儿童急性白血病多药耐药基因检测的临床价值
作者：周东风 孟浦 李立家 金润铭 费洪宝
单位：周东风(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；孟浦(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；金润铭(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；费洪宝(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；李立家(武汉大学生命科学院遗传研究室)
关键词：
中华儿科杂志000525 随着联合化疗的应用，儿童急性白血病的疗效已有极大提高，但仍有部分患儿达不到完全缓解或缓解后易复发。多年的研究发现，白血病细胞多药耐药性 (multidrug resistance, MDR)是白血病难以获得良好疗效的障碍。多药耐药基因(mdr1)的扩增和过度表达所引起的MDR是其中的一个重要机制[1]。我们以半定量逆转录聚合酶链反应 (reverse transcription polymerase reaction, RT-PCR)技术检测了33例儿童急性白血病细胞中mdr1 mRNA基因的表达，初步探讨了其与临床耐药的关系。
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对象
小儿急性白血病 33例均符合 FAB的诊断标准。33例患儿共检测骨髓标本58份，其中 23份为初治时留取的骨髓，27份为诱导缓解后留取的骨髓，另8份难治性复发患儿于诱导化疗4个疗程后或复发时留取的骨髓。10例正常小儿的外周血作为对照。
方法
1.细胞总RNA提取：按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。
2.逆转录 RNA合成 cDNA：30 μl反应体系中含RNA 1 μg， 3 μg随机引物和200 U 的MMLV(小鼠白血病病毒)逆转录酶，于42℃水浴反应1 h。
3.PCR 反应：50 μl反应体系含10 μl 的 5×buffer，2 μl 的 0.25 mmol/L dNTPs。mdr1和β2M引物各 50 pmol，逆转录产物 cDNA 150 ng，Taq酶 1 U混匀。94℃变性 40 s，50℃退火 50 s，72℃延伸 70 s，循环扩增30个周期，最后1次延伸时间为10 min。mdr1引物序列为5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG(2596-2615),3′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-5′， 扩增片段为 157 bp。为消除实验误差设β2M mRNA为 mdr1 mRNA检测的内标，序列为5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ (1543-1562),3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-5′，扩增片段为114 bp[2]。
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4.mdr1 基因半定量：以 pBR322 DNA/MspI作为 DNA分子量标记，取10 μl电泳产物于2%琼脂糖凝胶上70 V电泳1 h，置紫外检测仪上观察、照相。底片置激光密度扫描仪上定量。计算mdr1/β2M比值来表示mdr1 的表达水平。统计学处理采用χ2和t检验。
结果
1.mdr1基因RT-PCR结果：10例正常小儿外周血对照标本未见mdr1基因扩增带,仅见一条β2M基因扩增带。Mdr1基因阳性表达患儿则可见强弱不等的mdr1和β2M基因2条扩增带 。
2.33例患儿mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值结果:复发难治组患儿的mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值明显高于初治组和诱导缓解组,差异有非常显著意义(表1)。
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3.mdr1基因表达与临床的关系：23份初治患儿有4例mdr1阳性，其中2份经诱导化疗不缓解，余19份 mdr1阴性患儿仅1例不缓解，缓解率达95% 。27份诱导化疗缓解后的患儿有8例mdr1表达阳性，其中5份患儿逐渐复发，mdr1基因表达更加增强。复发难治组仅1份mdr1表达阴性，余7份患儿mdr1基因持续表达，化疗效果差，缓解率低。仅有1份mdr1阳性表达患儿在更换化疗方案后再次获得缓解。
表1 33例白血病58份骨髓标本mdr1
表达结果及比较(
±s) 组别
份数
mdr1阳性份数(%)
mdr1/β2M
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①初治患儿组
23
4(17)
0.34±0.11
②诱导缓解组
27
8(30)
0.36±0.15
③复发难治组
8
7(88)
0.78±0.21
注：三组mdr1表达阳性率比较：①与②比较：χ2=1.019 9，P>0.5；①与③比较：χ2=12.743 8，P<0.005；②与③比较：χ2=8.439 4，P<0.005；三组mdr1/β2M值比较：①与②比较：t=0.499 2，P>0.5；①与③比较：t=5.5 821,P<0.001;②与③比较：t=5.529 9,P<0.001 讨论
