运用原位末端标记技术检测大鼠缺氧缺血性脑损伤中III型细胞死亡
作者：周伟 吴圣楣 陈惠金 陆良勇
单位：周伟(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；吴圣楣(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陈惠金(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陆良勇(南京军区上海肝病研究中心)
关键词：脑缺氧；脑缺血；细胞死亡；显微镜检查；脱噬作用
中华儿科杂志000411 【摘要】 目的 探讨新生大鼠脑缺氧缺血(HI)后迟发性神经元死亡的形式。方法 建立新生大鼠脑HI损伤标准动物模型，运用HE染色光镜观察及原位末端标记(ISEL)技术对HI后不同时间点实验侧大鼠大脑皮质、海马回死亡细胞进行观察与比较。结果 HI迟发性脑损伤中，存在一种既不同于细胞凋亡又有别于细胞坏死的一种特殊的细胞死亡——III型细胞死亡。光镜下，III型细胞既表现为核固缩、核染色质边聚、细胞体积缩小等I型(凋亡)细胞的特征，又呈现为胞浆丰富、胞膜完整性丧失等Ⅱ型(坏死)细胞的特征。ISEL检测III型细胞无核周空晕、无凋亡小体形成。I型细胞在脑HI后6 h 开始明显增多，平均为(21.3±3.5)/10个高倍视野(10 hpf)；24 h达高峰，为(63.7±3.2)/10 hpf，与对照组比较差异有显著意义(P<0.001)。脑HI后24 h可检测到III型细胞，平均为(50.6±6.3)/10 hpf；48 h阳性率最高，为(75.6±10.2)/10 hpf，明显高于I型细胞[(42.3±4.5)/10 hpf，P<0.01]。 III型细胞主要分布在坏死区或其周围。结论 新生大鼠HI迟发性神经元死亡中，不仅存在细胞坏死和细胞凋亡，而且还存在III型细胞死亡。III型细胞死亡是与凋亡和坏死相关的一种特殊类型的细胞死亡。
, 百拇医药
Discrimination of the type III cell death in hypoxic-ischemic brain damage in rats by in situ end labeling
ZHOU Wei, WU Shengmei, CHEN Huijin
(Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092, China)
【Abstract】 Objective To investigate the type of delayed neuron death following cerebral hypoxia-ischemia (HI) in neonatal rats. Methods Using HE staining and in situ end labeling (ISEL) methods, the authors observed the histological features of the cell death in the cerebral cortex and hippocampus of experimental hemispherium at different time points in the HI model of neonatal rats. Results As a special type of cell death, the type III cell death was observed in the delayed cerebral damage of HI in neonatal rat brains. Under the light microscope, the type III cell showed the condensed nuclear chromatin and the shrunken cell volume which shared the characteristics with the type I (apoptosis) cells; meanwhile, the type III cell showed the cell rich in cytoplasm and lost integrity of the plasma membrane which shared the characteristics with the type II (necrosis) cells. The type III cells were revealed by ISEL without the perinuclear halo and the apoptotic bodies. The type I (apoptosis) cells increased significantly in the experimental hemisphere 6 hours after HI [ (21.3±3.5)/10 hpf], and