丁咯地尔盐酸盐治疗新生鼠缺氧缺血性脑病的实验研究
作者：栾佐 高锦凌 马波 徐世侠 尹国才 屈素清
单位：栾佐(100037 北京, 海军总医院儿科)；高锦凌(100037 北京, 海军总医院儿科)；马波(100037 北京, 海军总医院儿科)；徐世侠(100037 北京, 海军总医院儿科)；尹国才(100037 北京, 海军总医院儿科)；屈素清(100037 北京, 海军总医院儿科)
关键词：大鼠；脑缺氧；脑缺血；吡咯烷类
中华儿科杂志000514 【摘要】 目的 观察丁咯地尔盐酸盐(FZ)治疗新生鼠缺氧缺血性脑病(HIE)的疗效,寻求治疗HIE的有效手段。方法 建立新生鼠HIE模型,将104只新生鼠分为13组,观察不同时间FZ治疗后HIE鼠脑灌流状态、脑花生四烯酸、自由基清除、细胞内游离钙代谢，以及脑组织病理变化。 结果 治疗组用FZ前后颈动脉血压无变化,缺血侧半球软脑膜血管扩张占18.6 %～22.7 %,较对侧正常半球软脑膜血管扩张程度大2倍,脑组织TXB2/PGI2比值、胞内游离钙含量减少,超氧化物歧化酶(SOD)活性增加。电镜下神经细胞基本恢复正常。结论 FZ可有效恢复缺血区脑灌流,而不发生脑内窃血现象,同时还可通过提高SOD活性及钙离子弱拮抗作用,减轻或避免再灌注损伤。治疗新生儿HIE尚需进一步做临床研究。
, http://www.100md.com
An experimental study on treating newborn rats with hypoxic ischemic encephalapathy with fonzylane
LUAN Zuo, GAO Jinling, MA Po,et al.
Department of Pediatrics, Naval General Hospital, Beijing 100037，China
【Abstract】 Objective To observe the effects of fonzylane on newborn rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIE) and search for an effective therapy to deal with HIE. Methods Models of newborn rats with HIE were established, and 104 rats were devided into 13 groups. After treatment with fonzylane,the blood perfusion, pathology, arachidonic acid content, free radical clearance, and metabolism of intracellular free calcium in the brain of rats were investigated. Results Carotid arterial blood pressures of rats were not different before and after applying fonzylane. The arteriolae of the soft meninges of ischemic cerebral hemisphere were dilated by 18.6 %～22.7 %,which were two times more than those of the other normal cerebral hemisphere; the blood circulation was also significantly accelerated; both the ratio of TXB2/PGI2 and the content of the endocellular free calcium decreased; but the SOD activity of cerebrum increased. The neurocytes were observed almost recovered under the electronmicroscope. Conclusion The blood perfusion of the ischemic region of cerebrum could be significantly recovered by using fonzylane. There was no intracerebral steal phenomenon. In the mean time fonzylane, as a mild calcium antagonist and activitor of SOD, could reduce or might avoid the reperfusion damage. The results indicated that further clinical investigations on the treatment of HIE neonates with Fonaylane are needed.
