脑缺氧缺血新生大鼠海马组织中c-Fos基因的表达与细胞凋亡的相关性初探
作者：丁艳洁 汤云珍 蒋犁 李海浪 黄晓明 曾凡杰
单位：丁艳洁(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)曱；汤云珍(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；蒋犁(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；李海浪(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；黄晓明(南京铁道医学院科研所分子生物学研究室)；曾凡杰(南京铁道医学院放射免疫中心)
关键词：
中华儿科杂志000520 以c-Fos为代表的早基因家族，其蛋白产物作为转录因子可调节一系列后期基因的表达，从而产生较为持久的细胞反应。目前认为c-Fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一[1]。本实验通过观察新生大鼠脑缺氧缺血后，海马组织中c-Fos基因的表达及后期发生的细胞凋亡，探讨两者间的相关性。
材料与方法
, 百拇医药
1. 动物模型制作[2]：取同窝7日龄SD大鼠(n=44只)，体重(12.4±2.4)g。按照Rice方法制作脑缺氧缺血模型。设假手术组为对照组。于相应时间点断头取脑，游离脑海马组织，迅速置于液氮中保存。
2. RNA的提取与扩增[3]：取缺氧后0、1、2、3、4 h及对照组大鼠的脑海马组织，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA(提取液tripure购自Boenriger mannheimgs公司)，然后以随机六核苷酸为引物进行逆转录扩增(逆转录酶MLV，购自Promega公司)。模板量及循环数经检测均在线性范围内。以β-actin作为内参照物同时进行扩增。扩增产物进行1.7%琼脂糖凝胶电泳，结果由Strom 860同位素激光扫描仪分析。
3. DNA提取及分析：缺氧后18 h和3 、5、7d与对照组大鼠脑海马组织，用酚-氯仿抽提法提取细胞基因组DNA，琼脂糖电泳后紫外线灯下观察拍照。
, 百拇医药
结果
1. RT-PCR：电泳后用Strom 860分析仪分析不同条带的光密度值，用待测基因与内参的比值进行半定量。结果发现，正常脑海马组织中c-Fos呈低水平表达(9±4)，缺氧缺血后c-Fos的mRNA呈一过性升高(15±8)，以缺氧后0～1 h为最明显(31±7)(t=2.31,P<0.05)，2～4 h迅速回落至基础水平。
2. DNA分析：对照组与结扎对侧脑海马组织(右侧)自始至终均无“梯带”产生。结扎侧脑海马组织在18 h和3 d也未检测到凋亡，而于5～7 d结扎侧脑海马组织均出现明显的“梯带”，提示海马组织细胞大量迟发性死亡，且以凋亡为主。
讨论
临床上可见窒息新生儿复苏后短时间内一般情况相对正常，而于数小时后出现迟发性脑损害的现象，动物实验证实了这一点。Hill等 [4] 对新生大鼠缺氧缺血后的脑组织DNA进行同位素标记电泳及原位末端标记检测，发现在较为温和的缺氧条件下(缺氧90 min)，凋亡细胞增加不明显，而于严重缺氧条件(缺氧2或3 h)后18 h检测到脑皮质、海马、纹状体、丘脑内凋亡细胞增多，电泳出现“梯带”。24 h凋亡细胞增多更为明显，并且凋亡细胞数随缺氧程度增加而增加。国内蒋犁等[2]用原位末端标记技术观察到类似现象。本实验亦证实缺氧缺血后期脑细胞发生凋亡。于缺氧后5 d始检测到明显的DNA “梯带”，说明损伤后期海马细胞死亡较多，且主要表现为凋亡形式。本实验中发现凋亡细胞增多的时间晚于国内外其他一些研究结果(多以24～48 h为主)，考虑由以下两方面因素造成：(1)所采用的动物种属、成熟度及模型的制作方法有差异，本实验所采用的7日龄大鼠其成熟度相当于人类新生婴儿的水平，较成年动物对于缺氧的耐受性为强。(2)相对于TUNEL法，本实验所采用的DNA电泳方法敏感度不高。另外，本实验采用溴乙啶标记较同位素标记其敏感性亦低得多，但此种方法特异性好，假阳性率低，能较好的达到实验目的，即由本实验可得出结论：脑缺氧缺血损伤后期，脑海马组织内确实发生了迟发性的细胞凋亡。
, http://www.100md.com
