Bcl-2和Bax蛋白在急性白血病细胞中的表达及与化疗反应的关系
作者：赵晓庆 李根山 郭稳捷 李艳芝
单位：赵晓庆(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；李根山(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；郭稳捷(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；李艳芝(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000714 bcl-2与bax是一对调控细胞凋亡的同源基因，Bcl-2高表达可阻抑细胞凋亡的发生，bax可拮抗bcl-2的抗凋亡效应，起着加速细胞凋亡的作用。我们对41例急性白血病(AL)患儿白血病细胞Bcl-2蛋白表达水平及其与Bax蛋白共表达方式对化疗的影响进行了研究，探讨人类白血病细胞Bcl-2蛋白与Bax蛋白不同表达方式与化疗反应的关系。
对象
, 百拇医药
41例AL包括初发未治30例，复发难治11例。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)19例。男30例，女11例；年龄11月～14岁。分型、分类及治疗方案依据1993年《小儿急性白血病诊疗建议》。完全缓解标准的判定，依据1978年全国白血病防止研究协作会议制定的标准。对照组为非白血病且骨髓象正常的10例儿童。
方法
1.主要试剂：抗Bcl-2单克隆抗体,抗Bax多克隆抗体，羊抗鼠IgG(第二抗体)购自北京中山生物技术公司。
2.标本制作：肝素抗凝静脉血3 ml,淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经磷酸缓冲液(PBS)洗两遍，用70%乙醇固定。4℃冰箱保存。
3.细胞免疫荧光染色：取4℃下乙醇固定的细胞，生理盐水洗涤后，加第一抗体(鼠抗人Bcl-2单克隆抗体或兔抗人Bax多克隆抗体，1∶100稀释)100 μl,37℃孵育30 min，生理盐水洗两遍，之后加入第二抗体(1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG) 100 μl,37℃孵育30 min，生理盐水洗两遍，弃上清，待检测。
, 百拇医药
4.流式细胞仪：流式细胞仪FACS 420(美国BD公司)的发射激光为氩离子激光器，功率10 mW,发射波长488 nm,每管收集10 000个细胞。
5.结果判定：经免疫荧光染色后的细胞涂片在荧光显微镜下观察可见黄绿色荧光主要分布在细胞核内，细胞检测采用Lysys软件(BD公司提供)，计算出阳性细胞百分率及荧光指数(fluorescence index, FI)。
6.统计学方法：测值以
±s表示，采用t和χ2检验
结果
1.Bcl-2和Bax蛋白在AL细胞及不同类型中的表达:两种蛋白在ALL和ANLL细胞中表达的阳性率经统计学处理,差异无显著性(P均>0.05)。Bcl-2蛋白在复发难治组[(22±12)%]与初发未治组[(18±9)%]相比,差异有显著意义(P<0.05)。
, 百拇医药
2.Bcl-2与Bax蛋白表达的关系：在同一患儿的AL细胞中，两者呈反向表达[Bcl-2(+)、Bax(-)]占24例(69%),同向表达[Bcl-2(+)、Bax(+)]占11例(31%)(P<0.01)。在AL细胞中Bcl-2蛋白呈高表达，而Bax蛋白呈低表达者多见。同时前者表达方式的CR率(24%)低于后者的CR率(57%)(P<0.01)。
3.Bcl-2/Bax蛋白质比率与化疗反应的关系：Bcl-2/Bax蛋白质比率为1.3±1.0,其中Bcl-2/Bax比值<1的20例中15例获缓解,而Bcl-2/Bax比值>1的21例中仅有6例缓解,两者差异具有显著意义(P<0.01)。
讨论
1984年Tsujimoto等[1]从滤泡性淋巴瘤中分离出bcl-2基因蛋白，发现bcl-2基因产物并不象典型的致癌基因能加速细胞分裂和细胞增殖，而是促进细胞生长，延长细胞寿命，保持细胞数不减[2]。而bax作为bcl-2同源基因，起着加速细胞凋亡作用。研究表明，bcl-2和bax形成同源二聚体时细胞趋向死亡，而形成异源二聚体时细胞趋向存活。因而认为Bax与Bcl-2两种蛋白的数量比决定着细胞受到凋亡因素刺激后的存亡。这种正负调节失衡可导致细胞的非正常增生，引起癌变。本研究发现，Bcl-2蛋白在AL及其各型细胞阳性表达明显高于正常对照组，与文献相符合[3，4]。此外，复发难治组AL细胞Bcl-2蛋白阳性率明显高于初发未治组。我们进一步研究发现，在同一患儿的AL细胞中，Bcl-2和Bax蛋白之间以反向表达关系为主，且反向表达的CR率明显低于同向表达CR率。提示Bcl-2蛋白异常高表达使细胞获得病态的生存优势，它是化疗耐药形成的内在生物学基础。