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本研究对 33 例急性白血病患儿化疗前后及复发前后进行了短期动态检测，发现急性白血病患儿初治时即可检测出mdr1基因表达。这种原发性mdr1基因表达，有人认为可能是在转化为急性白血病过程中的基因突变所致[3,4]，是导致部分患儿不能获得缓解的主要原因。在对诱导缓解组患儿的随访检测时发现5例逐渐复发的患儿其 mdr1基因表达亦增强，提示在诱导缓解后的巩固治疗中药物产生了MDR。mdr1基因阳性表达患儿其化疗疗效差，易复发，缓解率明显低于mdr1基因阴性患儿。因此，小儿急性白血病的化疗效果及预后与 mdr1基因的表达水平密切相关，mdr1基因表达增加是不良预后的一个重要因素[2]。
然而，1例经常规诱导化疗不缓解的初治mdr1阳性表达患儿和1例复发患儿经加大化疗剂量和更换化疗药物后获得缓解，提示mdr1基因表达增高并非对所有化疗药物耐药，且复发的难治患儿中有1例mdr1基因表达阴性，从而说明mdr1表达差异不能解释所有的临床白血病耐药。但初治患儿mdr1基因阳性表达可作为常规化疗疗效差的一个指标，而且，对确有mdr1基因表达者应选择大剂量化疗作为诱导缓解方案或选用非MDR机制相关药物进行治疗[2-4]。
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总之，MDR机制与mdr1基因的表达高度一致，且mdr1基因表达水平的高低与难治程度及复发有关。现已证实， mdr1基因编码产生的P糖蛋白(Pgp)可将细胞内的药物泵出到细胞外，同时还可阻止细胞膜上的药物进入细胞内，从而降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。目前，已有多种药物可以逆转MDR，但逆转剂必须用于那些确由Pgp介导的MDR患儿，因此，检测mdr1基因表达是前提条件。由于mdr1基因表达没有确定的基因突变或重排，临床筛查难以在DNA水平上完成。 半定量RT-PCR技术操作简单，重复性好，且有良好的特异性和敏感性尤适用于低表达标本的检测，对临床选择及修正化疗方案和判断预后具有一定的指导意义，也为逆转剂的应用提供了理论依据。
参考文献
1，Pirker R, Wallner J, Geissler K,et al.MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia.J Natl Cancer Inst,1991,183:708-712.
, http://www.100md.com
2，Noonan KE, Beck C,Holzmayer TA,et al. Quantitation analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160-7164.
3，Sato H,Preisler H,Day R,et al. MDR1 transcript levels as an indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia. Br J Haematol, 1990,75:340-345.
4，Haber DA. Multidrug resistance(MDR1) in leukemia: is time to test? Blood,1992,79:295-298.
(收稿日期：1999-07-08), 百拇医药
单位：周东风(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；孟浦(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；金润铭(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；费洪宝(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科)；李立家(武汉大学生命科学院遗传研究室)
关键词：
中华儿科杂志000525 随着联合化疗的应用，儿童急性白血病的疗效已有极大提高，但仍有部分患儿达不到完全缓解或缓解后易复发。多年的研究发现，白血病细胞多药耐药性 (multidrug resistance, MDR)是白血病难以获得良好疗效的障碍。多药耐药基因(mdr1)的扩增和过度表达所引起的MDR是其中的一个重要机制[1]。我们以半定量逆转录聚合酶链反应 (reverse transcription polymerase reaction, RT-PCR)技术检测了33例儿童急性白血病细胞中mdr1 mRNA基因的表达，初步探讨了其与临床耐药的关系。
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对象
小儿急性白血病 33例均符合 FAB的诊断标准。33例患儿共检测骨髓标本58份，其中 23份为初治时留取的骨髓，27份为诱导缓解后留取的骨髓，另8份难治性复发患儿于诱导化疗4个疗程后或复发时留取的骨髓。10例正常小儿的外周血作为对照。
方法
1.细胞总RNA提取：按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。
2.逆转录 RNA合成 cDNA：30 μl反应体系中含RNA 1 μg， 3 μg随机引物和200 U 的MMLV(小鼠白血病病毒)逆转录酶，于42℃水浴反应1 h。
3.PCR 反应：50 μl反应体系含10 μl 的 5×buffer，2 μl 的 0.25 mmol/L dNTPs。mdr1和β2M引物各 50 pmol，逆转录产物 cDNA 150 ng，Taq酶 1 U混匀。94℃变性 40 s，50℃退火 50 s，72℃延伸 70 s，循环扩增30个周期，最后1次延伸时间为10 min。mdr1引物序列为5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG(2596-2615),3′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-5′， 扩增片段为 157 bp。为消除实验误差设β2M mRNA为 mdr1 mRNA检测的内标，序列为5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ (1543-1562),3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-5′，扩增片段为114 bp[2]。