reached the peak level at 24 hours [(63.7±3.2)/10 hpf], when compared with the control [(7.3±2.3)/10 hpf, P<0.001]. There was no type III cell in the normal brain tissue, while the type III cells could be observed in the experimental hemisphere 24 hours after HI [(50.6±6.3)/10 hpf], and reached the peak level at 48 hours [(75.6±10.2)/10 hpf], which was higher than the type I cells [(42.3±4.5)/10 hpf] at the same time point (P<0.01). The type III cells were mainly located in the necrotic area or around the necrotic area. Conclusions The type III cell death was mainly involved in the delayed cell death following HI injury in addition to the necrosis and apoptosis. The type III cell death was a special type of cell death, which related to apoptosis and necrosis.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral ischemia; Cerebral anoxia; Cell death; Microscopy; Apoptosis
随着分子生物学技术的发展和检测细胞死亡技术的改进，人们对细胞死亡也有了新的认识。近期的研究表明，在以细胞核DNA裂解和细胞膜通透性增加为判别标准及形态学变化方面，发现了既有凋亡特征又有坏死特征的一类细胞，即晚期凋亡或坏死细胞(III型细胞)。我们在对脑缺氧缺血(HI)新生大鼠模型进行迟发性细胞死亡的研究过程中也观察到了III型细胞。现将其形态学和原位末端标记(ISEL)特征总结如下，并初步探讨其在脑损伤中的意义。
材料和方法
一、实验动物分组
生长条件相同的108只新生大鼠随机分为2组，每组54只。其中一组行颈正中切口后即缝合皮肤(假手术)作为对照组；另一组为缺氧缺血组、即实验组。实验组分别于缺氧结束后0、2、6、12、24、48、72 h及7、14 d断颈处死；对照组于相对应的时间点处死，每个时间点6只。均取右侧(实验组即缺氧缺血侧)大脑半球固定于10%的甲醛溶液中。
, http://www.100md.com
二、新生大鼠脑HI模型的制作
参照Rice等[1]的方法，将生后7 d的SD大鼠(购自中国医学科学院上海实验动物中心)取仰卧位，四肢固定于手术板上，颈正中切口，游离右侧颈总动脉并结扎，缝合切口后置于容积为2 L的密闭容器内，该容器置于37℃水浴中。以1～2 L/min的速度输入体积浓度为8%氧气和体积浓度为92%氮气的混合气体，持续2.5 h。
三、ISEL
自丘脑中1/3平面行冠状切片，片厚4 mm，石蜡包埋。切片(4 μm厚)做HE染色、光镜观察后，邻近处的石蜡切片定为标记靶组织。并取对照组相对应组织作为阴性对照。采用原位细胞死亡检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，参照陆良勇等[2]的方法进行改进。实验流程为：(1)标记切片常规二甲苯脱蜡，梯度清洗(酒精至自来水)；(2)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(3)0.01% Triton X-100(曲通X-100) 处理15 min；(4)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(5)3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；(6)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(7)蛋白酶K 20 μg/ml置37℃水溶槽内30 min；(8)重复步骤2；(9)37℃干燥箱内干燥切片；(10) 每张切片滴加40 μl TUNEL(经末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记)反应液，置37℃水槽内60 min；(11)滴加甘油(1∶9 0.05 mol/L Tris稀释)封片，荧光显微镜观察1～3 h；(12)0.05 mol/L pH 值7.6 的TBS(Tris 缓冲盐溶液)漂洗去盖片，冲洗漂洗各3次，每次3 min；(13)每张切片滴加Converter POD(辣根过氧化物酶) (3∶1 0.05 mol/L Tris 稀释)40～60 μl，置37℃水槽内60 min；(14) 0.05 mol/L pH 7.6 的TBS冲洗漂洗各3次，每次3 min；(15)二氨基联苯胺(DAB)显色5～15 min，镜下控制；(16)双蒸水终止反应；(17)苏木素复染细胞核1 min，切片脱水，中性树胶封片。阴性对照，在实验流程10不加TUNEL反应液，于实验流程16后，光镜下无阳性信号出现。
