应用δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶基因型筛查儿童铅毒性易感人群的研究
作者：吴胜虎 沈晓明 颜崇淮 殷洁敏 章依文 周建德
单位：吴胜虎(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；沈晓明(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；颜崇淮(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；殷洁敏(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；章依文(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)
关键词：铅中毒；儿童；氨基酮戊酸脱水酶；基因型；等位基因
中华儿科杂志000709 【摘要】 目的 通过对浙江者兰溪市某污染区儿童δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶(ALAD)基因的遗传多态性分析，探讨遗传因素对儿童血铅水平的影响。 方法 整群抽取对铅毒性较为敏感的6～10岁儿童229名。研究两种ALAD等位基因(ALAD1和ALAD2)的频率并测定血铅水平，同时问卷调查每位研究对象血铅水平的相关因素, 分析两种ALAD等位基因对儿童血铅水平的影响。 结果 (1)所研究儿童ALAD1-1型有211例，占92.1%；ALAD1-2型有18例，占7.9%；(2)携有等位基因ALAD2的儿童血铅水平几何均数为117 μg/L，携有等位基因ALAD1的儿童血铅水平几何均数为97 μg/L；(3)儿童血铅水平相关因素分析发现，儿童ALAD基因型、性别、父亲职业等9个因素与血铅显著相关。采用多元逐步回归分析，发现ALAD基因型对血铅水平的影响在排除协变量影响后仍有极显著的统计学意义。 结论 本组儿童ALAD基因存在遗传多态性；携有含ALAD2等位基因的人群可能为铅毒性作用的高危人群。z
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Screening of high risk children for lead poisoning by analysing δ-aminolevulinate dehydratase (ALAD) genotype
WU Shenghu, SHEN Xiaoming, YAN Chonghuai, et al. Department of Pediatrics, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatric Medical Research, Shanghai 200092, China
【Abstract】 Objective To explore the relationship between blood lead levels and the genetic polymorphism of the δ-aminolevulinate dehydratase (ALAD) gene. Methods The erythrocyte ALAD isozyme phenotypes and the blood lead levels were determined in a population of 229 pre-school children and primary school students aged 6-10 years. Both the school and their homes were within one community where a large smelter is located. An environmental questionnaire was filled for each subject. Results (1) The gene distribution of the ALAD isozyme phenotypes in these children was ALAD 1-1, 92.1%; ALAD 1-2, 7.9 %; no ALAD 2-2 was detected. (2) The mean blood lead levels of the environmentally exposed children who were homozygous for the ALAD1 allele was 97 μg/L while the mean levels for those who were heterozygous for the ALAD2 was 117 μg/L or 20 μg/L higher. (3) Many factors were found to affect the blood lead levels, such as gender, ALAD isozyme phenotype, educational level of fathers and so on. After controlling these possible confounding variables by multiple regression, the contribution of the ALAD isozyme phenotype to the blood lead levels was still statistically significant. Conclusion These results indicate that individuals carrying the ALAD2 allele are more likely to have sustained increases in blood lead levels when exposed to a lead contaminated environment. The finding supports the hypothesis that individuals with the ALAD2 allele may be more susceptible to lead poisoning.