, 百拇医药
【Key words】 Rats; Cerebral anoxia; Cerebral ischemia; Pyrrolidines
缺血缺氧性脑病(HIE)病死率和致残率高,临床上除脱水剂可减轻脑水肿外,余疗效尚存争议[1]。为此,本研究选择丁咯地尔盐酸盐(fonzylane，Fz)治疗新生鼠HIE模型,试图寻求一种既能纠正脑缺血状态,又不导致脑再灌注损伤的血管扩张药物。
材料及方法
一、动物
7日龄Wistar大鼠104只(中国医学科学院实验动物研究所提供), 雌雄不限,体重12～20 g。共分13组，其中对照组8只；另根据HIE病程和治疗时间分为2、4、12、24、72 h和7、10 d HIE治疗组和(或)HIE模型组,每组8只，计12组。
, 百拇医药
二、方法
1.HIE模型的制作:氯胺酮麻醉后结扎鼠左侧颈总动脉,术毕2 h后置容器中持续吸入8%氧、92%氮混合气体,流速2.5 ml/min,以钠石灰吸收二氧化碳[2]。
2.血压监测: 氯胺酮麻醉后颈动脉插管，监测给FZ前后大鼠血压60 min,用FZ剂量为5 mg/kg及10 mg/kg。
3.脑灌流观测:暴露软脑膜,以正常侧大脑半球为对照,采用WX-7530B型微循环显微镜摄录软脑膜微循环血流速度及血管直径,并经清华大学生物工程系MCIMPS-C微循环图像处理及参数测量系统处理分析。
4.脑病理学检查:按常规方法制得超簿切片,行醋酸铀-柠檬酸铅双染,采用philips CM-100型透射电镜观察。
, 百拇医药
5.脑代谢指标的检测:(1)花生四烯酸代谢: 称重脑组织后置液氮中待测,采用东亚免疫技术研究所的血栓素B2(TXB2)和6-酮基前列环素F1α(6-Keto-PGF1α)试剂盒检测,具体操作按说明书进行。 (2)自由基清除酶:乙醇-氯仿法提取脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD),采用临苯三酚-硝基四氮唑蓝法测定。(3)脑细胞内游离钙:于中国医学科学院药物研究所采用Fura-2/AM荧光法检测[3]。
6.数据处理:计量资料采用方差分析和t检验。
结果
一、血压及脑灌流状况
用药前后大鼠颈动脉压无显著变化(P>0.05), 软脑膜微小血管扩张度对照组(7.5±2.9)%；5 mg/kg剂量治疗组 (23±10)%;10 mg/kg剂量治疗组(19±8)%(F=9.73)。治疗组大鼠左侧软脑膜微小血管扩张幅度较对侧增强(P<0.01),治疗组间差异无显著性(P>0.05),见表1。
, 百拇医药
表1 各组大鼠用药前后软脑膜微小血管管径变化(
±s) 组别
鼠数
(只)
管径大小
之差(nm)
管径扩张
度(%)
颈动脉压(mm Hg)
舒张压
收缩压
对照组
, 百拇医药
8
0.9±0.4
7.5±2.9
90.0±1.8
128.0±1.1
治疗组
5 mg/kg
8
2.4±0.6*
22.7±9.6*
89.0±2.3
129.0±2.2
, 百拇医药
10 mg/kg
8
2.2±0.7*
18.6±7.2*
90.8±2.1
130.0±2.7
F值
15.92
9.73
2.37
3.29
*与对照组相比，P<0.01 二、脑代谢指标
, 百拇医药
各指标及结果见表2。(1)各HIE组大鼠胞内游离钙(Ca2+)水平均极显著高于对照组(P<0.05～0.001),治疗组72 h组与HIE组水平相当(P>0.05),其余各治疗组较HIE组均明显降低(P<0.05～0.01)。(2)脑组织TXB2/6-Keto-PGF1α比值部分HIE组较对照组增高(P<0.05～0.01);各治疗组则较HIE组显著降低(P<0.05～0.01)。(3)HIE组脑组织SOD含量低于对照组(P<0.05～0.01),而各治疗组又显著高于各HIE组(P<0.05～0.005)，并与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表2 各组大鼠脑代谢指标的检测结果(±s) 组别
鼠数
(只)
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TXB2/
6-Keto-PGF1α
SOD
(U/mg)
Ca2+
(μg/mg)
对照组
8
0.184±0.058
16.3± 0.6
160± 9
治疗4h组
, http://www.100md.com
8
0.208±0.050*
71.3±12.9*
557± 87*
HIE4h组
8
0.982±0.118
50.2± 5.0
840±132
治疗12 h组
8
, 百拇医药 0.202±0.076*
45.5± 2.7**
289± 64*