, http://www.100md.com
四、结果判断
I型细胞死亡(凋亡)：核染色质边聚，细胞大小不一，细胞完整性好，胞浆嗜酸性变；荧光及ISEL POD显色，阳性信号界限清楚，信号强弱不一，核周空晕明显，可有凋亡小体形成。II型细胞死亡(坏死)：细胞体积较大，胞膜边界不清，核染色质嗜酸性变，核形不规则；荧光及ISEL POD显色，无阳性信号。完全坏死细胞核染色质全部消失。 III 型细胞死亡：核大小较一致，但核染色质边聚，细胞完整性差；荧光及ISEL POD显色，细胞核阳性，但阳性信号分布均匀、大小较一致，无凋亡小体，核周空晕不明显或无。对实验组、对照组的ISEL切片进行观察和比较。ISEL切片在镜下定位，由DIPAS-200型细胞图像分析系统的彩色CCD摄录系统(定诚科技公司)输入计算机，在显示屏中选取10幅(10个视野，分别为皮质浅层4个、深层4个以及海马2个视野)作I型、III型细胞阳性率统计(因II型细胞不被ISEL所标记,故II型细胞无分类计数)。数据以均值±标准差(
±s)表示，进行批间比较，用Statistica 5.0软件处理。
, 百拇医药
结果
对照组在各观察时间点I型细胞数差异无显著意义(P>0.05)，平均为(7.3±2.3)/10 hpt。脑HI后0、2、6、12、24、48、72 h及7、14 d I型细胞数分别为：(6.6±2.5)、 (7.3±2.1)、 (21.3±3.5)、 (39.7±4.5)、 (63.7±3.2)、 (42.3±4.5)、 (34.0±6.9)、(8.3±1.5)、(7.6±2.1)/10 hpf。与对照组6、12、24、48、72 h时间点比较，差异有非常显著意义(P<0.001)。正常(对照组)脑组织无III型细胞，脑HI后0、2、6、12 h时间点亦未观察到III型细胞；脑HI后24 h可见到散在或呈小灶性分布的III型细胞，多位于坏死灶附近，平均为(50.6±6.3)/10 hpf；脑HI后48 h，在坏死区边缘，III型细胞数为(75.6±10.2)/10 hpf，明显高于I型细胞[(42.3±4.5)/10 hpf，P<0.01](图1～ 4)。脑HI后72 h III型细胞已明显减少至(22.6±8.5)/10 hpf；脑HI后7 d已很难检测到III型细胞。III型细胞出现较晚，但其存在与I型细胞密切相关。各型细胞死亡的形态及ISEL特点见表1。
, http://www.100md.com
表1 ISEL标记特点与 I、II和III型细胞的形态 ISEL 特点
I型
II型
III型
核染色质边聚
明显
无
有
细胞核嗜酸性变
无
有
无
细胞大小
, http://www.100md.com
缩小
肿胀
缩小
细胞外空隙
明显
无
无或不完整
胞浆嗜酸性变
强
不明显
弱
胞膜界限
清楚
, http://www.100md.com 不清楚
不清楚
荧光及POD，DAB显色
+～+++
-
++
凋亡小体
可见
无
无
核周空晕
明显
无
, 百拇医药 无
图1 脑HI后24h海马回 示典型凋亡细胞(↑)及胞膜和
细胞外间隙不完整，胞浆嗜酸性变，核染色质聚集成块的Ⅲ型细胞(
)(HE染色 光镜 ×320)
图2 脑HI后48h的脑细胞 可见坏死灶附近有
较多大小不一的阳性信号，染色质边界清楚，信号强，有核周空晕，为Ⅰ型细胞；细胞核染色质边界不清，无明显核周空晕，信号较前者稍弱，大小较一致为Ⅲ型细胞(原位未端标记 光镜 ×320)
, http://www.100md.com
图3 原位未端标记的细胞 箭头(↑)所示为
原位未端标记阳性细胞(Ⅰ型细胞)余为非特异性反应
的神经细胞(原位未端标记光镜 ×320)
图4 原位未端标记的凋亡细胞 典型凋亡细胞
(Ⅰ型细胞)(↑)呈棕褐色，核边界清晰，核大小不一，有时可见核切迹，多有核周空晕(原位未端标记 光镜 ×860)
讨论