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【Key words】 Lead poisoning; Child; Aminolevulinic acid dehydratase; Genotype; Alleles
在以往的流行病学研究中，人们发现，处于相似铅暴露环境的儿童有的血铅水平很高，而有些血铅水平并不增高；同样血铅水平的儿童有的表现出明显的智能发育障碍，而有些表现则不明显。这说明，除了环境暴露因素外，机体的易感性也是铅毒性作用的重要决定因素。国外研究发现，机体对铅毒性作用的易感性与δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶(δ-aminolevulinate dehydratase，ALAD)的遗传多态性有关。中国儿童是否也存在类似现象？本研究就此进行了探讨。
对象和方法
一、对象
在浙江省兰溪市某铅作业工厂子弟小学及该小学邻近厂区整群抽取学前班和1～3年级儿童共计229名。
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二、方法
1.标本留取和表格填写及赋值：抽取肘静脉血2 ml，分置2管，每管各1 ml，采用EDTA(7%，10 μl)抗凝，第1管留测定血红蛋白和血铅，第2管分离白细胞、抽提DNA,供进一步做聚合酶链反应及酶切分析。
同时在专职医生指导下由家长根据统一标准填写一份本中心自行编制的儿童铅中毒调查专用的“儿童家庭社会环境与健康问卷”。问卷内容涉及家庭一般情况、儿童个人情况、家庭社会环境以及父母情况等27个问题。并对每个变量按统一标准进行相应的赋值(赋值方法：根据文献报道可能为儿童铅中毒危险因素的变量赋值高，如：ALAD基因型，ALAD1-1型赋值为1、ALAD1-2型赋值为2；性别，女赋值为1、男赋值为2；文化程度越低赋值越高；职业层次越低赋值越高等)。
2.白细胞分离、DNA抽提：常规苯酚、氯仿法抽提基因组DNA。
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3.ALAD基因型分析：(1)PCR扩增ALAD基因上一个长度为916 bp片段。PCR引物:上游引物：5′-AGACAGACATTAGCTCAGTA-3′；下游引物：3′-GGCAAAGACCACGTCCATTC-5′。(2)ALAD基因型分析：用内切酶MspⅠ对PCR扩增的ALAD基因片段(916 bp)进行酶解，并辅以内切酶BsrFⅠ进行确认。酶解产物用琼脂糖凝胶电泳,通过分析带型的变化识别有无基因突变，以确定本组ALAD基因型。
4.统计方法：首先对儿童血铅水平进行描述性统计及正态性检验，然后以直线相关分析ALAD基因型、性别、父亲文化、父亲职业等各变量对血铅水平对数的影响，筛选出有统计学意义的变量。以血铅水平对数为因变量进行多元逐步回归分析。统计分析用Statistica for Windows 5.0软件。
结果
一、229例儿童血铅水平描述性统计结果
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229例儿童血铅经正态性检验为非正态分布，故采用几何均数表示，G＝99 μg/L(log
±slg 为1.993 9±0.130 0)。 血铅水平范围45 μg/L～264 μg/L。
二、229例儿童ALAD基因型分析结果
229例儿童中ALAD1-1 为211例，占92.1%；ALAD1-2为18例，占7.9%；未发现ALAD2-2。
三、229例儿童血铅水平与ALAD基因型关系分析
从表1可以看出ALAD 1-2型血铅水平几何均数平均比ALAD 1-1型高20 μg/L，两者之间的差异有显著性(t=2.573 3, P=0.010 7)，表明ALAD 1-2型个体的血铅水平可能较ALAD 1-1型者高。
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表1 ALAD基因型与血铅水平之间的关系 基因型
例数
几何均数G(μg/L)
log±slg
ALAD 1-1
211
97
1.987 5±0.131 0
ALAD 1-2
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18
117
2.068 7±0.089 6
注：两组比较t=2.573 3，P=0.010 7 四、229例儿童血铅水平相关因素单因素相关分析
在该分析中，本组研究以调查问卷中27个变量及血红蛋白、家庭社会经济状况(父母文化、父母职业之和)家庭、社会经济状况(SES)共29个变量逐个与儿童血铅水平对数进行相关分析，发现ALAD基因型、性别、父亲职业层次、父亲文化、领养人文化程度、居住路边距离、燃料类型、SES、母亲文化程度等9个变量与儿童血铅水平呈显著正相关。
五、多元逐步回归分析
对29个变量进行多元逐步回归分析，以排除掺杂因素的干扰。结果见表2。回归方程为：y(血铅)＝1.587 9+0.123 4x2+0.158 7x5+0.128 3x23+0.152 2x28+0.179 7x29 。所得回归方程为：F(11，217)=4.685 4, P<0.01。