, 百拇医药
Vanage等[5]研究发现，Bcl-2/Bax的表达比率与临床疗效有显著相关性，Bcl-2/Bax比率>1.0的患者化疗后几乎没有缓解的。我们比较在同一AL细胞中，Bcl-2蛋白与Bax蛋白比值对化疗效果有影响，Bcl-2/Bax蛋白比值<1患儿的CR率明显高于Bcl-2/Bax蛋白比值>1患儿的CR率。这与文献报道是相符的，提示两种基因蛋白联检，尤其是Bcl-2/Bax蛋白比值有助于评估AL细胞对化疗的敏感性。
参考文献
1，Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome treaslocation. Science，1984,226:1097-1099.
2，Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J cell Biol,1994,124:1-6.
, 百拇医药
3，Campos L,Rouault J,Sabido,et al.High expression of Bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to thermotherapy.Blood,1993,81:3091-3096.
4，Maung Z,Macleam F,Reid M, et al.The relationship between Bcl-2 expression and response to chemotherapy in acute leukemia.Br J Haematol, 1994,88:105-109.
5，Vanage DM,Orrenius S,Aguilar-Santelises M.Alterations in Bcl-2/Bax protein levels in platelets from part of an ionomycin-induced process that resembles apoptosis.Br J Haematol,1997,99:824-831.
(收稿日期：1999-08-10), 百拇医药
单位：赵晓庆(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；李根山(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；郭稳捷(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)；李艳芝(050000 石家庄，河北医科大学第二附属医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000714 bcl-2与bax是一对调控细胞凋亡的同源基因，Bcl-2高表达可阻抑细胞凋亡的发生，bax可拮抗bcl-2的抗凋亡效应，起着加速细胞凋亡的作用。我们对41例急性白血病(AL)患儿白血病细胞Bcl-2蛋白表达水平及其与Bax蛋白共表达方式对化疗的影响进行了研究，探讨人类白血病细胞Bcl-2蛋白与Bax蛋白不同表达方式与化疗反应的关系。
对象
, 百拇医药
41例AL包括初发未治30例，复发难治11例。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)19例。男30例，女11例；年龄11月～14岁。分型、分类及治疗方案依据1993年《小儿急性白血病诊疗建议》。完全缓解标准的判定，依据1978年全国白血病防止研究协作会议制定的标准。对照组为非白血病且骨髓象正常的10例儿童。
方法
1.主要试剂：抗Bcl-2单克隆抗体,抗Bax多克隆抗体，羊抗鼠IgG(第二抗体)购自北京中山生物技术公司。
2.标本制作：肝素抗凝静脉血3 ml,淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经磷酸缓冲液(PBS)洗两遍，用70%乙醇固定。4℃冰箱保存。
3.细胞免疫荧光染色：取4℃下乙醇固定的细胞，生理盐水洗涤后，加第一抗体(鼠抗人Bcl-2单克隆抗体或兔抗人Bax多克隆抗体，1∶100稀释)100 μl,37℃孵育30 min，生理盐水洗两遍，之后加入第二抗体(1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG) 100 μl,37℃孵育30 min，生理盐水洗两遍，弃上清，待检测。
