亚低温防治全身炎症反应综合征
作者：胡皓夫 解启莲 安会波
单位：胡皓夫(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)；解启莲(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)；安会波(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)
关键词：低温，人工；脓毒症综合征；肿瘤坏死因子；胞间粘附分子1；小鼠
中华儿科杂志000603 【摘要】 目的 探讨亚低温能否抑制全身炎症反应综合征(SIRS)，从而阻止多器官功能障碍综合征(MODS)的发生。方法 将96只小鼠随机分成内毒素组、亚低温组、保温组及对照组。采用放射免疫法，分别于注射内毒素(LPS)后1、2、4 h 测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)，并用免疫组化法检测4组动物(4 h)肝、肺血管内皮细胞细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达情况。结果 亚低温组1、2、4 h 的TNF-α含量[(2.0±0.3)、(2.1±0.4)、(2.5±0.5)μg/L]显著低于内毒素组[(4.1±0.4)、(4.1±0.6)、(3.3±0.5) μg/L](P<0.01)，而保温组与内毒素组相比，差异无显著意义 (P>0.05)；亚低温组与保温组在1、2 h时[(2.0±0.3)、(2.1±0.4)μg/L；(4.0±0.30)、(3.8±0.4)μg/L]差异有显著意义 (P<0.01和<0.05)，但4 h未见明显差别[(2.5±0.5)、(2.6±0.5)μg/L](P>0.05)；免疫组化显示亚低温组肝及肺微血管内皮细胞周围的ICAM-1组化染带呈弱阳性，内毒素与保温组呈强阳性表达。结论 亚低温有显著抑制全身炎症反应的作用。提示亚低温可考虑作为防治SIRS的一种措施。
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Mild hypothermia prevents and cures systemic inflammatory response syndrome
HU Haofu, XIE Qilian, AN Huibo.
Intensive Care Unit, The Children's Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050032, China
【Abstract】 Objective To explore the inhibiting effect of mild hypothermia on systemic inflammatory response syndrome (SIRS), thereby to prevent the occurrence of multiple organ dysfunction syndrome(MODS). Methods Ninety-six mice were randomly divided into four groups: the normal control, lipopolysaccharide (LPS), mild hypothermia and temperature preservation. By using the radio-immunity technique, the plasma levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the 4 groups of mice were measured after l, 2 and 4 hours of injection with LPS into mice. Livers and lungs of the mice were collected 4 hours after the injection of LPS for testing the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in vascular endotheliocytes with the immunohistochemistry method. Results The contents of TNF-α in mild hypothermia group after 1,2 and 4 hours of LPS injections [(2.0±0.3), (2.1±0.4) and (2.5±0.5) μg/L, respectively] were significantly lower than those in LPS group [(4.1±0.4), (4.1±0.6) and (3.3±0.5) μg/L, respectively] (P<0.001). While there was no significant difference between LPS and temperature preservation groups (P>0.05). There were marked differences between mild hypothermia and temperature preservation groups after 1 and 2 hours of the LPS injections[(2.0±0.3) and (2.1±0.4) μg/L vs. (4.0±0.3) and (3.8±0.4) μg/L, respectively. P<0.01 and <0.05], but no difference after 4 hours [(2.5±0.5) vs. (2.6±0.5) μg/L, P>0.05]. Immunohistochemistry staining showed that the expression of ICAM-1 surrounding the vascular endotheliocyte of the liver and lung was weakly positive in the mild hypothermia group, but strongly positive in the LPS group and temperature preservation group. Conclusion Mild hypothermia revealed a function of inhibiting SIRS. It suggested that mild hypothermia may be a new method for preventing and curing SIRS.
