肺炎链球菌耐药性和血清型分布及隐匿性耐药克隆株的研究
作者：俞桑洁 王槿芳 李洁 李艳 王雪莲 Whitney CG Levine OS Dowell SF 杨永弘
单位：俞桑洁(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；王槿芳(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；李洁(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；李艳(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；杨永弘(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；王雪莲(首都医科大学附属北京儿童医院)
关键词：链球菌，肺炎；抗药性，微生物；疫苗，结合；带病原状态
中华儿科杂志000706 【摘要】 目的 了解儿童肺炎链球菌携带者耐药菌株的流行情况，比较携带者菌株血清型与肺炎链球菌结合疫苗血清型的符合率，寻找单个患儿同时携带敏感和耐药菌株的可能性。方法 (1)对1997年11月～12月在北京儿童医院普通门诊登记的3个月～5岁儿童进行问卷调查；(2)采集鼻咽拭子和尿标本，培养、分离和鉴定肺炎链球菌，并测定尿标本中的抗生素活性；(3)根据NCCLS方法使用微量稀释法测定肺炎链球菌对青霉素、头孢呋新、头孢噻肟、复方新诺明、红霉素和氯霉素的敏感性；(4)从最初发现的青霉素、红霉素敏感株中寻找“隐匿性耐药克隆株”。结果 (1)502例受试儿童中，分离出190株肺炎链球菌，携带率为37.8%(190/502)，对青霉素的敏感率为91.1%；(2)只有33.9%的菌株血清型与建议使用的肺炎链球菌结合疫苗血清型相符；(3)42例含青霉素和红霉素敏感菌株鼻咽拭子中发现6株(14%)“隐匿性耐药克隆株”。结论 在携带者中，肺炎链球菌对β-内酰胺类耐药还不常见，但对红霉素和复方新诺明耐药却非常严重；建议使用的结合疫苗血清型不能覆盖大部分携带菌株；耐药菌株的小部分隐匿在敏感菌株中，抗生素使用可能导致耐药菌株暴露出来。
, 百拇医药
Resistance, serotypes and “hidden resistant clones” of Streptococcu pneumoniae among children in Beijing
YU Sangjie, WANG Jinfang, LI Jie, et al. Laberatory of Microbiology and Immunology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing 100045, China
【Abstract】 Objective Streptococcus pneumoniae (Sp) has long been one of the most important bacterial pathogen causing pneumonia, meningitis, otitis media, sinusitis, and septicemia. During the recent 2 decades, the resistance of Sp to penicillin has been rapidly increasing in many parts of the world. The authors designed the present study to determine the prevalence of drug resistance among streptococcus pneumoniae carried by children in China, to determine the prevalence of vaccine serotypes among carriage strains and to look for carriage of both susceptible and resistant Sp clones in individual patients. Methods The subjects enrolled 502 patients with upper respiratory infections who were 3 months to 5 years of age attending a general outpatient clinic at Beijing Children′s Hospital from Nov. to Dec.1997. A standardized questionnaire addressing age, symptoms of upper respiratory infections, recent antimicrobial use, breastfeeding, day care attendance, household size, smoke exposure, and parental education was completed for all the cases. Nasopharyngeal specimens and urine were collected for culture and antimicrobial activity, respectively. Sp was identified by optochin sensitivity and bile solubility. Sp serotyping was performed by using quelling reaction. Sensitivity to penicillin, cefuroxime, co-trimoxazole, erythromycin, and chloramphenicol was determined using broth microdilution according to NCCLS methods. Urine sensitivity for antimicrobial activity was tested by pan-susceptible Micrococcus luteus method. Forty-two swabs were checked for “hidden clones” by selective plates containing penicillin or erythromycin compared to isolates found on gentamycin using antimicrobial susceptibility, serotype, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). ResultsNasopharyngeal carriage of Sp among less than 5 years old children was 37.8% of the 502 subjects with upper respiratory infections. Beta-lactam non-susceptible strains remain uncommon (only 8%～9%) in this population. Resistance to erythromycin and co-trimoxazole was very common (more than 70%). Only 33.9% of the isolates were those included in proposed pneumococcal conjugate vaccine formulations. Forty-two samples containing Sp susceptible to both penicillin and erythromycin were tested for “hidden resistant clones” and 6 (14%) resistant clones were found. Conclusions Beta-lactam resistance remains uncommon among the subjects studied in spite of widespread beta-lactam use. However, it is necessary to monitor beta-lactam resistance every year. Erythromycin and co-trimoxazole resistance was very common. Erythromycin-resistant strains were more common in children who recently took a macrolide. A small number of antibiotics-resistant Sp strains were present in patients carrying susceptible Sp strains. Therefore, use of antimicrobial agents could lead to prominence of these resistant strains. Use of antibiotics might eradicate susceptible strains, but would leave the resistant strains alive in mucous membrane, which could be more dangerous for invasive disease. This study showed that the proposed conjugate vaccine serotypes did not cover majority of strains isolated; however, the distribution for invasive Sp strains may differ. Therefore, more studies should be done in this field in China.