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表2 229名儿童血铅水平影响因素
多元逐步回归分析结果 入选变量
系数
标准误
t值
P值
截距
1.587 9
0.076 8
x29领养人文化
0.179 7
0.080 6
, 百拇医药
2.23
0.026 9
x5 ALAD基因型
0.158 7
0.061 8
2.57
0.010 9
x28父亲文化程度
0.152 2
0.074 6
2.04
0.042 5
, 百拇医药
x23燃料类型
0.128 3
0.064 7
1.98
0.048 5
x2性别
0.123 4
0.062 4
1.98
0.049 4
多元逐步回归分析表明，最终进入儿童血铅水平对数回归方程共有5个变量，按其对因变量血铅水平对数的影响由大到小分别为ALAD基因型、领养人文化程度、父亲文化程度、厨房燃料类型、性别。其中ALAD基因型对血铅水平的显著贡献在排除掺杂因素的作用后依然存在，表明ALAD基因型对儿童血铅水平确实有影响。
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讨论
一、影响儿童血铅水平的相关因素
人体内的铅全部来自外界环境，外界环境中的铅主要由消化道和呼吸道进入儿童体内。以往的调查均发现，血铅水平受多个因素影响。寻找影响儿童血铅水平的相关因素是进行儿童铅中毒预防的前提。
国内的研究发现，儿童的血铅水平受父母文化、父母职业、领养人文化和SES等因素影响[1]。本研究调查了29个可能影响儿童血铅水平的因素，经单因素分析发现，ALAD1-2型、父亲职业层次低、父母亲文化程度低、领养人文化程度低、以煤为厨房燃料、SES分值高、房屋距马路近、男孩等可能是儿童铅中毒的危险因素。采用多元逐步回归分析以排除各影响因素间的交互作用，结果发现，对儿童血铅水平对数具有统计学意义的变量有5个，按影响大小依次为ALAD基因型、领养人文化程度(本组儿童领养人多为母亲)、父亲文化程度、燃料类型、性别。
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研究已证实领养人及父亲文化程度与儿童的血铅水平密切相关，领养人及父亲文化程度较低的家庭，儿童的血铅水平往往较高。由于煤炭都含有一定量的铅，燃烧过程中释放的铅会造成铅污染。上海市的研究发现，以煤制品为燃料的家庭，其室内空气中平均含铅量比室外空气高18倍，这些家庭儿童血铅浓度也明显高于非燃煤家庭儿童的血铅浓度[2]。美国的研究已多次证实，除了1～2岁年龄组男性血铅水平略高于女性外，其余各年龄组，男性的血铅水平明显高于女性[3]。与我们的研究结果一致。男、女血铅水平之间的性别差异究竟是由于男性暴露于铅污染环境的机会较多，还是铅代谢本身存在着性别差异，尚无明确的结论。
二、ALAD基因型对儿童血铅水平的影响
环境中的铅是造成儿童铅中毒的根本原因，也是影响铅毒性的重要因素，但并不是唯一因素。除了环境暴露因素外，机体的易感性也是铅毒性作用的重要决定因素。国外研究发现，机体对铅毒性作用的易感性和ALAD的遗传多态性有关[3]。
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本研究调查了229例儿童血铅水平并检测了这些研究对象的ALAD基因型，经单因素分析表明，携有等位基因ALAD2个体的血铅水平较携有等位基因ALAD1个体的血铅水平有显著增高，平均高20 μg/L (P<0.05)。在关于儿童血铅影响因素的多元逐步回归方程中，ALAD基因型变量被引入，且回归方程有显著意义。这表明在排除了掺杂因素影响后，ALAD基因型对儿童血铅水平的影响依然存在。此结果说明ALAD基因型对儿童血铅水平确有影响。因此我们可推测本组儿童中携有ALAD2等位基因个体可能对环境中的铅更易感。本组儿童ALAD基因的突变频率(7.9%)低于美国(11%)及德国(21%)[4]。由于本研究样本量较小，有关中国儿童ALAD基因的突变频率及其对血铅水平的影响尚需进一步研究。
三、ALAD基因型对铅毒性影响的机制
1.遗传学基础：有关铅毒性作用遗传学基础的研究尚不多见，目前的研究主要集中在ALAD[5]。ALAD存在遗传多态现象，ALAD由单个基因ALAD基因编码,位于染色体9q34,有2个等位基因(ALAD1和ALAD2)，在欧洲人群中两者出现的频率为9∶1。这两种等位基因的不同表达组成了3种遗传表现型。最近的研究表明，儿童表现为杂合子和2- 2型纯合子者对铅中毒的易感性增高[4,6,7]。Wetmur等[4]进行一大样本的研究发现，等位基因ALAD2的出现和儿童血铅增高有关。出现等位基因ALAD2的人群中，血铅水平超过300 μg/L的比例明显增高。Wetmur等[4]研究发现，ALAD2-2型和ALAD1-2型个体在受到铅暴露时更容易发生高血铅和铅中毒，是铅毒性的易感和高危人群。同样环境铅暴露水平携带ALAD2等位基因的纯合子个体的血铅要比携带等位基因ALAD1高100 μg/L。Wetmur等[4]估计等位基因ALAD2对血铅水平的贡献要占血中总铅的40%，因此，ALAD2是人类铅毒性遗传易感性的标志，该基因携带者是铅毒性的易感人群。