HIE12 h组
8
0.712±0.215
43.5± 3.9
409± 70
治疗24 h组
8
0.096±0.043*
, 百拇医药
40.2± 5.1**
186± 25**
HIE24 h组
8
0.273±0.091
36.1± 3.9
237± 28
治疗72 h组
8
0.063±0.018**
33.1± 2.9**
, 百拇医药
424± 54
HIE72 h组
8
0.122±0.036
21.8± 4.8
465±125
F值
84.62
28.83
60.08
注：与HIE组比较，*P<0.01，**P<0.05 三、病理检查
, http://www.100md.com
电镜检查HIE组大鼠脑组织间质水肿,神经毡中出现明显空泡区域,部分神经元细胞质及内质网降解成大空泡状,明显受损改变(图1)。治疗24 h组脑组织病变稍有减轻,小毛细血管周围仍可见轻度水肿性病变。治疗7 d组神经元细胞结构基本完整,神经毡结构致密,未见水肿或空泡性改变,偶见数个髓鞘。治疗10 d组的细胞核圆整,细胞器丰富,轴突、细胞间连接及毛细血管基本正常(图2)。
图1 神经元细胞旁出现空泡和水肿区域
图2 3个形态基本正常的神经元结构
讨论
HIE时脑组织发生缺血缺氧性损伤。因此,首要的是恢复和改善脑血液灌流,增加氧供。本研究结果表明,HIE大鼠Fz治疗前病损处软脑膜微小血管(颈内动脉供应)内血流减少或中断。治疗后对侧半球软脑膜血管仅轻度扩张,而患侧半球软脑膜血管扩张程度较之大2倍,血流速度亦明显增加。可见,Fz能有效扩张缺血区脑组织微小血管,恢复血液灌流。它不仅有效地抑制缺血区的α-肾上腺素能受体产生的血管收缩效应,还能抑制因ADP或肾上腺素诱导的血小板聚集,提高红细胞膜的变形能力和携氧能力,降低血液粘滞度,改善缺血区的病态微循环状态[4]。Fz对缺血区域脑组织再灌注的优势效应还可能与以下因素有关:(1)本研究证实，Fz有效剂量及其增加一倍的情况下，大鼠颈动脉血压无显著变化。Fz降，低缺血部位脑血管阻力的同时维持颈动脉血压不变,势必增加缺血部位脑灌注压,防止脑窃血现象发生。(2)Fz具有弱的钙离子拮抗作用[4],本治疗组脑细胞内游离钙水平较HIE组降低可减轻钙内流造成的血管痉挛。(3)治疗组大鼠应用Fz后，脑组织TXB2/6-Keto-PG F1α比值较HIE 组明显降低,提示Fz抑制花生四稀酸单向转化为TXA2,防止缺血区血管痉挛与血栓形成。
, 百拇医药
脑缺血后再灌注诱发氧自由基代谢和钙内流是延长和加重缺血性脑损伤的重要环节[5，6]。本研究HIE组大鼠随着时间的推移，表现为脑组织SOD含量较对照组减少, TXB2/PGF1α比值和胞内游离钙含量明显增加,即与此有关。Fz使治疗组大鼠SOD较HIE组增高,TXB2/PGF1α比值和胞内钙亦较HIE组显著减少, Fz治疗24 h后神经细胞线粒体、内质网、神经毡、轴突及髓鞘等逐渐恢复。提示尽管Fz促使缺血区脑组织再灌注,不但未加重再灌注损伤,而且通过提高氧自由基清除能力和钙离子拮抗作用，减轻再灌注损伤,挽救缺血区濒临死亡的神经细胞。在HIE缺乏有效治疗药物情况下,Fz将是一种有希望的药物，该药应用于成人毒副作用甚少，安全性很好。但应用于新生儿尚需进一步临床研究。
参考文献
1，赵时敏. 新生儿缺氧缺血性脑病的防治及研究方向. 中华儿科杂志, 1997，35:59-60.
, 百拇医药
2，吴婉芳,徐放生,张莉莉，等. 建立新生儿缺氧缺血性脑病鼠模型. 新生儿科杂志,1992，7:265-267.
3，张均田,李锡明,石成璋，等. 用FURA-2/AM测定细胞内游离浓度的方法. 中国药学杂志,1991，26:655-658.
4，Cilssold SP, Lynch S, Sorkin EM. Buflomedil. A review of its pharmacodydamic and pharmacokinetic properties,and therapeutic efficacy in peripheral vascular disease. Drugs, 1987，33:430-560.
5，Hossmann KA. Free radicals and reperfusion jijury. Shock,1997，8:95-101.
6，Fukuda S, Harada k,Kunimatsu M, et al. Postischemic reperfusion induces alpha-fodrin proteolysis by m-calpain in the synaptosome and nucleus in rat brain. J Neurochem， 1998，70:2526-2532.