探讨缺氧缺血等外界因素究竟由何种途径引致细胞自杀机制的启动是本实验的主要目的之一。本实验发现，正常情况下脑海马组织中c-Fos mRNA呈低水平表达，凋亡细胞数在正常范围内，用电泳方法检测不到。而在缺氧缺血后，脑海马组织中c-Fos的mRNA呈现一过性升高，并很快接近基础水平，这与国外研究结果相似。与之相应，在缺氧缺血后晚期，用电泳方法可检测到脑海马组织DNA降解为“梯带”，提示此时脑海马组织中出现大量凋亡细胞。由此可见，缺氧缺血后早期c-Fos的表达可能通过某种途径介导了后期的细胞凋亡。然而，缺氧缺血后c-fos基因表达的真实意义仍未完全清楚，文献报告的结论中有些是相互矛盾的，因此，尚需进一步深入研究。但是，脑缺氧缺血后诱导c-fos基因在脑内迅速而短暂的表达，是对缺氧缺血反应的敏感标记，可以作为研究脑缺氧缺血后细胞代谢的指标和测定药物对脑缺氧缺血干预作用的方法，具有较大的实用价值。
参考文献
1，Akins PT, Liu PK, Hsu CY. Immediate early gene expression in reponse to cerebral ischemia: friend or foe? Stroke,1996,27:1682-1687.
, 百拇医药
2，蒋犁，汤云珍，黄晓明，等.新生大鼠脑细胞凋亡与缺氧、缺血两因素析因研究.中华儿科杂志，1998，36：408-411.
3，Gillardon F, Lenz C, Waschke KF, et al. Altered expression of Bcl-2,Bcl-x,Bax and c-Fos colocalizes with DAN fragmentation and ischemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Mol Brain Res, 1996,40:254-260.
4，Hill IE, MacManus JP, Rasquinha I, et al. DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia-ischemia in the neonatal rat. Brain Res,1995,676:398-403.
(收稿日期：1999-04-28), 百拇医药
单位：丁艳洁(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)曱；汤云珍(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；蒋犁(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；李海浪(210009 南京铁道医学院附属医院儿科)；黄晓明(南京铁道医学院科研所分子生物学研究室)；曾凡杰(南京铁道医学院放射免疫中心)
关键词：
中华儿科杂志000520 以c-Fos为代表的早基因家族，其蛋白产物作为转录因子可调节一系列后期基因的表达，从而产生较为持久的细胞反应。目前认为c-Fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一[1]。本实验通过观察新生大鼠脑缺氧缺血后，海马组织中c-Fos基因的表达及后期发生的细胞凋亡，探讨两者间的相关性。
材料与方法
, 百拇医药
1. 动物模型制作[2]：取同窝7日龄SD大鼠(n=44只)，体重(12.4±2.4)g。按照Rice方法制作脑缺氧缺血模型。设假手术组为对照组。于相应时间点断头取脑，游离脑海马组织，迅速置于液氮中保存。
2. RNA的提取与扩增[3]：取缺氧后0、1、2、3、4 h及对照组大鼠的脑海马组织，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA(提取液tripure购自Boenriger mannheimgs公司)，然后以随机六核苷酸为引物进行逆转录扩增(逆转录酶MLV，购自Promega公司)。模板量及循环数经检测均在线性范围内。以β-actin作为内参照物同时进行扩增。扩增产物进行1.7%琼脂糖凝胶电泳，结果由Strom 860同位素激光扫描仪分析。
3. DNA提取及分析：缺氧后18 h和3 、5、7d与对照组大鼠脑海马组织，用酚-氯仿抽提法提取细胞基因组DNA，琼脂糖电泳后紫外线灯下观察拍照。
, 百拇医药
结果