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【Key words】 Hypothermia, induced; Sepsis syndrome; Tumor necrosis factor; Intercellular adhesion molecule-1; Mice
全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfuction syndrome,MODS)的基础[1]，后者一旦进入器官衰竭期，常难以逆转。因此，如何有效地抑制全身炎症反应，是阻止MODS发生的关键。目前已有的抗炎药物(包括细胞因子的单克隆抗体)疗效均不理想[2]，而目前尚无全面抑制炎症反应的药物。能否以降温的方法来阻止全身炎症的发展，尚未见报道。本研究就亚低温与全身炎症反应的关系作一探讨，期望能对阻止临床MODS的发生有所帮助。
材料和方法
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一、材料
1.动物：KM小鼠96只(河北医科大学动物中心提供)，体重22～28 g，雌雄不限。
2.仪器：L5J电子测温仪(Becton公司)，FT-630Gγ计数仪(北京核医仪器厂)。
3.药物及制剂：内毒素(Ecoli O55)(Bioding公司)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)放免试剂盒(军事医学科学院提供)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，冬眠肌松合剂(氯丙嗪+肌安松)。
二、方法
1.将96只小鼠随机分成4组，即正常对照组(A组)、内毒素组(B组)、亚低温组(C组)、保温组(D组)。B、C、D组小鼠均腹腔注射内毒素(1 mg/kg)造成全身炎症反应综合征模型(预试验6 h后肝、肺病理见多处炎症病灶)。C、D两组均注射冬眠肌松合剂(氯丙嗪2 mg/kg+肌安松50 μg/kg)，调节室温并辅以冰袋及烘灯，使C组肛温降至33～34℃，D组肛温保持在36.5℃以上。分别于注射内毒素后1、2、4 h取血0.8 ml，离心后留取血清0.3～0.4 ml，-20℃冰箱内保存，待测TNF-α含量。最后1次采血(4 h)后取动物肝、肺，立即置于液氮内，待测ICAM-1。
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2.TNF-α检测：采用放射免疫分析法测定血清TNF-α含量。按常规设置空白对照管、标准零管、标准样品管1～5及样品管，依说明添加样品、125I-TNF、抗TNF抗体(TNF-Ab)及血清后，充分混合，置4℃ 24 h,加入分离剂摇匀，放室温下20 min，4℃离心(3 500 r/min)20 min，弃上清液后经γ计数仪测定各管放射性，并计算TNF-α值。
3.ICAM-1检测：本试剂盒内主要有：GoICAM-1/IgG1、aGoIgG/Bio、s-A/HRP、兔血清等，采用冰冻切片免疫组化S-P法检测各组动物4 h后肝肺血管内皮上ICAM-1的表达。
4.统计学处理
所有数据均采用均数±标准差(
±s)表示，采用SAS软件处理，样本均数间分别采用Dunnett法及q 检验判定均数差异显著性。
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结果
一、 TNF-α含量的测定
结果显示：B、C 、D各组TNF-α含量与A组相比，差异均有显著意义; B组与C组1、2、4 h各时间段TNF-α含量比较，差异均有显著意义(P<0.01),C组与D组于1、2 h TNF-α含量比较，差异有显著性意义(P<0.01和<0.05)；而与4 h组比较，差异无显著意义；B组与D组差异无显著意义(表1)。提示降温有抑制TNF-α表达与释放的作用，而保温组无显著抑制表现，表明冬眠肌松合剂对TNF-α无抑制作用。
表1 4组小鼠注射内毒素后不同时间血清TNF-α
含量比较(±s,μg/L) 组别
鼠数
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(只)
注射内毒素后时间(h)
1
2
4
对照组(A)
24
1.1±0.4
1.1±0.4
1.1±0.4
内毒素组(B)
24
4.1±0.4*
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4.1±0.6*
3.3±0.5*
亚低温组(C)
24
2.0±0.3*▲
2.1±0.4*▲
2.5±0.5*▲
保温组(D)
24
4.0±0.3*△
3.8±0.4*△△
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2.6±0.5*
注：与A组比较，* P<0.01；与B组比较，▲ P<0.01；与C组比较，△ P<0.01，△△ P<0.05 二、 ICAM-1的表达
通过对4组动物肝、肺ICAM-1的检测可以看出，降温组动物肝肺血管周围的黄色染带明显减弱，而内毒素组与保温组均呈强阳性表达。
讨论
亚低温对急性脑损伤的保护作用已为临床及基础研究广泛关注[3-5]，能否推广到SIRS和MODS，为临床防治SIRS或MODS提供新途径，尚需证实。从理论上说，亚低温总体上使机体的代谢和功能活动趋于降低(除外低温防御反应)，应该可以起到阻止或延缓疾病进一步发展的作用。
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LPS介导细胞，特别是单核巨噬细胞激活、合成和释放各种细胞因子，作用于白细胞或内皮细胞等；LPS还可直接激活或损伤内皮细胞，引起内皮细胞功能的变化，如粘附分子的表达、细胞因子的释放和屏障功能的损伤[6]，进而引起SIRS和MODS。其中，TNF-α及ICAM-1在LPS介导的SIRS病理过程中起关键性作用。本研究通过放射免疫及免疫组化的方法，从蛋白质水平证明了在LPS介导的SIRS模型中，亚低温对致炎细胞因子TNF-α表达的抑制作用以及在对细胞移动过程中起关键作用的ICAM-1的表达的抑制作用，从而抑制全身性炎症反应。
亚低温抑制炎症反应，具体机制可能相当复杂。但本质上，低温“下调”作用主要通过改变蛋白质分子(如酶、细胞因子等)的高级结构，即改变分子结构的最适状态，从而降低其生物学活性。温度每降低10℃，体内化学反应速度约减慢一半(Arrhenius关系)。从这个角度上来说，亚低温总体上是抑制机体的各种代谢活动，包括病理变化，如致病性生物大分子的合成与活性等。但是，另一方面，亚低温本身又是一种致炎因子，降低恒温动物的体温，难免引起一系列的防御反应，从而促进和加重全身炎症反应。因此，主张采用轻微低温的方法，重在抑制全身炎症损伤过程的瀑布样级联反应。
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近年有研究发现，P38 MAPK信号通路在LPS介导的SIRS中起关键作用[7]。亚低温抑制炎症反应，是否通过了阻止P38 MAPK信号转导，尚待进一步深入研究。
参考文献
1，Bone RC,Balk RA,Cerra Fb, et al. Definitions for sepsis failure and guidlien for the use of innovative therapies in sepsis. Chest, 1992, 101:1644-1655.