(收稿日期：1999-05-12), 百拇医药
单位：栾佐(100037 北京, 海军总医院儿科)；高锦凌(100037 北京, 海军总医院儿科)；马波(100037 北京, 海军总医院儿科)；徐世侠(100037 北京, 海军总医院儿科)；尹国才(100037 北京, 海军总医院儿科)；屈素清(100037 北京, 海军总医院儿科)
关键词：大鼠；脑缺氧；脑缺血；吡咯烷类
中华儿科杂志000514 【摘要】 目的 观察丁咯地尔盐酸盐(FZ)治疗新生鼠缺氧缺血性脑病(HIE)的疗效,寻求治疗HIE的有效手段。方法 建立新生鼠HIE模型,将104只新生鼠分为13组,观察不同时间FZ治疗后HIE鼠脑灌流状态、脑花生四烯酸、自由基清除、细胞内游离钙代谢，以及脑组织病理变化。 结果 治疗组用FZ前后颈动脉血压无变化,缺血侧半球软脑膜血管扩张占18.6 %～22.7 %,较对侧正常半球软脑膜血管扩张程度大2倍,脑组织TXB2/PGI2比值、胞内游离钙含量减少,超氧化物歧化酶(SOD)活性增加。电镜下神经细胞基本恢复正常。结论 FZ可有效恢复缺血区脑灌流,而不发生脑内窃血现象,同时还可通过提高SOD活性及钙离子弱拮抗作用,减轻或避免再灌注损伤。治疗新生儿HIE尚需进一步做临床研究。
, http://www.100md.com
An experimental study on treating newborn rats with hypoxic ischemic encephalapathy with fonzylane
LUAN Zuo, GAO Jinling, MA Po,et al.
Department of Pediatrics, Naval General Hospital, Beijing 100037，China
【Abstract】 Objective To observe the effects of fonzylane on newborn rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIE) and search for an effective therapy to deal with HIE. Methods Models of newborn rats with HIE were established, and 104 rats were devided into 13 groups. After treatment with fonzylane,the blood perfusion, pathology, arachidonic acid content, free radical clearance, and metabolism of intracellular free calcium in the brain of rats were investigated. Results Carotid arterial blood pressures of rats were not different before and after applying fonzylane. The arteriolae of the soft meninges of ischemic cerebral hemisphere were dilated by 18.6 %～22.7 %,which were two times more than those of the other normal cerebral hemisphere; the blood circulation was also significantly accelerated; both the ratio of TXB2/PGI2 and the content of the endocellular free calcium decreased; but the SOD activity of cerebrum increased. The neurocytes were observed almost recovered under the electronmicroscope. Conclusion The blood perfusion of the ischemic region of cerebrum could be significantly recovered by using fonzylane. There was no intracerebral steal phenomenon. In the mean time fonzylane, as a mild calcium antagonist and activitor of SOD, could reduce or might avoid the reperfusion damage. The results indicated that further clinical investigations on the treatment of HIE neonates with Fonaylane are needed.