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2.分子机制：1991年Wetmur等[4]发现ALAD2等位基因是由于基因序列上第177位核苷酸(第59位氨基酸)发生G→C突变。这个突变的结果是带正电荷的赖氨酸被电中性的精氨酸代替(K59N突变)。这是ALAD1和ALAD2多肽的主要区别[7]。两种不同类型的氨基酸替换可改变酶构象而使酶活性发生改变。由于ALAD酶构象的改变，增加了ALAD2亚单位与铅的亲和力，使ALAD2亚单位与铅的结合更为紧密，从而导致携有ALAD2亚单位的个体(ALAD2-2型和ALAD1-2型)在受到铅暴露时更容易发生高血铅和铅中毒。此外，ALAD多态性影响铅的毒性代谢动力学，使铅的生物利用度降低，导致铅在体内循环池中长期蓄积[8,9]。
四、临床意义
, http://www.100md.com 由于携带等位基因ALAD2的人群可能是铅毒性的易感人群，如果我们能通过建立某种快速、简便的方法，将那些遗传特性上对铅毒性高度易感的人群(即高危人群)筛查出来，对他们进行重点预防(如进行小环境干预、针对性健康教育、个体化药物预防等)，可望在现有条件下明显减轻环境铅污染对儿童健康的危害，提高儿童的健康水平。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970645)
作者单位：周建德(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)
参考文献
1，崇淮，沈晓明，章依文，等.上海市儿童血铅水平及其影响因素的流行学研究.中华儿科杂志, 1998, 36:142-145.
2，沈晓明. 儿童铅中毒. 北京：人民卫生出版社，1996. 42-43.
, 百拇医药
3，Brody DJ , Pirkle JL, Kramer RA, et al. Blood lead levels in the US population. JAMA, 1994, 272:277-283.
4，Wetmur JG, Lehner G, Desnick RJ. The δ-aminolevulinate dehydratase polymorphism: high blood lead levels in lead workers and environmentally exposed children with the 1-2 and 2-2 isozymes. Environ Res, 1991, 56:109-119.
5，吴胜虎，颜崇淮，沈晓明. ALAD基因型与儿童铅毒性易感性.国外医学儿科学分册, 1999, 26:85-87.
6，Wetmur JG. Influence of the common human δ-aminolevulinate dehydratase polymorphism on lead body burden. Environ Health Perspect, 1994,102:215-219.
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7，Wetmur JG, Kara AH, Pleminska M, et al. Molecular characterization of the human δ-aminolevulinate dehydratase 2(ALAD2) allele: implications for molecular screening of individuals for genetic susceptibility to lead poisoning. Am J Hum Genet, 1991,49:757-763.
8，Fleming DE, Chettle DR, Wetmur JG, et al. Effect of the delta-aminolevulinate dehydratase polymorphism on the accumulation of lead in bone and blood in lead smelter workers. Environ Res, 1998,77:49-61.
9，Alexander BH, Checkoway H, Mallen PC, et al. Interaction of blood lead and δ-aminolevulinic acid dehydratase genotype on markers of heme synthesis and sperm production in lead smelter workers. Environ Health Perspect, 1998, 106:213-216.