1995年O′Brien等[3, 4]采用流式细胞分析技术，观察了一组乳腺癌细胞株发生凋亡的过程，提出了细胞死亡可分为：早期凋亡(I型)、早期坏死(II型)和晚期凋亡/坏死(III型)三个类型。早期凋亡细胞以胞浆浓缩，DNA片段化，以及凋亡小体形成为特征，但胞膜功能和细胞器完整。早期坏死细胞则以代谢崩解，细胞肿胀以及胞膜完整性的迅速丧失，但DNA无明显降解为特征。在缺乏吞噬细胞的情况下，晚期凋亡细胞膜渗透性增加，导致DNA片段和蛋白质的丧失。这一论述打破了细胞死亡或归入凋亡，或归入坏死的说法。其后一些学者采用Annexin V结合阳离子染料，如台盼兰、碘化丙锭和7-氨基酸放线菌素D等双标记法相继在肝脏等细胞中证实III型细胞的存在[5-7]。国内陆良勇等[8]采用ISEL及原位DNA定量结合形态学观察也证实了危重肝炎患者肝细胞中存在III型细胞。我们在研究新生大鼠缺氧缺血后迟发性细胞死亡时也发现梗死灶附近，特别是脑HI后24～48 h，一些细胞表现为核固缩，核染色质边聚，细胞体积缩小而大小基本一致，胞浆嗜酸性变，无细胞外空隙或不明显，周围有炎性细胞；ISEL阳性信号强度较凋亡细胞弱，核染色质边界不清楚，无核周空晕。这些细胞既不同于一般凋亡，又有别于细胞坏死，故而认为这些细胞可能即为III型细胞。从形态及ISEL特征提示，III型细胞是I型细胞向II型细胞的转变。脑HI后，III型细胞的存在也与I型细胞密切相关。虽然III型细胞出现较晚，但当I型细胞基本消失时，也很难观察到III型细胞。本研究结果提示，在HI后迟发性脑损伤中，不仅存在细胞坏死，而且有细胞凋亡和III型细胞死亡。III型细胞死亡已从DNA裂解及膜通透性等生化特性得以证实，其作为细胞死亡的特殊类型已逐渐被人们所认识，但其发生机制和分布规律尚有待阐明。
, http://www.100md.com
动物实验研究发现，凋亡与坏死这两种细胞死亡类型对治疗反应截然不同。Edwards等[9]在给新生猪造成急性脑HI模型后，复苏12 h内使其脑温降低3℃，发现凋亡细胞数量明显减少，而坏死细胞数没有改变。因此，对III型细胞及其发生机制的阐明，将有利于采取措施使死亡趋向的这类细胞尽可能向I型细胞转化，而避免转化为II型(坏死)细胞。
虽然脑HI时存在着钙内流现象，体内外一些实验也证明，当胞内游离Ca++上升时，核酸内切酶活性升高，诱导凋亡，而其抑制剂可阻断DNA分解和细胞凋亡。但也有人认为胞内Ca++的上升并不是启动细胞凋亡的早期因素，而是细胞凋亡过程中的伴随因素。III型细胞主要出现于脑HI后的晚些时候，可能与钙离子浓度过低、缺乏吞噬细胞有关。
参考文献
1，Rice JE 3d, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981,9:131-141.
, http://www.100md.com
2，陆良勇, 陈成伟, 刘燕, 等. 细胞凋亡与细胞增殖在人肝细胞癌中的表达和意义. 中华消化杂志, 1998,18:334-336.
3，O′Brien MC,Bolton WE.Comparison of cell viability probes compatible with fixation and permeabilization for combined surface and intracellular staining in flow cytometry.Cytometry, 1995,19:243-255.
4，O′Brien MC, Healy SF, Raney S, et al. Discrimination of late apoptotic/necrotic cells (type III) by flow cytometry in solid tumors. Cytometry, 1997,28:81-89.
, 百拇医药
5，Engeiand MV, Nieland LJW, Ramaekers FCS, et al. Annexin V-affinity assay:a review on an apoptosis detection system based on phosphatidyl- serine exposure. Cytometry, 1998,31:1-9.
6，Darzynkiewicz Z, Juan G, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental cell death(necrosis).Cytometry, 1997,27:1-20.
7，Van den Eijnde SM, Luijsterburg AJ, Boshart L, et al. In situ detection of apoptosis during embryogenesis with annexin V∶ from whole mount to ultrastructure. Cytometry, 1997,29:313-320.
8，陆良勇, 陈成伟, 刘燕. 运用原位末端标记和原位DNA定量检测重型肝炎中III型细胞死亡. 肝脏, 1999,4:5-8.
9，Edwards AD, Yue X, Squier MV, et al. Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia by moderate post-insult hypothermia. Biochem Biophys Res Common, 1995,217:1193-1199.
