癌基因MDM2过度表达与儿童急性淋巴细胞白血病的发病和预后的关系
作者：蒋莎义 陈力军 高飞 李桂梅 刘廷亮 尹洪臣
单位：蒋莎义(250021 济南, 山东省立医院儿科)；陈力军(250021 济南, 山东省立医院儿科)；高飞(250021 济南, 山东省立医院儿科)；李桂梅(250021 济南, 山东省立医院儿科)；刘廷亮(250021 济南, 山东省立医院儿科)；尹洪臣(250021 济南, 山东省立医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000713 MDM2是抑癌基因p53的拮抗基因。p53基因突变发生于人类许多肿瘤，所以被认为与这些肿瘤的发生有关，而在白血病中p53基因突变则少见，却有P53蛋白功能的失活[1,2]。MDM2过度表达是p53基因突变以外的另一p53基因失活途径。我们用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗前外周血单个核细胞中MDM2 mRNA表达情况，并分析MDM2过度表达与儿童ALL发病及预后的关系。
, http://www.100md.com
对象
1997年3月～1998年10月收治初发儿童ALL 32例，其中男23例，女9例；年龄1.5～11岁，平均年龄6.6岁。初诊时外周血幼稚细胞在60%以上。每例治疗前抽取外周血5 ml，淋巴细胞提取液提取单个核细胞，置-80℃储存备用。同时收集22例健康儿童外周血，提取单个核细胞作为对照。
方法
MDM2引物有意义链：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，反意义链：5′-TGAAGGTTTCTCTTTCCTGAAG-3′;β-actin引物有意义链：5′-AAGGATTCCTATGTGGGC-3′, 反意义链：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。TRIZOL试剂提取单个核细胞内总RNA。
MDM2、β-actin cDNA的合成：取样本所提的RNA 2 μg，加MDM2(或β-actin ) 反意义链引物，AMV逆转录酶等。反应体系总量25 μl，终浓度为dNTP 0.5 mmol/L，Mg++ 10 mmol/ L，KCl 50 mmol/ L，Tris 50 mmol/ L，42℃水浴1 h，95℃ 5 min灭活AMV酶。
, 百拇医药
PCR扩增MDM2、β-actin cDNA：取上述逆转录产物5 μl，加入MDM2(或β-actin)有意义链和反意链引物、 Taq酶等，总反应体系50 μl，终浓度dNTP 200 mmol/ L，Mg++ 200 mmol/ L, KCl 50 mmol/ L，Tris 18 mmol/ L。扩增30个循环，每个循环94℃ 30 s变性，56℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸。
电泳及扫描分析：2% 的琼脂糖凝胶，电泳上述PCR产物2 h，紫外灯下摄像。岛津薄层光密度扫描仪分别测MDM2和β-actin扩增产物电泳带强度的积分值，记录各样本两者积分值之比。χ2检验及四格表确切概率法对结果进行统计学分析。
结果
根据Buteso-Ramos等[3]的判断方法，我们将MDM2与β-actin之比>20%定为过度表达。本组儿童急性淋巴细胞白血病MDM2 mRNA过度表达率为44%(14/32)，患儿组MDM2 mRNA表达明显高于对照组(0/22)，差异有显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
对接受治疗的25例患儿随访半年以上，根据对化疗的反应及复发情况，将25例患儿进行分组。不良预后组6例：2例于诱导缓解期死于颅内出血，2例用VDLP方案化疗4周，骨髓呈部分缓解，2例诱导缓解后半年内复发；一般预后组19例，持续缓解半年以上。不良预后组MDM2 mRNA过度表达率 (5/6)与一般预后组(5/19)比较，差异有显著性(P=0.0225)。
讨论
野生型P53蛋白有抑制细胞过度生长，诱导细胞凋亡的作用。MDM2编码蛋白P90能与P53蛋白结合，抑制其功能。目前认为MDM2 过度表达是白血病发生的重要环节。高产量的MDM2蛋白抑制了P53蛋白对细胞过度生长的抑制作用，阻止P53蛋白介导的凋亡，在肿瘤的发生中起重要作用。在多数人类肉瘤中，MDM2高表达方式是基因扩增，而在白血病中 MDM2 基因扩增却不常见。我们的研究结果提示，在儿童ALL的发病中是MDM2 mRNA过度表达而非DNA扩增。
, 百拇医药
研究表明，MDM2 mRNA过度表达与儿童ALL的不良预后有关。随着白血病治疗方法的进展，目前70%～75%的儿童ALL已达长期无病生存。但仍有少数患儿对化疗不敏感和易复发，需要早期决定是否使用更有效的治疗手段，如骨髓移植。分子生物学方法在儿童ALL研究中的应用将使我们为临床估计ALL患儿预后、选择有效的治疗方案提供可靠依据。
参考文献
1，Seliger B, Papadileris S, Vogel U, et al. Analysis of the p53 and MDM2 gene in acute myeloid leukemia. Eur J Haematol, 1996, 57: 230-240.
2，Marks DI, Kurz BE, Link MP, et al. High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute leukemia at diagnosis. Blood, 1996, 87: 1155-1161.
