Pediatrics, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of heat shock protein 70(HSP70) mRNA and the immunoreactivity in cultured mouse astrocytes after exposure to hypoxia/reoxygenation. Methods Mouse cerebral cortical astrocytes from 1-2 days newborn Kunming mice were undergone the pure culture and exposed to hypoxia. The duration of hypoxia was 3, 6, 12, 24 and 48 hours. After 24 hours hypoxia, the reoxygenation time was 0, 3, 6, 12, 24 and 48 hours. The expressions of HSP70 mRNA and HSP70 protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemiscal methods, respectively. Results The HSP70 mRNA expression was shown by in situ hybridization 3 hours after hypoxia, and the expression of HSP70 mRNA increased with lengthening hypoxic time. The peak time of the HSP70 mRNA expression was 6 hours. There was no HSP70 mRNA expression in controls. The expression of HSP70 protein could hardly be detected after hypoxic. After the treatment of reoxygenation in astrocytes, the expression of HSP70 mRNA could be detected, and the expression of HSP70 protein could also be detected. Conclusion Although the hypoxia could induce the expression of HSP70 mRNA, the synthesis of HSP70 protein could only be observed after reoxygenation. It is possible that HSP70 might play a protective role in hypoxia/reoxygenation of astrocytes.
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【Key words】 Astrocytes; Cell hypoxia; Heat-shock proteins 70; Gene expression; Mice
围生期缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的研究焦点集中在神经元上，但是星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中数量最多的细胞类型，它们在HIBD中的改变是CNS中最早和最显著的。有文献报道，星形胶质细胞在缺氧及再给氧后蛋白合成增加，并有报道其在热休克及酸中毒后有热休克蛋白70(HSP70)的强烈表达[1]。分析缺氧后星形胶质细胞内诱导的应激蛋白有助于了解星形胶质细胞在缺氧缺血时存活的机制。本研究旨在探讨缺氧再给氧后星形胶质细胞内HSP70表达的变化。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
动物：昆明小鼠由北京医科大学实验动物部提供。试剂：鼠源抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体，HSP70抗体：抗诱导型HSP70(HSP72)及基础型HSP70 (HSP73)，免疫组化试剂盒(中山生物制品公司)；诱导型HSP70寡核苷酸探针：5′-CGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCACCA-TGG-3′ (美国Cybersyng公司)；地高辛DNA标记和检测试剂盒(Boehringer mannhein公司)。
二、方法
1.新生昆明小鼠大脑皮层星形胶质细胞纯培养及鉴定：基本按照梁卫兰等[2]及 Chao等[3] 的方法进行。每次取6只生后1～2 d的新生鼠行星形胶质细胞培养，共培养12次。星形胶质细胞鉴定采用间接免疫荧光法，一抗为GFAP抗体。荧光显微镜下观察，以490 nm波长的激发光观察异硫酸酯荧光素(fluorescin isothiocyanate, FITC)所标示部位，阳性者即为星形胶质细胞。免疫荧光显示星形胶质细胞阳性率为99%左右(图1)。