(收稿日期：1999-08-19), 百拇医药
单位：吴胜虎(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；沈晓明(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；颜崇淮(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；殷洁敏(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)；章依文(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)
关键词：铅中毒；儿童；氨基酮戊酸脱水酶；基因型；等位基因
中华儿科杂志000709 【摘要】 目的 通过对浙江者兰溪市某污染区儿童δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶(ALAD)基因的遗传多态性分析，探讨遗传因素对儿童血铅水平的影响。 方法 整群抽取对铅毒性较为敏感的6～10岁儿童229名。研究两种ALAD等位基因(ALAD1和ALAD2)的频率并测定血铅水平，同时问卷调查每位研究对象血铅水平的相关因素, 分析两种ALAD等位基因对儿童血铅水平的影响。 结果 (1)所研究儿童ALAD1-1型有211例，占92.1%；ALAD1-2型有18例，占7.9%；(2)携有等位基因ALAD2的儿童血铅水平几何均数为117 μg/L，携有等位基因ALAD1的儿童血铅水平几何均数为97 μg/L；(3)儿童血铅水平相关因素分析发现，儿童ALAD基因型、性别、父亲职业等9个因素与血铅显著相关。采用多元逐步回归分析，发现ALAD基因型对血铅水平的影响在排除协变量影响后仍有极显著的统计学意义。 结论 本组儿童ALAD基因存在遗传多态性；携有含ALAD2等位基因的人群可能为铅毒性作用的高危人群。z
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Screening of high risk children for lead poisoning by analysing δ-aminolevulinate dehydratase (ALAD) genotype
WU Shenghu, SHEN Xiaoming, YAN Chonghuai, et al. Department of Pediatrics, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatric Medical Research, Shanghai 200092, China
【Abstract】 Objective To explore the relationship between blood lead levels and the genetic polymorphism of the δ-aminolevulinate dehydratase (ALAD) gene. Methods The erythrocyte ALAD isozyme phenotypes and the blood lead levels were determined in a population of 229 pre-school children and primary school students aged 6-10 years. Both the school and their homes were within one community where a large smelter is located. An environmental questionnaire was filled for each subject. Results (1) The gene distribution of the ALAD isozyme phenotypes in these children was ALAD 1-1, 92.1%; ALAD 1-2, 7.9 %; no ALAD 2-2 was detected. (2) The mean blood lead levels of the environmentally exposed children who were homozygous for the ALAD1 allele was 97 μg/L while the mean levels for those who were heterozygous for the ALAD2 was 117 μg/L or 20 μg/L higher. (3) Many factors were found to affect the blood lead levels, such as gender, ALAD isozyme phenotype, educational level of fathers and so on. After controlling these possible confounding variables by multiple regression, the contribution of the ALAD isozyme phenotype to the blood lead levels was still statistically significant. Conclusion These results indicate that individuals carrying the ALAD2 allele are more likely to have sustained increases in blood lead levels when exposed to a lead contaminated environment. The finding supports the hypothesis that individuals with the ALAD2 allele may be more susceptible to lead poisoning.