, 百拇医药
【Key words】 Rats; Cerebral anoxia; Cerebral ischemia; Pyrrolidines
缺血缺氧性脑病(HIE)病死率和致残率高,临床上除脱水剂可减轻脑水肿外,余疗效尚存争议[1]。为此,本研究选择丁咯地尔盐酸盐(fonzylane，Fz)治疗新生鼠HIE模型,试图寻求一种既能纠正脑缺血状态,又不导致脑再灌注损伤的血管扩张药物。
材料及方法
一、动物
7日龄Wistar大鼠104只(中国医学科学院实验动物研究所提供), 雌雄不限,体重12～20 g。共分13组，其中对照组8只；另根据HIE病程和治疗时间分为2、4、12、24、72 h和7、10 d HIE治疗组和(或)HIE模型组,每组8只，计12组。
, 百拇医药
二、方法
1.HIE模型的制作:氯胺酮麻醉后结扎鼠左侧颈总动脉,术毕2 h后置容器中持续吸入8%氧、92%氮混合气体,流速2.5 ml/min,以钠石灰吸收二氧化碳[2]。
2.血压监测: 氯胺酮麻醉后颈动脉插管，监测给FZ前后大鼠血压60 min,用FZ剂量为5 mg/kg及10 mg/kg。
3.脑灌流观测:暴露软脑膜,以正常侧大脑半球为对照,采用WX-7530B型微循环显微镜摄录软脑膜微循环血流速度及血管直径,并经清华大学生物工程系MCIMPS-C微循环图像处理及参数测量系统处理分析。
4.脑病理学检查:按常规方法制得超簿切片,行醋酸铀-柠檬酸铅双染,采用philips CM-100型透射电镜观察。
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5.脑代谢指标的检测:(1)花生四烯酸代谢: 称重脑组织后置液氮中待测,采用东亚免疫技术研究所的血栓素B2(TXB2)和6-酮基前列环素F1α(6-Keto-PGF1α)试剂盒检测,具体操作按说明书进行。 (2)自由基清除酶:乙醇-氯仿法提取脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD),采用临苯三酚-硝基四氮唑蓝法测定。(3)脑细胞内游离钙:于中国医学科学院药物研究所采用Fura-2/AM荧光法检测[3]。
6.数据处理:计量资料采用方差分析和t检验。
结果
一、血压及脑灌流状况
用药前后大鼠颈动脉压无显著变化(P>0.05), 软脑膜微小血管扩张度对照组(7.5±2.9)%；5 mg/kg剂量治疗组 (23±10)%;10 mg/kg剂量治疗组(19±8)%(F=9.73)。治疗组大鼠左侧软脑膜微小血管扩张幅度较对侧增强(P<0.01),治疗组间差异无显著性(P>0.05),见表1。
, 百拇医药
表1 各组大鼠用药前后软脑膜微小血管管径变化(
±s) 组别鼠数
(只)
管径大小
之差(nm)
管径扩张
度(%)
颈动脉压(mm Hg)
舒张压
收缩压
对照组
, 百拇医药
8
0.9±0.4
7.5±2.9
90.0±1.8
128.0±1.1
治疗组
5 mg/kg
8
2.4±0.6*
22.7±9.6*
89.0±2.3
129.0±2.2
, 百拇医药
10 mg/kg
8
2.2±0.7*
18.6±7.2*
90.8±2.1
130.0±2.7
F值
15.92
9.73
2.37
3.29
*与对照组相比，P<0.01 二、脑代谢指标
, 百拇医药
各指标及结果见表2。(1)各HIE组大鼠胞内游离钙(Ca2+)水平均极显著高于对照组(P<0.05～0.001),治疗组72 h组与HIE组水平相当(P>0.05),其余各治疗组较HIE组均明显降低(P<0.05～0.01)。(2)脑组织TXB2/6-Keto-PGF1α比值部分HIE组较对照组增高(P<0.05～0.01);各治疗组则较HIE组显著降低(P<0.05～0.01)。(3)HIE组脑组织SOD含量低于对照组(P<0.05～0.01),而各治疗组又显著高于各HIE组(P<0.05～0.005)，并与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表2 各组大鼠脑代谢指标的检测结果(
±s) 组别鼠数
(只)
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TXB2/
6-Keto-PGF1α
SOD
(U/mg)
Ca2+
(μg/mg)
对照组
8
0.184±0.058
16.3± 0.6
160± 9
治疗4h组
, http://www.100md.com
8
0.208±0.050*
71.3±12.9*
557± 87*
HIE4h组
8
0.982±0.118
50.2± 5.0
840±132
治疗12 h组
8
, 百拇医药 0.202±0.076*
45.5± 2.7**
289± 64*
HIE12 h组
8
0.712±0.215
43.5± 3.9