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【Key words】 Streptococcus pneumoniae; Drug resistance, microbial; Vaccines, conjugate; Carrier state
肺炎链球菌是一个引起所有年龄组高发病率和病死率的主要致病菌，尤其在儿童和老年人，包括发展中国家和发达国家。1941年，每天10 000单位青霉素4次给药，连用4 d可治愈肺炎链球菌性肺炎患者，而今接受每天24 000 000单位青霉素，仍有死于肺炎链球菌感染的患者[1]。我国抗生素过度使用的现象较为普遍，但对耐药菌株流行病学情况知之甚少。一般认为，抗生素的使用可导致杀死敏感菌株，却使耐药菌株存活下来，并引发疾病。疫苗预防接种可减少抗生素的使用和降低耐药菌株出现的压力。为此我们对502例上呼吸道感染患儿进行了肺炎链球菌鼻咽部携带率和耐药情况的调查，寻找“隐匿性耐药克隆株”，比较我国肺炎链球菌的血清型与建议使用的结合疫苗血清型的差异，旨在为临床合理用药和肺炎链球菌结合疫苗的合理使用提供科学依据。
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资料和方法
一、 资料收集
1. 问卷对象：对1997年11月～12月在北京儿童医院普通门诊登记的3个月～5岁的上呼吸道感染患儿做问卷调查，合格答卷共502份，将502例作为研究对象。
2. 问卷内容：年龄、性别、上呼吸道感染症状、最近使用抗生素情况、既往和目前母乳喂养情况、入托情况、家居面积、接触吸烟者情况和父母受教育情况等。
3. 采集受试者鼻咽拭子和尿标本用于细菌培养和抗生素活性试验。
二、 检测方法
1. 细菌培养：鼻咽拭子标本首先放入含脱脂奶，葡萄糖和甘油的转运培养基中，再接种到含庆大霉素的胰大豆琼脂 (tryptone soya agar，TSA)血平皿上，然后在35℃，5% CO2 过夜孵育。
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2. 肺炎链球菌的鉴定：用Optochin敏感性和胆汁溶解试验。
3. 药物敏感试验：根据美国临床实验室国家标准化委员会(NCCLS)的标准，使用微量稀释法测定细菌对青霉素、头孢呋新、头孢噻肟、复方新诺明、红霉素和氯霉素的敏感性(采用Sensititre 96孔板，美国疾病控制中心赠)。
4. 在普通血琼脂平皿上接种对所有抗生素均非常敏感的微球菌(ATCC3947)，用无菌滤纸片浸入受试者尿标本，然后放入含微球菌的普通血琼脂平皿上，35℃，5%CO2过夜孵育，通过测定滤纸周围抑菌环大小来判断抗生素的活性。
5. 肺炎链球菌分型：使用Quellung反应方法。
6. 寻找“隐匿性耐药克隆株”：用最初发现对青霉素和红霉素敏感的肺炎链球菌，转运培养接种在以下TSA血平皿上：(1)只含庆大霉素 (5.0 μg/ml)；(2)含庆大霉素和青霉素(0.25 μg/ml)；(3)含庆大霉素和红霉素(1.0 μg/ml)。用在含青霉素或红霉素TSA血平皿上生长的菌株与只含庆大霉素TSA血平皿上生长的菌株进行比较：(1)抗生素的敏感性；(2)血清型；(3)脉冲电场凝胶电泳(PFGE)。
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结果
一、 问卷调查结果
合格的受试儿童502名，问卷调查内容包括年龄、性别、上呼吸道感染症状、最近使用抗生素情况、既往和目前母乳喂养情况、入托情况、家居面积、接触吸烟者情况和父母受教育情况等，结果如表1。
表1 502例上呼吸道感染儿童的一般情况 一般情况
百分率(%)
咳嗽
96.8
流涕
79.6
发热
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55.1
耳痛
6.6
最近3个月看过病
57.2
目前母乳喂养
16.5
入托幼儿园
49.1
母亲高中以上文化程度
50.0
与成人吸烟者一同居住
60.2
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注：家中共同居住人数(中位数)4人 二、 抗生素使用情况
1.358名受试者称最近1个月服用过抗生素。
2.将尿抗生素活性与抗生素使用情况进行对照，502例中两项对照完整的405例，经一致性χ2检验，χ2=67.35， P<0.01, 说明两者有一致性；差异性McNemar χ2检验，χ2M ＝0.9, P>0.05, 说明两者差异无显著意义(表2)。
表2 502例尿抗生素活性与抗生素使用对照(例数) 尿抗生素
活性
抗生素使用
合计