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【Key words】 Lead poisoning; Child; Aminolevulinic acid dehydratase; Genotype; Alleles
在以往的流行病学研究中，人们发现，处于相似铅暴露环境的儿童有的血铅水平很高，而有些血铅水平并不增高；同样血铅水平的儿童有的表现出明显的智能发育障碍，而有些表现则不明显。这说明，除了环境暴露因素外，机体的易感性也是铅毒性作用的重要决定因素。国外研究发现，机体对铅毒性作用的易感性与δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶(δ-aminolevulinate dehydratase，ALAD)的遗传多态性有关。中国儿童是否也存在类似现象？本研究就此进行了探讨。
对象和方法
一、对象
在浙江省兰溪市某铅作业工厂子弟小学及该小学邻近厂区整群抽取学前班和1～3年级儿童共计229名。
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二、方法
1.标本留取和表格填写及赋值：抽取肘静脉血2 ml，分置2管，每管各1 ml，采用EDTA(7%，10 μl)抗凝，第1管留测定血红蛋白和血铅，第2管分离白细胞、抽提DNA,供进一步做聚合酶链反应及酶切分析。
同时在专职医生指导下由家长根据统一标准填写一份本中心自行编制的儿童铅中毒调查专用的“儿童家庭社会环境与健康问卷”。问卷内容涉及家庭一般情况、儿童个人情况、家庭社会环境以及父母情况等27个问题。并对每个变量按统一标准进行相应的赋值(赋值方法：根据文献报道可能为儿童铅中毒危险因素的变量赋值高，如：ALAD基因型，ALAD1-1型赋值为1、ALAD1-2型赋值为2；性别，女赋值为1、男赋值为2；文化程度越低赋值越高；职业层次越低赋值越高等)。
2.白细胞分离、DNA抽提：常规苯酚、氯仿法抽提基因组DNA。
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3.ALAD基因型分析：(1)PCR扩增ALAD基因上一个长度为916 bp片段。PCR引物:上游引物：5′-AGACAGACATTAGCTCAGTA-3′；下游引物：3′-GGCAAAGACCACGTCCATTC-5′。(2)ALAD基因型分析：用内切酶MspⅠ对PCR扩增的ALAD基因片段(916 bp)进行酶解，并辅以内切酶BsrFⅠ进行确认。酶解产物用琼脂糖凝胶电泳,通过分析带型的变化识别有无基因突变，以确定本组ALAD基因型。
4.统计方法：首先对儿童血铅水平进行描述性统计及正态性检验，然后以直线相关分析ALAD基因型、性别、父亲文化、父亲职业等各变量对血铅水平对数的影响，筛选出有统计学意义的变量。以血铅水平对数为因变量进行多元逐步回归分析。统计分析用Statistica for Windows 5.0软件。
结果
一、229例儿童血铅水平描述性统计结果
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229例儿童血铅经正态性检验为非正态分布，故采用几何均数表示，G＝99 μg/L(log
±slg 为1.993 9±0.130 0)。 血铅水平范围45 μg/L～264 μg/L。二、229例儿童ALAD基因型分析结果
229例儿童中ALAD1-1 为211例，占92.1%；ALAD1-2为18例，占7.9%；未发现ALAD2-2。
三、229例儿童血铅水平与ALAD基因型关系分析
从表1可以看出ALAD 1-2型血铅水平几何均数平均比ALAD 1-1型高20 μg/L，两者之间的差异有显著性(t=2.573 3, P=0.010 7)，表明ALAD 1-2型个体的血铅水平可能较ALAD 1-1型者高。
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表1 ALAD基因型与血铅水平之间的关系 基因型
例数
几何均数G(μg/L)
log
±slgALAD 1-1
211
97
1.987 5±0.131 0
ALAD 1-2
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18
117
2.068 7±0.089 6
注：两组比较t=2.573 3，P=0.010 7 四、229例儿童血铅水平相关因素单因素相关分析
在该分析中，本组研究以调查问卷中27个变量及血红蛋白、家庭社会经济状况(父母文化、父母职业之和)家庭、社会经济状况(SES)共29个变量逐个与儿童血铅水平对数进行相关分析，发现ALAD基因型、性别、父亲职业层次、父亲文化、领养人文化程度、居住路边距离、燃料类型、SES、母亲文化程度等9个变量与儿童血铅水平呈显著正相关。
五、多元逐步回归分析
对29个变量进行多元逐步回归分析，以排除掺杂因素的干扰。结果见表2。回归方程为：y(血铅)＝1.587 9+0.123 4x2+0.158 7x5+0.128 3x23+0.152 2x28+0.179 7x29 。所得回归方程为：F(11，217)=4.685 4, P<0.01。