(收稿日期：1999-08-10), http://www.100md.com
单位：周伟(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；吴圣楣(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陈惠金(200092 上海第二医科大学新华医院 上海市儿科医学研究所)；陆良勇(南京军区上海肝病研究中心)
关键词：脑缺氧；脑缺血；细胞死亡；显微镜检查；脱噬作用
中华儿科杂志000411 【摘要】 目的 探讨新生大鼠脑缺氧缺血(HI)后迟发性神经元死亡的形式。方法 建立新生大鼠脑HI损伤标准动物模型，运用HE染色光镜观察及原位末端标记(ISEL)技术对HI后不同时间点实验侧大鼠大脑皮质、海马回死亡细胞进行观察与比较。结果 HI迟发性脑损伤中，存在一种既不同于细胞凋亡又有别于细胞坏死的一种特殊的细胞死亡——III型细胞死亡。光镜下，III型细胞既表现为核固缩、核染色质边聚、细胞体积缩小等I型(凋亡)细胞的特征，又呈现为胞浆丰富、胞膜完整性丧失等Ⅱ型(坏死)细胞的特征。ISEL检测III型细胞无核周空晕、无凋亡小体形成。I型细胞在脑HI后6 h 开始明显增多，平均为(21.3±3.5)/10个高倍视野(10 hpf)；24 h达高峰，为(63.7±3.2)/10 hpf，与对照组比较差异有显著意义(P<0.001)。脑HI后24 h可检测到III型细胞，平均为(50.6±6.3)/10 hpf；48 h阳性率最高，为(75.6±10.2)/10 hpf，明显高于I型细胞[(42.3±4.5)/10 hpf，P<0.01]。 III型细胞主要分布在坏死区或其周围。结论 新生大鼠HI迟发性神经元死亡中，不仅存在细胞坏死和细胞凋亡，而且还存在III型细胞死亡。III型细胞死亡是与凋亡和坏死相关的一种特殊类型的细胞死亡。
, 百拇医药
Discrimination of the type III cell death in hypoxic-ischemic brain damage in rats by in situ end labeling
ZHOU Wei, WU Shengmei, CHEN Huijin
(Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092, China)
【Abstract】 Objective To investigate the type of delayed neuron death following cerebral hypoxia-ischemia (HI) in neonatal rats. Methods Using HE staining and in situ end labeling (ISEL) methods, the authors observed the histological features of the cell death in the cerebral cortex and hippocampus of experimental hemispherium at different time points in the HI model of neonatal rats. Results As a special type of cell death, the type III cell death was observed in the delayed cerebral damage of HI in neonatal rat brains. Under the light microscope, the type III cell showed the condensed nuclear chromatin and the shrunken cell volume which shared the characteristics with the type I (apoptosis) cells; meanwhile, the type III cell showed the cell rich in cytoplasm and lost integrity of the plasma membrane which shared the characteristics with the type II (necrosis) cells. The type III cells were revealed by ISEL without the perinuclear halo and the apoptotic bodies. The type I (apoptosis) cells increased significantly in the experimental hemisphere 6 hours after HI [ (21.3±3.5)/10 hpf], and reached the peak