2，Fisher CJ, Agosti JM, Opal SM,et al. Treatment of septic shock with the tumor necrosis factor:Fc fu-sion protein.New Engl J Med,1996,334:1697-1702.
, 百拇医药
3，Radi R,Bockman JS,Bush KM,et al.Peroxynitite-induced membrane lipid peroxidation:the cgtotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Bio chem Biophys,1991,288:481-487.
4，Kariebe H,Zarow GJ,Weistein PR.Use of mild ypothermia vesus mannitol if reduce infarct size after temporary middle cerebral artery occlusion in rats.J Neurosurg,1995,83:93-99.
5，Edwards AD,Yue X,Spuior MV,et al. Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia by moderate post-insult hypothermia. Biochem Biophys Res Commun,1995,217:1193-1199.
6，Ulevitch RJ,Tobias PS. Recognition of endotoxin bycells leading to transmembrane signalling.Curr Opinimmunol,1994,6:125-130.
7，Han J,Lee JD,Bibbs L,et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in manmalian cells.Science,1994,265:808-811.
(收稿日期：1999-08-24), 百拇医药
单位：胡皓夫(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)；解启莲(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)；安会波(050031 石家庄，河北省儿童医院急救科)
关键词：低温，人工；脓毒症综合征；肿瘤坏死因子；胞间粘附分子1；小鼠
中华儿科杂志000603 【摘要】 目的 探讨亚低温能否抑制全身炎症反应综合征(SIRS)，从而阻止多器官功能障碍综合征(MODS)的发生。方法 将96只小鼠随机分成内毒素组、亚低温组、保温组及对照组。采用放射免疫法，分别于注射内毒素(LPS)后1、2、4 h 测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)，并用免疫组化法检测4组动物(4 h)肝、肺血管内皮细胞细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达情况。结果 亚低温组1、2、4 h 的TNF-α含量[(2.0±0.3)、(2.1±0.4)、(2.5±0.5)μg/L]显著低于内毒素组[(4.1±0.4)、(4.1±0.6)、(3.3±0.5) μg/L](P<0.01)，而保温组与内毒素组相比，差异无显著意义 (P>0.05)；亚低温组与保温组在1、2 h时[(2.0±0.3)、(2.1±0.4)μg/L；(4.0±0.30)、(3.8±0.4)μg/L]差异有显著意义 (P<0.01和<0.05)，但4 h未见明显差别[(2.5±0.5)、(2.6±0.5)μg/L](P>0.05)；免疫组化显示亚低温组肝及肺微血管内皮细胞周围的ICAM-1组化染带呈弱阳性，内毒素与保温组呈强阳性表达。结论 亚低温有显著抑制全身炎症反应的作用。提示亚低温可考虑作为防治SIRS的一种措施。
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Mild hypothermia prevents and cures systemic inflammatory response syndrome
HU Haofu, XIE Qilian, AN Huibo.