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表2 229名儿童血铅水平影响因素
多元逐步回归分析结果 入选变量
系数
标准误
t值
P值
截距
1.587 9
0.076 8
x29领养人文化
0.179 7
0.080 6
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2.23
0.026 9
x5 ALAD基因型
0.158 7
0.061 8
2.57
0.010 9
x28父亲文化程度
0.152 2
0.074 6
2.04
0.042 5
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x23燃料类型
0.128 3
0.064 7
1.98
0.048 5
x2性别
0.123 4
0.062 4
1.98
0.049 4
多元逐步回归分析表明，最终进入儿童血铅水平对数回归方程共有5个变量，按其对因变量血铅水平对数的影响由大到小分别为ALAD基因型、领养人文化程度、父亲文化程度、厨房燃料类型、性别。其中ALAD基因型对血铅水平的显著贡献在排除掺杂因素的作用后依然存在，表明ALAD基因型对儿童血铅水平确实有影响。
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讨论
一、影响儿童血铅水平的相关因素
人体内的铅全部来自外界环境，外界环境中的铅主要由消化道和呼吸道进入儿童体内。以往的调查均发现，血铅水平受多个因素影响。寻找影响儿童血铅水平的相关因素是进行儿童铅中毒预防的前提。
国内的研究发现，儿童的血铅水平受父母文化、父母职业、领养人文化和SES等因素影响[1]。本研究调查了29个可能影响儿童血铅水平的因素，经单因素分析发现，ALAD1-2型、父亲职业层次低、父母亲文化程度低、领养人文化程度低、以煤为厨房燃料、SES分值高、房屋距马路近、男孩等可能是儿童铅中毒的危险因素。采用多元逐步回归分析以排除各影响因素间的交互作用，结果发现，对儿童血铅水平对数具有统计学意义的变量有5个，按影响大小依次为ALAD基因型、领养人文化程度(本组儿童领养人多为母亲)、父亲文化程度、燃料类型、性别。
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研究已证实领养人及父亲文化程度与儿童的血铅水平密切相关，领养人及父亲文化程度较低的家庭，儿童的血铅水平往往较高。由于煤炭都含有一定量的铅，燃烧过程中释放的铅会造成铅污染。上海市的研究发现，以煤制品为燃料的家庭，其室内空气中平均含铅量比室外空气高18倍，这些家庭儿童血铅浓度也明显高于非燃煤家庭儿童的血铅浓度[2]。美国的研究已多次证实，除了1～2岁年龄组男性血铅水平略高于女性外，其余各年龄组，男性的血铅水平明显高于女性[3]。与我们的研究结果一致。男、女血铅水平之间的性别差异究竟是由于男性暴露于铅污染环境的机会较多，还是铅代谢本身存在着性别差异，尚无明确的结论。
二、ALAD基因型对儿童血铅水平的影响
环境中的铅是造成儿童铅中毒的根本原因，也是影响铅毒性的重要因素，但并不是唯一因素。除了环境暴露因素外，机体的易感性也是铅毒性作用的重要决定因素。国外研究发现，机体对铅毒性作用的易感性和ALAD的遗传多态性有关[3]。
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本研究调查了229例儿童血铅水平并检测了这些研究对象的ALAD基因型，经单因素分析表明，携有等位基因ALAD2个体的血铅水平较携有等位基因ALAD1个体的血铅水平有显著增高，平均高20 μg/L (P<0.05)。在关于儿童血铅影响因素的多元逐步回归方程中，ALAD基因型变量被引入，且回归方程有显著意义。这表明在排除了掺杂因素影响后，ALAD基因型对儿童血铅水平的影响依然存在。此结果说明ALAD基因型对儿童血铅水平确有影响。因此我们可推测本组儿童中携有ALAD2等位基因个体可能对环境中的铅更易感。本组儿童ALAD基因的突变频率(7.9%)低于美国(11%)及德国(21%)[4]。由于本研究样本量较小，有关中国儿童ALAD基因的突变频率及其对血铅水平的影响尚需进一步研究。
三、ALAD基因型对铅毒性影响的机制
1.遗传学基础：有关铅毒性作用遗传学基础的研究尚不多见，目前的研究主要集中在ALAD[5]。ALAD存在遗传多态现象，ALAD由单个基因ALAD基因编码,位于染色体9q34,有2个等位基因(ALAD1和ALAD2)，在欧洲人群中两者出现的频率为9∶1。这两种等位基因的不同表达组成了3种遗传表现型。最近的研究表明，儿童表现为杂合子和2- 2型纯合子者对铅中毒的易感性增高[4,6,7]。Wetmur等[4]进行一大样本的研究发现，等位基因ALAD2的出现和儿童血铅增高有关。出现等位基因ALAD2的人群中，血铅水平超过300 μg/L的比例明显增高。Wetmur等[4]研究发现，ALAD2-2型和ALAD1-2型个体在受到铅暴露时更容易发生高血铅和铅中毒，是铅毒性的易感和高危人群。同样环境铅暴露水平携带ALAD2等位基因的纯合子个体的血铅要比携带等位基因ALAD1高100 μg/L。Wetmur等[4]估计等位基因ALAD2对血铅水平的贡献要占血中总铅的40%，因此，ALAD2是人类铅毒性遗传易感性的标志，该基因携带者是铅毒性的易感人群。