level at 24 hours [(63.7±3.2)/10 hpf], when compared with the control [(7.3±2.3)/10 hpf, P<0.001]. There was no type III cell in the normal brain tissue, while the type III cells could be observed in the experimental hemisphere 24 hours after HI [(50.6±6.3)/10 hpf], and reached the peak level at 48 hours [(75.6±10.2)/10 hpf], which was higher than the type I cells [(42.3±4.5)/10 hpf] at the same time point (P<0.01). The type III cells were mainly located in the necrotic area or around the necrotic area. Conclusions The type III cell death was mainly involved in the delayed cell death following HI injury in addition to the necrosis and apoptosis. The type III cell death was a special type of cell death, which related to apoptosis and necrosis.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral ischemia; Cerebral anoxia; Cell death; Microscopy; Apoptosis
随着分子生物学技术的发展和检测细胞死亡技术的改进，人们对细胞死亡也有了新的认识。近期的研究表明，在以细胞核DNA裂解和细胞膜通透性增加为判别标准及形态学变化方面，发现了既有凋亡特征又有坏死特征的一类细胞，即晚期凋亡或坏死细胞(III型细胞)。我们在对脑缺氧缺血(HI)新生大鼠模型进行迟发性细胞死亡的研究过程中也观察到了III型细胞。现将其形态学和原位末端标记(ISEL)特征总结如下，并初步探讨其在脑损伤中的意义。
材料和方法
一、实验动物分组
生长条件相同的108只新生大鼠随机分为2组，每组54只。其中一组行颈正中切口后即缝合皮肤(假手术)作为对照组；另一组为缺氧缺血组、即实验组。实验组分别于缺氧结束后0、2、6、12、24、48、72 h及7、14 d断颈处死；对照组于相对应的时间点处死，每个时间点6只。均取右侧(实验组即缺氧缺血侧)大脑半球固定于10%的甲醛溶液中。
, http://www.100md.com
二、新生大鼠脑HI模型的制作
参照Rice等[1]的方法，将生后7 d的SD大鼠(购自中国医学科学院上海实验动物中心)取仰卧位，四肢固定于手术板上，颈正中切口，游离右侧颈总动脉并结扎，缝合切口后置于容积为2 L的密闭容器内，该容器置于37℃水浴中。以1～2 L/min的速度输入体积浓度为8%氧气和体积浓度为92%氮气的混合气体，持续2.5 h。
三、ISEL
自丘脑中1/3平面行冠状切片，片厚4 mm，石蜡包埋。切片(4 μm厚)做HE染色、光镜观察后，邻近处的石蜡切片定为标记靶组织。并取对照组相对应组织作为阴性对照。采用原位细胞死亡检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，参照陆良勇等[2]的方法进行改进。实验流程为：(1)标记切片常规二甲苯脱蜡，梯度清洗(酒精至自来水)；(2)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(3)0.01% Triton X-100(曲通X-100) 处理15 min；(4)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(5)3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；(6)双蒸水漂洗3次，每次3 min；(7)蛋白酶K 20 μg/ml置37℃水溶槽内30 min；(8)重复步骤2；(9)37℃干燥箱内干燥切片；(10) 每张切片滴加40 μl TUNEL(经末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记)反应液，置37℃水槽内60 min；(11)滴加甘油(1∶9 0.05 mol/L Tris稀释)封片，荧光显微镜观察1～3 h；(12)0.05 mol/L pH 值7.6 的TBS(Tris 缓冲盐溶液)漂洗去盖片，冲洗漂洗各3次，每次3 min；(13)每张切片滴加Converter POD(辣根过氧化物酶) (3∶1 0.05 mol/L Tris 稀释)40～60 μl，置37℃水槽内60 min；(14) 0.05 mol/L pH 7.6 的TBS冲洗漂洗各3次，每次3 min；(15)二氨基联苯胺(DAB)显色5～15 min，镜下控制；(16)双蒸水终止反应；(17)苏木素复染细胞核1 min，切片脱水，中性树胶封片。阴性对照，在实验流程10不加TUNEL反应液，于实验流程16后，光镜下无阳性信号出现。