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2.缺氧模型的建立及实验分组：将细胞培养皿置于含体积分数为5%CO2和体积分数为95%N2的有机玻璃通气槽内，并维持一定湿度，密封。此槽置于37℃温箱内[4](培养液成分无变化)。通气稳定后及取出细胞前均测定槽内氧浓度，使其保持稳定。缺氧组于缺氧一定时间后立即取出进行实验，再给氧组于缺氧后立即更换培养液，然后置CO2培养箱(体积分数为5%～8%，湿度为100%)内继续培养。实验分组：对照组(即缺氧0 h组)、缺氧组(根据缺氧时间不同分为3、6、12、24、48 h组)、缺氧后再给氧组(缺氧24 h后根据再给氧时间不同分为0、3、6、12、24、48 h组)。观察指标为HSP70 mRNA的表达和应激蛋白HSP70的表达。
3.原位杂交:每次取出2.75 μg诱导型HSP70 寡核苷酸探针，按试剂盒要求进行探针标记。杂交前各细胞爬片经梯度乙醇处理，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤后，依次加入0.5% Triton X-100及蛋白酶K处理，PBS洗涤。用0.25%乙酸酐和0.1 mol/L的三乙醇胺平衡电荷后，再用含乙酸胺的梯度乙醇脱水。晾干后每片滴加杂交液10～15 μl，于湿盒内，42℃反应24 h。用系列标准柠檬酸盐-氯化钠(SSC)洗涤阻断反应后，加入抗地高辛抗体，37℃保温1 h，用检测缓冲液洗涤并平衡，在碱性磷酸酶显色体系中，室温显色，光镜下观察，以深蓝色沉淀为杂交阳性信号。
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4.免疫组化:细胞爬片经1%牛血清白蛋白封闭，1% Triton X-100处理后，加入1∶50 的鼠源抗HSP70单克隆抗体，4℃过夜。PBS洗3遍，加入1∶100的生物素标记的马抗鼠二抗，常温1 h，PBS洗涤，加入1∶200的卵白链霉素辣根过氧化物酶(HRP),常温下1 h，0.02% 的二氨基苯联胺(DAB) (0.03% H2O2,0.05 mol/L Tris HCl, pH 7.4)显色5～10 min，以胞核黄染为阳性细胞。
5.数据处理及统计学检验:原位杂交、免疫组化结果，在显微镜下经图像分析系统进行密度扫描，测得每个视野内平均吸光度A值(曾称光密度，OD)，或经扫描后得出单位面积中的阳性信号(μm2)，再进行比较。应用SPSS统计软件处理，计量资料用均值±标准差(
±s)表示，采用随机区组方差分析，当差异有显著意义时，行两两q检验， P<0.05为显著界值。, http://www.100md.com
结果
一、缺氧再给氧后HSP70 mRNA的表达
细胞爬片原位杂交结果显示，缺氧3 h HSP70 mRNA的表达增加，杂交阳性信号主要分布在核上，缺氧6 h达高峰(图2)，与对照组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，12 h仍较明显， 24 h后逐渐下降，48 h表达显著降低，但仍高于对照组(P<0.01)。对照组未见杂交阳性信号(表1)。星形胶质细胞缺氧24 h后再给氧3 h HSP70 mRNA的表达亦有增加，杂交阳性信号主要分布在核上，并随再给氧时间延长而表达增强，至再给氧6 h达高峰(P<0.01)，12 h后逐渐下降(表1)。
表1 缺氧及再给氧后各组星形胶质细胞内HSP70
表达的动态变化(
±s)(n=12) 组别及试验时间, 百拇医药
HSP70
mRNA表达(μm2)
应激蛋白
HSP70表达(A)
缺氧组
缺氧时间(h)
0(对照组)
28±5
0.142±0.007
3
57±14*
0.147±0.008
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6
114±30*
0.148±0.008
12
101±24*
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0.147±0.008
48
41±11*
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缺氧24 h再给氧组
再给氧时间(h)
0
52±8
0.145±0.007
3
69±10*
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0.178±0.010**
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34±6
0.165±0.012**
注：与各组0 小时比较：* P<0.01，** P<0.05； A：吸光度值 二、缺氧再给氧后HSP70的表达
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免疫组化结果显示，对照组细胞爬片可见少量HSP70表达，其余各缺氧组无明显变化，仅能检出少量HSP70染色阳性的细胞，与对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)。而再给氧不同时间组HSP70表达增加，于再给氧3 h表达即开始增加，与对照组相比，差异有显著意义(P<0.05)。随再给氧时间延长表达渐增强，再给氧12 h达高峰(P<0.01)(图3)，24 h后逐渐下降，至48 h仍高于对照组(P<0.05)。
讨论
我们既往的实验[5，6]证实了体外培养的星形胶质细胞较神经元更能耐受缺氧损伤。本研究选择众多传递信号中的一种(HSP70)，作为抵抗损伤的分子标记物，来探讨体外培养的新生小鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧损伤即刻及随后再给氧时HSP70表达的变化及其可能的作用。已证实热诱导下CNS中HSP70 mRNA的表达程度，小脑高于大脑胶质细胞、高于神经元[7]，而且星形胶质细胞HSP70 mRNA的体外表达较体内强烈。有学者认为，严重缺血时星形胶质细胞可合成HSP70，而且体外培养较体内培养的星形胶质细胞更易诱导HSP70的合成。而另一些学者发现，单纯缺氧条件下培养的星形胶质细胞也存在HSP78、94和HSP150等的合成。