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2.分子机制：1991年Wetmur等[4]发现ALAD2等位基因是由于基因序列上第177位核苷酸(第59位氨基酸)发生G→C突变。这个突变的结果是带正电荷的赖氨酸被电中性的精氨酸代替(K59N突变)。这是ALAD1和ALAD2多肽的主要区别[7]。两种不同类型的氨基酸替换可改变酶构象而使酶活性发生改变。由于ALAD酶构象的改变，增加了ALAD2亚单位与铅的亲和力，使ALAD2亚单位与铅的结合更为紧密，从而导致携有ALAD2亚单位的个体(ALAD2-2型和ALAD1-2型)在受到铅暴露时更容易发生高血铅和铅中毒。此外，ALAD多态性影响铅的毒性代谢动力学，使铅的生物利用度降低，导致铅在体内循环池中长期蓄积[8,9]。
四、临床意义
, http://www.100md.com 由于携带等位基因ALAD2的人群可能是铅毒性的易感人群，如果我们能通过建立某种快速、简便的方法，将那些遗传特性上对铅毒性高度易感的人群(即高危人群)筛查出来，对他们进行重点预防(如进行小环境干预、针对性健康教育、个体化药物预防等)，可望在现有条件下明显减轻环境铅污染对儿童健康的危害，提高儿童的健康水平。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970645)
作者单位：周建德(200092 上海第二医科大学新华医院儿科 上海市儿科医学研究所)
参考文献
1，崇淮，沈晓明，章依文，等.上海市儿童血铅水平及其影响因素的流行学研究.中华儿科杂志, 1998, 36:142-145.
2，沈晓明. 儿童铅中毒. 北京：人民卫生出版社，1996. 42-43.
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3，Brody DJ , Pirkle JL, Kramer RA, et al. Blood lead levels in the US population. JAMA, 1994, 272:277-283.
4，Wetmur JG, Lehner G, Desnick RJ. The δ-aminolevulinate dehydratase polymorphism: high blood lead levels in lead workers and environmentally exposed children with the 1-2 and 2-2 isozymes. Environ Res, 1991, 56:109-119.
5，吴胜虎，颜崇淮，沈晓明. ALAD基因型与儿童铅毒性易感性.国外医学儿科学分册, 1999, 26:85-87.
6，Wetmur JG. Influence of the common human δ-aminolevulinate dehydratase polymorphism on lead body burden. Environ Health Perspect, 1994,102:215-219.
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7，Wetmur JG, Kara AH, Pleminska M, et al. Molecular characterization of the human δ-aminolevulinate dehydratase 2(ALAD2) allele: implications for molecular screening of individuals for genetic susceptibility to lead poisoning. Am J Hum Genet, 1991,49:757-763.
8，Fleming DE, Chettle DR, Wetmur JG, et al. Effect of the delta-aminolevulinate dehydratase polymorphism on the accumulation of lead in bone and blood in lead smelter workers. Environ Res, 1998,77:49-61.
9，Alexander BH, Checkoway H, Mallen PC, et al. Interaction of blood lead and δ-aminolevulinic acid dehydratase genotype on markers of heme synthesis and sperm production in lead smelter workers. Environ Health Perspect, 1998, 106:213-216.
(收稿日期：1999-08-19), 百拇医药