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4.mdr1 基因半定量：以 pBR322 DNA/MspI作为 DNA分子量标记，取10 μl电泳产物于2%琼脂糖凝胶上70 V电泳1 h，置紫外检测仪上观察、照相。底片置激光密度扫描仪上定量。计算mdr1/β2M比值来表示mdr1 的表达水平。统计学处理采用χ2和t检验。
结果
1.mdr1基因RT-PCR结果：10例正常小儿外周血对照标本未见mdr1基因扩增带,仅见一条β2M基因扩增带。Mdr1基因阳性表达患儿则可见强弱不等的mdr1和β2M基因2条扩增带 。
2.33例患儿mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值结果:复发难治组患儿的mdr1基因阳性率及mdr1/β2M比值明显高于初治组和诱导缓解组,差异有非常显著意义(表1)。
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3.mdr1基因表达与临床的关系：23份初治患儿有4例mdr1阳性，其中2份经诱导化疗不缓解，余19份 mdr1阴性患儿仅1例不缓解，缓解率达95% 。27份诱导化疗缓解后的患儿有8例mdr1表达阳性，其中5份患儿逐渐复发，mdr1基因表达更加增强。复发难治组仅1份mdr1表达阴性，余7份患儿mdr1基因持续表达，化疗效果差，缓解率低。仅有1份mdr1阳性表达患儿在更换化疗方案后再次获得缓解。
表1 33例白血病58份骨髓标本mdr1
表达结果及比较(
±s) 组别份数
mdr1阳性份数(%)
mdr1/β2M
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①初治患儿组
23
4(17)
0.34±0.11
②诱导缓解组
27
8(30)
0.36±0.15
③复发难治组
8
7(88)
0.78±0.21
注：三组mdr1表达阳性率比较：①与②比较：χ2=1.019 9，P>0.5；①与③比较：χ2=12.743 8，P<0.005；②与③比较：χ2=8.439 4，P<0.005；三组mdr1/β2M值比较：①与②比较：t=0.499 2，P>0.5；①与③比较：t=5.5 821,P<0.001;②与③比较：t=5.529 9,P<0.001 讨论
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本研究对 33 例急性白血病患儿化疗前后及复发前后进行了短期动态检测，发现急性白血病患儿初治时即可检测出mdr1基因表达。这种原发性mdr1基因表达，有人认为可能是在转化为急性白血病过程中的基因突变所致[3,4]，是导致部分患儿不能获得缓解的主要原因。在对诱导缓解组患儿的随访检测时发现5例逐渐复发的患儿其 mdr1基因表达亦增强，提示在诱导缓解后的巩固治疗中药物产生了MDR。mdr1基因阳性表达患儿其化疗疗效差，易复发，缓解率明显低于mdr1基因阴性患儿。因此，小儿急性白血病的化疗效果及预后与 mdr1基因的表达水平密切相关，mdr1基因表达增加是不良预后的一个重要因素[2]。
然而，1例经常规诱导化疗不缓解的初治mdr1阳性表达患儿和1例复发患儿经加大化疗剂量和更换化疗药物后获得缓解，提示mdr1基因表达增高并非对所有化疗药物耐药，且复发的难治患儿中有1例mdr1基因表达阴性，从而说明mdr1表达差异不能解释所有的临床白血病耐药。但初治患儿mdr1基因阳性表达可作为常规化疗疗效差的一个指标，而且，对确有mdr1基因表达者应选择大剂量化疗作为诱导缓解方案或选用非MDR机制相关药物进行治疗[2-4]。
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总之，MDR机制与mdr1基因的表达高度一致，且mdr1基因表达水平的高低与难治程度及复发有关。现已证实， mdr1基因编码产生的P糖蛋白(Pgp)可将细胞内的药物泵出到细胞外，同时还可阻止细胞膜上的药物进入细胞内，从而降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。目前，已有多种药物可以逆转MDR，但逆转剂必须用于那些确由Pgp介导的MDR患儿，因此，检测mdr1基因表达是前提条件。由于mdr1基因表达没有确定的基因突变或重排，临床筛查难以在DNA水平上完成。 半定量RT-PCR技术操作简单，重复性好，且有良好的特异性和敏感性尤适用于低表达标本的检测，对临床选择及修正化疗方案和判断预后具有一定的指导意义，也为逆转剂的应用提供了理论依据。
参考文献
1，Pirker R, Wallner J, Geissler K,et al.MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia.J Natl Cancer Inst,1991,183:708-712.
, http://www.100md.com
2，Noonan KE, Beck C,Holzmayer TA,et al. Quantitation analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160-7164.
3，Sato H,Preisler H,Day R,et al. MDR1 transcript levels as an indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia. Br J Haematol, 1990,75:340-345.
4，Haber DA. Multidrug resistance(MDR1) in leukemia: is time to test? Blood,1992,79:295-298.
(收稿日期：1999-07-08), 百拇医药