, http://www.100md.com
四、结果判断
I型细胞死亡(凋亡)：核染色质边聚，细胞大小不一，细胞完整性好，胞浆嗜酸性变；荧光及ISEL POD显色，阳性信号界限清楚，信号强弱不一，核周空晕明显，可有凋亡小体形成。II型细胞死亡(坏死)：细胞体积较大，胞膜边界不清，核染色质嗜酸性变，核形不规则；荧光及ISEL POD显色，无阳性信号。完全坏死细胞核染色质全部消失。 III 型细胞死亡：核大小较一致，但核染色质边聚，细胞完整性差；荧光及ISEL POD显色，细胞核阳性，但阳性信号分布均匀、大小较一致，无凋亡小体，核周空晕不明显或无。对实验组、对照组的ISEL切片进行观察和比较。ISEL切片在镜下定位，由DIPAS-200型细胞图像分析系统的彩色CCD摄录系统(定诚科技公司)输入计算机，在显示屏中选取10幅(10个视野，分别为皮质浅层4个、深层4个以及海马2个视野)作I型、III型细胞阳性率统计(因II型细胞不被ISEL所标记,故II型细胞无分类计数)。数据以均值±标准差(
±s)表示，进行批间比较，用Statistica 5.0软件处理。, 百拇医药
结果
对照组在各观察时间点I型细胞数差异无显著意义(P>0.05)，平均为(7.3±2.3)/10 hpt。脑HI后0、2、6、12、24、48、72 h及7、14 d I型细胞数分别为：(6.6±2.5)、 (7.3±2.1)、 (21.3±3.5)、 (39.7±4.5)、 (63.7±3.2)、 (42.3±4.5)、 (34.0±6.9)、(8.3±1.5)、(7.6±2.1)/10 hpf。与对照组6、12、24、48、72 h时间点比较，差异有非常显著意义(P<0.001)。正常(对照组)脑组织无III型细胞，脑HI后0、2、6、12 h时间点亦未观察到III型细胞；脑HI后24 h可见到散在或呈小灶性分布的III型细胞，多位于坏死灶附近，平均为(50.6±6.3)/10 hpf；脑HI后48 h，在坏死区边缘，III型细胞数为(75.6±10.2)/10 hpf，明显高于I型细胞[(42.3±4.5)/10 hpf，P<0.01](图1～ 4)。脑HI后72 h III型细胞已明显减少至(22.6±8.5)/10 hpf；脑HI后7 d已很难检测到III型细胞。III型细胞出现较晚，但其存在与I型细胞密切相关。各型细胞死亡的形态及ISEL特点见表1。
, http://www.100md.com
表1 ISEL标记特点与 I、II和III型细胞的形态 ISEL 特点
I型
II型
III型
核染色质边聚
明显
无
有
细胞核嗜酸性变
无
有
无
细胞大小
, http://www.100md.com
缩小
肿胀
缩小
细胞外空隙
明显
无
无或不完整
胞浆嗜酸性变
强
不明显
弱
胞膜界限
清楚
, http://www.100md.com 不清楚
不清楚
荧光及POD，DAB显色
+～+++
-
++
凋亡小体
可见
无
无
核周空晕
明显
无
, 百拇医药 无
图1 脑HI后24h海马回 示典型凋亡细胞(↑)及胞膜和
细胞外间隙不完整，胞浆嗜酸性变，核染色质聚集成块的Ⅲ型细胞(
)(HE染色 光镜 ×320)图2 脑HI后48h的脑细胞 可见坏死灶附近有
较多大小不一的阳性信号，染色质边界清楚，信号强，有核周空晕，为Ⅰ型细胞；细胞核染色质边界不清，无明显核周空晕，信号较前者稍弱，大小较一致为Ⅲ型细胞(原位未端标记 光镜 ×320)
, http://www.100md.com
图3 原位未端标记的细胞 箭头(↑)所示为
原位未端标记阳性细胞(Ⅰ型细胞)余为非特异性反应
的神经细胞(原位未端标记光镜 ×320)
图4 原位未端标记的凋亡细胞 典型凋亡细胞
(Ⅰ型细胞)(↑)呈棕褐色，核边界清晰，核大小不一，有时可见核切迹，多有核周空晕(原位未端标记 光镜 ×860)
讨论