3，Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E，et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993,82:2617-2623.
(收稿日期：1999-08-02), 百拇医药
单位：蒋莎义(250021 济南, 山东省立医院儿科)；陈力军(250021 济南, 山东省立医院儿科)；高飞(250021 济南, 山东省立医院儿科)；李桂梅(250021 济南, 山东省立医院儿科)；刘廷亮(250021 济南, 山东省立医院儿科)；尹洪臣(250021 济南, 山东省立医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000713 MDM2是抑癌基因p53的拮抗基因。p53基因突变发生于人类许多肿瘤，所以被认为与这些肿瘤的发生有关，而在白血病中p53基因突变则少见，却有P53蛋白功能的失活[1,2]。MDM2过度表达是p53基因突变以外的另一p53基因失活途径。我们用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗前外周血单个核细胞中MDM2 mRNA表达情况，并分析MDM2过度表达与儿童ALL发病及预后的关系。
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对象
1997年3月～1998年10月收治初发儿童ALL 32例，其中男23例，女9例；年龄1.5～11岁，平均年龄6.6岁。初诊时外周血幼稚细胞在60%以上。每例治疗前抽取外周血5 ml，淋巴细胞提取液提取单个核细胞，置-80℃储存备用。同时收集22例健康儿童外周血，提取单个核细胞作为对照。
方法
MDM2引物有意义链：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，反意义链：5′-TGAAGGTTTCTCTTTCCTGAAG-3′;β-actin引物有意义链：5′-AAGGATTCCTATGTGGGC-3′, 反意义链：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。TRIZOL试剂提取单个核细胞内总RNA。
MDM2、β-actin cDNA的合成：取样本所提的RNA 2 μg，加MDM2(或β-actin ) 反意义链引物，AMV逆转录酶等。反应体系总量25 μl，终浓度为dNTP 0.5 mmol/L，Mg++ 10 mmol/ L，KCl 50 mmol/ L，Tris 50 mmol/ L，42℃水浴1 h，95℃ 5 min灭活AMV酶。
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PCR扩增MDM2、β-actin cDNA：取上述逆转录产物5 μl，加入MDM2(或β-actin)有意义链和反意链引物、 Taq酶等，总反应体系50 μl，终浓度dNTP 200 mmol/ L，Mg++ 200 mmol/ L, KCl 50 mmol/ L，Tris 18 mmol/ L。扩增30个循环，每个循环94℃ 30 s变性，56℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸。
电泳及扫描分析：2% 的琼脂糖凝胶，电泳上述PCR产物2 h，紫外灯下摄像。岛津薄层光密度扫描仪分别测MDM2和β-actin扩增产物电泳带强度的积分值，记录各样本两者积分值之比。χ2检验及四格表确切概率法对结果进行统计学分析。
结果
根据Buteso-Ramos等[3]的判断方法，我们将MDM2与β-actin之比>20%定为过度表达。本组儿童急性淋巴细胞白血病MDM2 mRNA过度表达率为44%(14/32)，患儿组MDM2 mRNA表达明显高于对照组(0/22)，差异有显著性(P<0.01)。
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对接受治疗的25例患儿随访半年以上，根据对化疗的反应及复发情况，将25例患儿进行分组。不良预后组6例：2例于诱导缓解期死于颅内出血，2例用VDLP方案化疗4周，骨髓呈部分缓解，2例诱导缓解后半年内复发；一般预后组19例，持续缓解半年以上。不良预后组MDM2 mRNA过度表达率 (5/6)与一般预后组(5/19)比较，差异有显著性(P=0.0225)。
讨论
野生型P53蛋白有抑制细胞过度生长，诱导细胞凋亡的作用。MDM2编码蛋白P90能与P53蛋白结合，抑制其功能。目前认为MDM2 过度表达是白血病发生的重要环节。高产量的MDM2蛋白抑制了P53蛋白对细胞过度生长的抑制作用，阻止P53蛋白介导的凋亡，在肿瘤的发生中起重要作用。在多数人类肉瘤中，MDM2高表达方式是基因扩增，而在白血病中 MDM2 基因扩增却不常见。我们的研究结果提示，在儿童ALL的发病中是MDM2 mRNA过度表达而非DNA扩增。
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研究表明，MDM2 mRNA过度表达与儿童ALL的不良预后有关。随着白血病治疗方法的进展，目前70%～75%的儿童ALL已达长期无病生存。但仍有少数患儿对化疗不敏感和易复发，需要早期决定是否使用更有效的治疗手段，如骨髓移植。分子生物学方法在儿童ALL研究中的应用将使我们为临床估计ALL患儿预后、选择有效的治疗方案提供可靠依据。
参考文献
1，Seliger B, Papadileris S, Vogel U, et al. Analysis of the p53 and MDM2 gene in acute myeloid leukemia. Eur J Haematol, 1996, 57: 230-240.
2，Marks DI, Kurz BE, Link MP, et al. High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute leukemia at diagnosis. Blood, 1996, 87: 1155-1161.
3，Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E，et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993,82:2617-2623.
(收稿日期：1999-08-02), 百拇医药