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本实验结果表明，用免疫组化法于正常对照组中可检测到少量HSP70蛋白，而在缺氧3～48 h内仅能检测出少量HSP70，与对照组相比差异无显著意义。再给氧时存在HSP70的表达，与对照组相比，差异有显著意义，且随再给氧时间延长而表达增强，再给氧12 h达高峰(P<0.01)，但不是所有的细胞均为免疫阳性细胞。HSP70包括HSP72和HSP73，本实验使用的HSP70单抗既抗HSP72又抗HSP73，因此对照组中检测到的HSP70主要是HSP73，而缺氧组中的是HSP72还是HSP73，须进一步用抗HSP72和HSP73的抗体加以鉴别。也有文献报道，体外培养星形胶质细胞缺氧后可诱导其他热休克蛋白表达，而无HSP70产生。本实验结果也表明缺氧后培养的星形胶质细胞内无HSP70的合成，但却发现有HSP70 mRNA的表达，是否因为其他热休克蛋白的产生抑制或拮抗了HSP70的翻译合成？原位杂交结果显示再给氧后3 h即有HSP70 mRNA的表达，6 h达高峰，12 h逐渐下降，与单纯缺氧组相比，其表达时间短、程度轻，也呈现一个先上升后下降的过程。这提示缺氧再给氧时星形胶质细胞内HSP70合成主要与HSP70基因翻译合成增加有关。缺氧再给氧后谷氨酸摄取功能下降导致兴奋性氨基酸在细胞间质堆积，加重神经元的损伤并且可能诱导HSP70基因表达，而谷氨酰胺更是HSP70的强诱导剂。再给氧时氧自由基产生增加也可能是诱导HSP70表达的因素之一。因此，缺氧再给氧时氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸等活性物质的伴随改变，可能是星形胶质细胞产生的HSP70保护作用在单纯缺氧时与缺氧再给氧时反应不同的原因。另外，再给氧时能量代谢破坏，激活HSP70启动子，诱导HSP70表达[8]。文献报道在严重缺氧缺血损伤后长期存活的患儿脑内的CA2、CA3和CA4区有HSP70的表达。Imuta等[8]发现缺氧再给氧后星形胶质细胞内存在HSP70 mRNA和蛋白的表达，且对其具有保护作用，使其适应再给氧。再给氧对于机体非常重要，它类似于缺血后再灌注，代表另一类型的损伤，即迟发性损伤。因此，研究星形胶质细胞在缺氧和再给氧两种应激状态下的反应，对认识星形胶质细胞在缺氧缺血性脑损伤中所起的作用是很重要的。
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我们还观察到，再给氧时并不是所有的细胞均为HSP70免疫阳性细胞，是否表达HSP70的为反应性星形胶质细胞，其功能下降不明显，而无表达的细胞没有被活化，其功能有可能有所下降，也有待于进一步探讨。已证实具有HSP70免疫活性的细胞其HSP70在细胞中的定位体内与体外不同，有的发现为核染，有的发现核浆均可见。本组结果显示，HSP72 mRNA表达主要分布于核上，HSP70蛋白也主要为核表达。由于HSP70在神经元中转运很慢，需胶质细胞将HSP70转移入神经元轴突而发挥生理功能。缺氧缺血时，HSP70消耗殆尽，对神经元的保护作用消失，神经元兴奋性增高而易发生损伤。也有研究认为，神经元不合成HSP70，HSP70在星形胶质细胞内合成，然后被转运至神经元轴索，有学者观察发现星形胶质细胞内HSP70定位在神经元-星形胶质细胞混合培养中，比在纯星形胶质细胞培养中更为胞浆化[7]。
本研究结果表明，缺氧及随后的再给氧可引起星形胶质细胞内HSP70 mRNA的表达增强，但直至再给氧才有HSP70蛋白的表达，它可能对于缺氧再给氧引起的星形胶质细胞损伤具有保护作用。再给氧时星形胶质细胞内肯定会产生一些不利的因素，但其本身也发生了一些与神经元不同的变化，如合成神经营养因子、IL-6、HSP70等，使其能够存活。星形胶质细胞的功能是保持CNS微环境稳定及促进损伤后的修复和再生。但是，缺氧损伤后的反应性星形胶质细胞增生是利是弊还存在争论。因此，进一步研究缺氧再给氧条件下神经元HSP70表达的变化及其与星形胶质细胞之间的关系，并深入研究及认识脑内尤其是发育中脑内星形胶质细胞在维持正常脑功能中的重要性及其作用机制，探索其在缺氧缺血性脑损伤中的有利和不利反应以及与之相关的因素，就可以为今后研究在脑损伤发生发展过程中适时给予干预措施，抑制不利反应，促进有利方面等，提供更多的实验依据。
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图1 星形胶质细胞鉴定(间接免疫荧光法 光镜 ×200)
图2 缺氧6 h星形胶质细胞内HSP70 mRNA表达(原位杂交法 光镜 ×250)
图3 缺氧24 h后再给氧 12 h星形胶质细胞内
HSP70蛋白的表达(免疫组化法 光镜 ×250)
基金项目：“九五”国家医学科技攻关项目基金资助项目(96-904-06-04)
参考文献
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2.梁卫兰, 单巍松, 吴希如. 大鼠(小鼠)大脑皮层星形胶质细胞培养方法. 北京医科大学学报, 1994, 26:320.
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(收稿日期：1999-08-25), 百拇医药