, 百拇医药
4.流式细胞仪：流式细胞仪FACS 420(美国BD公司)的发射激光为氩离子激光器，功率10 mW,发射波长488 nm,每管收集10 000个细胞。
5.结果判定：经免疫荧光染色后的细胞涂片在荧光显微镜下观察可见黄绿色荧光主要分布在细胞核内，细胞检测采用Lysys软件(BD公司提供)，计算出阳性细胞百分率及荧光指数(fluorescence index, FI)。
6.统计学方法：测值以
±s表示，采用t和χ2检验结果
1.Bcl-2和Bax蛋白在AL细胞及不同类型中的表达:两种蛋白在ALL和ANLL细胞中表达的阳性率经统计学处理,差异无显著性(P均>0.05)。Bcl-2蛋白在复发难治组[(22±12)%]与初发未治组[(18±9)%]相比,差异有显著意义(P<0.05)。
, 百拇医药
2.Bcl-2与Bax蛋白表达的关系：在同一患儿的AL细胞中，两者呈反向表达[Bcl-2(+)、Bax(-)]占24例(69%),同向表达[Bcl-2(+)、Bax(+)]占11例(31%)(P<0.01)。在AL细胞中Bcl-2蛋白呈高表达，而Bax蛋白呈低表达者多见。同时前者表达方式的CR率(24%)低于后者的CR率(57%)(P<0.01)。
3.Bcl-2/Bax蛋白质比率与化疗反应的关系：Bcl-2/Bax蛋白质比率为1.3±1.0,其中Bcl-2/Bax比值<1的20例中15例获缓解,而Bcl-2/Bax比值>1的21例中仅有6例缓解,两者差异具有显著意义(P<0.01)。
讨论
1984年Tsujimoto等[1]从滤泡性淋巴瘤中分离出bcl-2基因蛋白，发现bcl-2基因产物并不象典型的致癌基因能加速细胞分裂和细胞增殖，而是促进细胞生长，延长细胞寿命，保持细胞数不减[2]。而bax作为bcl-2同源基因，起着加速细胞凋亡作用。研究表明，bcl-2和bax形成同源二聚体时细胞趋向死亡，而形成异源二聚体时细胞趋向存活。因而认为Bax与Bcl-2两种蛋白的数量比决定着细胞受到凋亡因素刺激后的存亡。这种正负调节失衡可导致细胞的非正常增生，引起癌变。本研究发现，Bcl-2蛋白在AL及其各型细胞阳性表达明显高于正常对照组，与文献相符合[3，4]。此外，复发难治组AL细胞Bcl-2蛋白阳性率明显高于初发未治组。我们进一步研究发现，在同一患儿的AL细胞中，Bcl-2和Bax蛋白之间以反向表达关系为主，且反向表达的CR率明显低于同向表达CR率。提示Bcl-2蛋白异常高表达使细胞获得病态的生存优势，它是化疗耐药形成的内在生物学基础。
, 百拇医药
Vanage等[5]研究发现，Bcl-2/Bax的表达比率与临床疗效有显著相关性，Bcl-2/Bax比率>1.0的患者化疗后几乎没有缓解的。我们比较在同一AL细胞中，Bcl-2蛋白与Bax蛋白比值对化疗效果有影响，Bcl-2/Bax蛋白比值<1患儿的CR率明显高于Bcl-2/Bax蛋白比值>1患儿的CR率。这与文献报道是相符的，提示两种基因蛋白联检，尤其是Bcl-2/Bax蛋白比值有助于评估AL细胞对化疗的敏感性。
参考文献
1，Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome treaslocation. Science，1984,226:1097-1099.
2，Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J cell Biol,1994,124:1-6.
, 百拇医药
3，Campos L,Rouault J,Sabido,et al.High expression of Bcl-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to thermotherapy.Blood,1993,81:3091-3096.
4，Maung Z,Macleam F,Reid M, et al.The relationship between Bcl-2 expression and response to chemotherapy in acute leukemia.Br J Haematol, 1994,88:105-109.
5，Vanage DM,Orrenius S,Aguilar-Santelises M.Alterations in Bcl-2/Bax protein levels in platelets from part of an ionomycin-induced process that resembles apoptosis.Br J Haematol,1997,99:824-831.
(收稿日期：1999-08-10), 百拇医药