Intensive Care Unit, The Children's Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050032, China
【Abstract】 Objective To explore the inhibiting effect of mild hypothermia on systemic inflammatory response syndrome (SIRS), thereby to prevent the occurrence of multiple organ dysfunction syndrome(MODS). Methods Ninety-six mice were randomly divided into four groups: the normal control, lipopolysaccharide (LPS), mild hypothermia and temperature preservation. By using the radio-immunity technique, the plasma levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the 4 groups of mice were measured after l, 2 and 4 hours of injection with LPS into mice. Livers and lungs of the mice were collected 4 hours after the injection of LPS for testing the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in vascular endotheliocytes with the immunohistochemistry method. Results The contents of TNF-α in mild hypothermia group after 1,2 and 4 hours of LPS injections [(2.0±0.3), (2.1±0.4) and (2.5±0.5) μg/L, respectively] were significantly lower than those in LPS group [(4.1±0.4), (4.1±0.6) and (3.3±0.5) μg/L, respectively] (P<0.001). While there was no significant difference between LPS and temperature preservation groups (P>0.05). There were marked differences between mild hypothermia and temperature preservation groups after 1 and 2 hours of the LPS injections[(2.0±0.3) and (2.1±0.4) μg/L vs. (4.0±0.3) and (3.8±0.4) μg/L, respectively. P<0.01 and <0.05], but no difference after 4 hours [(2.5±0.5) vs. (2.6±0.5) μg/L, P>0.05]. Immunohistochemistry staining showed that the expression of ICAM-1 surrounding the vascular endotheliocyte of the liver and lung was weakly positive in the mild hypothermia group, but strongly positive in the LPS group and temperature preservation group. Conclusion Mild hypothermia revealed a function of inhibiting SIRS. It suggested that mild hypothermia may be a new method for preventing and curing SIRS.
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【Key words】 Hypothermia, induced; Sepsis syndrome; Tumor necrosis factor; Intercellular adhesion molecule-1; Mice
全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfuction syndrome,MODS)的基础[1]，后者一旦进入器官衰竭期，常难以逆转。因此，如何有效地抑制全身炎症反应，是阻止MODS发生的关键。目前已有的抗炎药物(包括细胞因子的单克隆抗体)疗效均不理想[2]，而目前尚无全面抑制炎症反应的药物。能否以降温的方法来阻止全身炎症的发展，尚未见报道。本研究就亚低温与全身炎症反应的关系作一探讨，期望能对阻止临床MODS的发生有所帮助。
材料和方法
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一、材料
1.动物：KM小鼠96只(河北医科大学动物中心提供)，体重22～28 g，雌雄不限。
2.仪器：L5J电子测温仪(Becton公司)，FT-630Gγ计数仪(北京核医仪器厂)。
3.药物及制剂：内毒素(Ecoli O55)(Bioding公司)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)放免试剂盒(军事医学科学院提供)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，冬眠肌松合剂(氯丙嗪+肌安松)。
二、方法
1.将96只小鼠随机分成4组，即正常对照组(A组)、内毒素组(B组)、亚低温组(C组)、保温组(D组)。B、C、D组小鼠均腹腔注射内毒素(1 mg/kg)造成全身炎症反应综合征模型(预试验6 h后肝、肺病理见多处炎症病灶)。C、D两组均注射冬眠肌松合剂(氯丙嗪2 mg/kg+肌安松50 μg/kg)，调节室温并辅以冰袋及烘灯，使C组肛温降至33～34℃，D组肛温保持在36.5℃以上。分别于注射内毒素后1、2、4 h取血0.8 ml，离心后留取血清0.3～0.4 ml，-20℃冰箱内保存，待测TNF-α含量。最后1次采血(4 h)后取动物肝、肺，立即置于液氮内，待测ICAM-1。