1995年O′Brien等[3, 4]采用流式细胞分析技术，观察了一组乳腺癌细胞株发生凋亡的过程，提出了细胞死亡可分为：早期凋亡(I型)、早期坏死(II型)和晚期凋亡/坏死(III型)三个类型。早期凋亡细胞以胞浆浓缩，DNA片段化，以及凋亡小体形成为特征，但胞膜功能和细胞器完整。早期坏死细胞则以代谢崩解，细胞肿胀以及胞膜完整性的迅速丧失，但DNA无明显降解为特征。在缺乏吞噬细胞的情况下，晚期凋亡细胞膜渗透性增加，导致DNA片段和蛋白质的丧失。这一论述打破了细胞死亡或归入凋亡，或归入坏死的说法。其后一些学者采用Annexin V结合阳离子染料，如台盼兰、碘化丙锭和7-氨基酸放线菌素D等双标记法相继在肝脏等细胞中证实III型细胞的存在[5-7]。国内陆良勇等[8]采用ISEL及原位DNA定量结合形态学观察也证实了危重肝炎患者肝细胞中存在III型细胞。我们在研究新生大鼠缺氧缺血后迟发性细胞死亡时也发现梗死灶附近，特别是脑HI后24～48 h，一些细胞表现为核固缩，核染色质边聚，细胞体积缩小而大小基本一致，胞浆嗜酸性变，无细胞外空隙或不明显，周围有炎性细胞；ISEL阳性信号强度较凋亡细胞弱，核染色质边界不清楚，无核周空晕。这些细胞既不同于一般凋亡，又有别于细胞坏死，故而认为这些细胞可能即为III型细胞。从形态及ISEL特征提示，III型细胞是I型细胞向II型细胞的转变。脑HI后，III型细胞的存在也与I型细胞密切相关。虽然III型细胞出现较晚，但当I型细胞基本消失时，也很难观察到III型细胞。本研究结果提示，在HI后迟发性脑损伤中，不仅存在细胞坏死，而且有细胞凋亡和III型细胞死亡。III型细胞死亡已从DNA裂解及膜通透性等生化特性得以证实，其作为细胞死亡的特殊类型已逐渐被人们所认识，但其发生机制和分布规律尚有待阐明。
, http://www.100md.com
动物实验研究发现，凋亡与坏死这两种细胞死亡类型对治疗反应截然不同。Edwards等[9]在给新生猪造成急性脑HI模型后，复苏12 h内使其脑温降低3℃，发现凋亡细胞数量明显减少，而坏死细胞数没有改变。因此，对III型细胞及其发生机制的阐明，将有利于采取措施使死亡趋向的这类细胞尽可能向I型细胞转化，而避免转化为II型(坏死)细胞。
虽然脑HI时存在着钙内流现象，体内外一些实验也证明，当胞内游离Ca++上升时，核酸内切酶活性升高，诱导凋亡，而其抑制剂可阻断DNA分解和细胞凋亡。但也有人认为胞内Ca++的上升并不是启动细胞凋亡的早期因素，而是细胞凋亡过程中的伴随因素。III型细胞主要出现于脑HI后的晚些时候，可能与钙离子浓度过低、缺乏吞噬细胞有关。
参考文献
1，Rice JE 3d, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981,9:131-141.
, http://www.100md.com
2，陆良勇, 陈成伟, 刘燕, 等. 细胞凋亡与细胞增殖在人肝细胞癌中的表达和意义. 中华消化杂志, 1998,18:334-336.
3，O′Brien MC,Bolton WE.Comparison of cell viability probes compatible with fixation and permeabilization for combined surface and intracellular staining in flow cytometry.Cytometry, 1995,19:243-255.
4，O′Brien MC, Healy SF, Raney S, et al. Discrimination of late apoptotic/necrotic cells (type III) by flow cytometry in solid tumors. Cytometry, 1997,28:81-89.
, 百拇医药
5，Engeiand MV, Nieland LJW, Ramaekers FCS, et al. Annexin V-affinity assay:a review on an apoptosis detection system based on phosphatidyl- serine exposure. Cytometry, 1998,31:1-9.
6，Darzynkiewicz Z, Juan G, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental cell death(necrosis).Cytometry, 1997,27:1-20.
7，Van den Eijnde SM, Luijsterburg AJ, Boshart L, et al. In situ detection of apoptosis during embryogenesis with annexin V∶ from whole mount to ultrastructure. Cytometry, 1997,29:313-320.
8，陆良勇, 陈成伟, 刘燕. 运用原位末端标记和原位DNA定量检测重型肝炎中III型细胞死亡. 肝脏, 1999,4:5-8.
9，Edwards AD, Yue X, Squier MV, et al. Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia by moderate post-insult hypothermia. Biochem Biophys Res Common, 1995,217:1193-1199.
(收稿日期：1999-08-10), http://www.100md.com