409± 70
治疗24 h组
8
0.096±0.043*
, 百拇医药
40.2± 5.1**
186± 25**
HIE24 h组
8
0.273±0.091
36.1± 3.9
237± 28
治疗72 h组
8
0.063±0.018**
33.1± 2.9**
, 百拇医药
424± 54
HIE72 h组
8
0.122±0.036
21.8± 4.8
465±125
F值
84.62
28.83
60.08
注：与HIE组比较，*P<0.01，**P<0.05 三、病理检查
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电镜检查HIE组大鼠脑组织间质水肿,神经毡中出现明显空泡区域,部分神经元细胞质及内质网降解成大空泡状,明显受损改变(图1)。治疗24 h组脑组织病变稍有减轻,小毛细血管周围仍可见轻度水肿性病变。治疗7 d组神经元细胞结构基本完整,神经毡结构致密,未见水肿或空泡性改变,偶见数个髓鞘。治疗10 d组的细胞核圆整,细胞器丰富,轴突、细胞间连接及毛细血管基本正常(图2)。
图1 神经元细胞旁出现空泡和水肿区域
图2 3个形态基本正常的神经元结构
讨论
HIE时脑组织发生缺血缺氧性损伤。因此,首要的是恢复和改善脑血液灌流,增加氧供。本研究结果表明,HIE大鼠Fz治疗前病损处软脑膜微小血管(颈内动脉供应)内血流减少或中断。治疗后对侧半球软脑膜血管仅轻度扩张,而患侧半球软脑膜血管扩张程度较之大2倍,血流速度亦明显增加。可见,Fz能有效扩张缺血区脑组织微小血管,恢复血液灌流。它不仅有效地抑制缺血区的α-肾上腺素能受体产生的血管收缩效应,还能抑制因ADP或肾上腺素诱导的血小板聚集,提高红细胞膜的变形能力和携氧能力,降低血液粘滞度,改善缺血区的病态微循环状态[4]。Fz对缺血区域脑组织再灌注的优势效应还可能与以下因素有关:(1)本研究证实，Fz有效剂量及其增加一倍的情况下，大鼠颈动脉血压无显著变化。Fz降，低缺血部位脑血管阻力的同时维持颈动脉血压不变,势必增加缺血部位脑灌注压,防止脑窃血现象发生。(2)Fz具有弱的钙离子拮抗作用[4],本治疗组脑细胞内游离钙水平较HIE组降低可减轻钙内流造成的血管痉挛。(3)治疗组大鼠应用Fz后，脑组织TXB2/6-Keto-PG F1α比值较HIE 组明显降低,提示Fz抑制花生四稀酸单向转化为TXA2,防止缺血区血管痉挛与血栓形成。
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脑缺血后再灌注诱发氧自由基代谢和钙内流是延长和加重缺血性脑损伤的重要环节[5，6]。本研究HIE组大鼠随着时间的推移，表现为脑组织SOD含量较对照组减少, TXB2/PGF1α比值和胞内游离钙含量明显增加,即与此有关。Fz使治疗组大鼠SOD较HIE组增高,TXB2/PGF1α比值和胞内钙亦较HIE组显著减少, Fz治疗24 h后神经细胞线粒体、内质网、神经毡、轴突及髓鞘等逐渐恢复。提示尽管Fz促使缺血区脑组织再灌注,不但未加重再灌注损伤,而且通过提高氧自由基清除能力和钙离子拮抗作用，减轻再灌注损伤,挽救缺血区濒临死亡的神经细胞。在HIE缺乏有效治疗药物情况下,Fz将是一种有希望的药物，该药应用于成人毒副作用甚少，安全性很好。但应用于新生儿尚需进一步临床研究。
参考文献
1，赵时敏. 新生儿缺氧缺血性脑病的防治及研究方向. 中华儿科杂志, 1997，35:59-60.
, 百拇医药
2，吴婉芳,徐放生,张莉莉，等. 建立新生儿缺氧缺血性脑病鼠模型. 新生儿科杂志,1992，7:265-267.
3，张均田,李锡明,石成璋，等. 用FURA-2/AM测定细胞内游离浓度的方法. 中国药学杂志,1991，26:655-658.
4，Cilssold SP, Lynch S, Sorkin EM. Buflomedil. A review of its pharmacodydamic and pharmacokinetic properties,and therapeutic efficacy in peripheral vascular disease. Drugs, 1987，33:430-560.
5，Hossmann KA. Free radicals and reperfusion jijury. Shock,1997，8:95-101.
6，Fukuda S, Harada k,Kunimatsu M, et al. Postischemic reperfusion induces alpha-fodrin proteolysis by m-calpain in the synaptosome and nucleus in rat brain. J Neurochem， 1998，70:2526-2532.
(收稿日期：1999-05-12), 百拇医药