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2.TNF-α检测：采用放射免疫分析法测定血清TNF-α含量。按常规设置空白对照管、标准零管、标准样品管1～5及样品管，依说明添加样品、125I-TNF、抗TNF抗体(TNF-Ab)及血清后，充分混合，置4℃ 24 h,加入分离剂摇匀，放室温下20 min，4℃离心(3 500 r/min)20 min，弃上清液后经γ计数仪测定各管放射性，并计算TNF-α值。
3.ICAM-1检测：本试剂盒内主要有：GoICAM-1/IgG1、aGoIgG/Bio、s-A/HRP、兔血清等，采用冰冻切片免疫组化S-P法检测各组动物4 h后肝肺血管内皮上ICAM-1的表达。
4.统计学处理
所有数据均采用均数±标准差(
±s)表示，采用SAS软件处理，样本均数间分别采用Dunnett法及q 检验判定均数差异显著性。, http://www.100md.com
结果
一、 TNF-α含量的测定
结果显示：B、C 、D各组TNF-α含量与A组相比，差异均有显著意义; B组与C组1、2、4 h各时间段TNF-α含量比较，差异均有显著意义(P<0.01),C组与D组于1、2 h TNF-α含量比较，差异有显著性意义(P<0.01和<0.05)；而与4 h组比较，差异无显著意义；B组与D组差异无显著意义(表1)。提示降温有抑制TNF-α表达与释放的作用，而保温组无显著抑制表现，表明冬眠肌松合剂对TNF-α无抑制作用。
表1 4组小鼠注射内毒素后不同时间血清TNF-α
含量比较(
±s,μg/L) 组别鼠数
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(只)
注射内毒素后时间(h)
1
2
4
对照组(A)
24
1.1±0.4
1.1±0.4
1.1±0.4
内毒素组(B)
24
4.1±0.4*
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4.1±0.6*
3.3±0.5*
亚低温组(C)
24
2.0±0.3*▲
2.1±0.4*▲
2.5±0.5*▲
保温组(D)
24
4.0±0.3*△
3.8±0.4*△△
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2.6±0.5*
注：与A组比较，* P<0.01；与B组比较，▲ P<0.01；与C组比较，△ P<0.01，△△ P<0.05 二、 ICAM-1的表达
通过对4组动物肝、肺ICAM-1的检测可以看出，降温组动物肝肺血管周围的黄色染带明显减弱，而内毒素组与保温组均呈强阳性表达。
讨论
亚低温对急性脑损伤的保护作用已为临床及基础研究广泛关注[3-5]，能否推广到SIRS和MODS，为临床防治SIRS或MODS提供新途径，尚需证实。从理论上说，亚低温总体上使机体的代谢和功能活动趋于降低(除外低温防御反应)，应该可以起到阻止或延缓疾病进一步发展的作用。
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LPS介导细胞，特别是单核巨噬细胞激活、合成和释放各种细胞因子，作用于白细胞或内皮细胞等；LPS还可直接激活或损伤内皮细胞，引起内皮细胞功能的变化，如粘附分子的表达、细胞因子的释放和屏障功能的损伤[6]，进而引起SIRS和MODS。其中，TNF-α及ICAM-1在LPS介导的SIRS病理过程中起关键性作用。本研究通过放射免疫及免疫组化的方法，从蛋白质水平证明了在LPS介导的SIRS模型中，亚低温对致炎细胞因子TNF-α表达的抑制作用以及在对细胞移动过程中起关键作用的ICAM-1的表达的抑制作用，从而抑制全身性炎症反应。
亚低温抑制炎症反应，具体机制可能相当复杂。但本质上，低温“下调”作用主要通过改变蛋白质分子(如酶、细胞因子等)的高级结构，即改变分子结构的最适状态，从而降低其生物学活性。温度每降低10℃，体内化学反应速度约减慢一半(Arrhenius关系)。从这个角度上来说，亚低温总体上是抑制机体的各种代谢活动，包括病理变化，如致病性生物大分子的合成与活性等。但是，另一方面，亚低温本身又是一种致炎因子，降低恒温动物的体温，难免引起一系列的防御反应，从而促进和加重全身炎症反应。因此，主张采用轻微低温的方法，重在抑制全身炎症损伤过程的瀑布样级联反应。
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近年有研究发现，P38 MAPK信号通路在LPS介导的SIRS中起关键作用[7]。亚低温抑制炎症反应，是否通过了阻止P38 MAPK信号转导，尚待进一步深入研究。
参考文献
1，Bone RC,Balk RA,Cerra Fb, et al. Definitions for sepsis failure and guidlien for the use of innovative therapies in sepsis. Chest, 1992, 101:1644-1655.
2，Fisher CJ, Agosti JM, Opal SM,et al. Treatment of septic shock with the tumor necrosis factor:Fc fu-sion protein.New Engl J Med,1996,334:1697-1702.
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3，Radi R,Bockman JS,Bush KM,et al.Peroxynitite-induced membrane lipid peroxidation:the cgtotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Bio chem Biophys,1991,288:481-487.
4，Kariebe H,Zarow GJ,Weistein PR.Use of mild ypothermia vesus mannitol if reduce infarct size after temporary middle cerebral artery occlusion in rats.J Neurosurg,1995,83:93-99.
5，Edwards AD,Yue X,Spuior MV,et al. Specific inhibition of apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia by moderate post-insult hypothermia. Biochem Biophys Res Commun,1995,217:1193-1199.
6，Ulevitch RJ,Tobias PS. Recognition of endotoxin bycells leading to transmembrane signalling.Curr Opinimmunol,1994,6:125-130.
7，Han J,Lee JD,Bibbs L,et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in manmalian cells.Science,1994,265:808-811.
(收稿日期：1999-08-24), 百拇医药