1. RT-PCR：电泳后用Strom 860分析仪分析不同条带的光密度值，用待测基因与内参的比值进行半定量。结果发现，正常脑海马组织中c-Fos呈低水平表达(9±4)，缺氧缺血后c-Fos的mRNA呈一过性升高(15±8)，以缺氧后0～1 h为最明显(31±7)(t=2.31,P<0.05)，2～4 h迅速回落至基础水平。
2. DNA分析：对照组与结扎对侧脑海马组织(右侧)自始至终均无“梯带”产生。结扎侧脑海马组织在18 h和3 d也未检测到凋亡，而于5～7 d结扎侧脑海马组织均出现明显的“梯带”，提示海马组织细胞大量迟发性死亡，且以凋亡为主。
讨论
临床上可见窒息新生儿复苏后短时间内一般情况相对正常，而于数小时后出现迟发性脑损害的现象，动物实验证实了这一点。Hill等 [4] 对新生大鼠缺氧缺血后的脑组织DNA进行同位素标记电泳及原位末端标记检测，发现在较为温和的缺氧条件下(缺氧90 min)，凋亡细胞增加不明显，而于严重缺氧条件(缺氧2或3 h)后18 h检测到脑皮质、海马、纹状体、丘脑内凋亡细胞增多，电泳出现“梯带”。24 h凋亡细胞增多更为明显，并且凋亡细胞数随缺氧程度增加而增加。国内蒋犁等[2]用原位末端标记技术观察到类似现象。本实验亦证实缺氧缺血后期脑细胞发生凋亡。于缺氧后5 d始检测到明显的DNA “梯带”，说明损伤后期海马细胞死亡较多，且主要表现为凋亡形式。本实验中发现凋亡细胞增多的时间晚于国内外其他一些研究结果(多以24～48 h为主)，考虑由以下两方面因素造成：(1)所采用的动物种属、成熟度及模型的制作方法有差异，本实验所采用的7日龄大鼠其成熟度相当于人类新生婴儿的水平，较成年动物对于缺氧的耐受性为强。(2)相对于TUNEL法，本实验所采用的DNA电泳方法敏感度不高。另外，本实验采用溴乙啶标记较同位素标记其敏感性亦低得多，但此种方法特异性好，假阳性率低，能较好的达到实验目的，即由本实验可得出结论：脑缺氧缺血损伤后期，脑海马组织内确实发生了迟发性的细胞凋亡。
, http://www.100md.com
探讨缺氧缺血等外界因素究竟由何种途径引致细胞自杀机制的启动是本实验的主要目的之一。本实验发现，正常情况下脑海马组织中c-Fos mRNA呈低水平表达，凋亡细胞数在正常范围内，用电泳方法检测不到。而在缺氧缺血后，脑海马组织中c-Fos的mRNA呈现一过性升高，并很快接近基础水平，这与国外研究结果相似。与之相应，在缺氧缺血后晚期，用电泳方法可检测到脑海马组织DNA降解为“梯带”，提示此时脑海马组织中出现大量凋亡细胞。由此可见，缺氧缺血后早期c-Fos的表达可能通过某种途径介导了后期的细胞凋亡。然而，缺氧缺血后c-fos基因表达的真实意义仍未完全清楚，文献报告的结论中有些是相互矛盾的，因此，尚需进一步深入研究。但是，脑缺氧缺血后诱导c-fos基因在脑内迅速而短暂的表达，是对缺氧缺血反应的敏感标记，可以作为研究脑缺氧缺血后细胞代谢的指标和测定药物对脑缺氧缺血干预作用的方法，具有较大的实用价值。
参考文献
1，Akins PT, Liu PK, Hsu CY. Immediate early gene expression in reponse to cerebral ischemia: friend or foe? Stroke,1996,27:1682-1687.
, 百拇医药
2，蒋犁，汤云珍，黄晓明，等.新生大鼠脑细胞凋亡与缺氧、缺血两因素析因研究.中华儿科杂志，1998，36：408-411.
3，Gillardon F, Lenz C, Waschke KF, et al. Altered expression of Bcl-2,Bcl-x,Bax and c-Fos colocalizes with DAN fragmentation and ischemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Mol Brain Res, 1996,40:254-260.
4，Hill IE, MacManus JP, Rasquinha I, et al. DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia-ischemia in the neonatal rat. Brain Res,1995,676:398-403.
(收稿日期：1999-04-28), 百拇医药