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有
无
不明
有
259
50
13
322
无
40
56
5
101
未查
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59
15
5
79
合计
358
121
23
502
三、肺炎链球菌的携带情况
1. 502例受试患儿中190例携带肺炎链球菌，携带率为37.8%。
2. 最近1个月使用过抗生素的患儿携带率是较低的[相对危险度(RR) 0.5， 95%可信区间(95% CI) 0.4～0.6]。
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3. 将使用过抗生素的患儿进行对照，母亲具有初中以上文化水平的患儿携带率低(RR 0.7，95% CI 0.6～0.9)；有耳痛的患儿携带率高(RR 1.7，95%CI 1.2～2.3)。
4. 以未使用抗生素者为对照组，使用过不同抗生素者肺炎链球菌携带率均较低，RR减少，u检验结果P<0.05，P<0.01(表3)。
表3 抗生素对肺炎链球菌携带率的影响 组别
例数
携带肺炎链球菌
RR
(95%CI)
u值
例数
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携带率(%)
没有用抗生素
131
79
60.31
1.00
使用青霉素
181
37
20.44
0.34(0.25～0.47)
6.60*
, http://www.100md.com 使用头孢菌素
137
39
28.47
0.47(0.34～0.66)
4.33*
使用大环内酯
类抗生素
93
37
39.78
0.66
(0.45～0.96)
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2.19**
* P<0.01， ** P<0.05
四、肺炎链球菌的耐药情况
1. 对190株肺炎链球菌的药敏试验中，对青霉素、红霉素和复方磺胺甲基异唑的敏感率分别为91.1%、23.2%和25.3%(表4)。
2. 最近1个月服用大环内酯类药的儿童携带耐红霉素菌株的可能性更大(39%比27% RR 1.5，95% CI 1.1～2.0)。
表4 190 株肺炎链球菌Sensititre法药敏结果分布(%)
抗生素种类
敏感
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中度敏感
耐药
青霉素
91.1
7.4
1.6
头孢呋新
95.8
1.6
2.6
头孢噻肟
100
0
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0
红霉素
23.2
0
76.8
复方磺胺甲基异唑
25.3
53.2
21.6
氯霉素
77.4
0
22.6
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五、隐匿性耐药克隆株
对42份含有对青霉素和红霉素敏感的肺炎链球菌的标本做了“隐匿性耐药克隆株”的检测，共发现6株“隐匿性耐药克隆株”，占14%。将这6株菌株分别编号为1～6号，其中4号菌株分离出3种菌株，即对青霉素和红霉素均敏感的6A型菌株、对青霉素不敏感的不能分型菌株和对红霉素不敏感的6A型菌株，经过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分析，虽然两种6A型菌株血清型相同，但分子生物学分型不同，因此这3种菌株是不同型的肺炎链球菌。其他结果见表5。
表5 6株隐匿性耐药克隆株血清型和PFGE结果 编号
敏感菌株
血清型
青霉素不敏感
菌株血清型
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红霉素不敏感
菌株血清型
PFGE结果
1
11
6A
2
15C
23F
3
35F
14
4
, 百拇医药 6A
NT*
6A
3种不同型
5
NT*
6A
6
34
23F
23F
23F相同
但不同于34
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* NT示不能分型 六、190株肺炎链球菌的血清分型
在所有菌株中排在前6位的常见血清型是6A、23F、不能分型、6B、19F和14 型, 分别占13.2%、11.6%、11.1%、7.4%、7.4%和5.3%。只有33.9%的菌株血清型包括在建议使用的肺炎链球菌结合疫苗成分中(4、6B、9V、14、18C、19F、23F+/- 1和5)。对青霉素不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型分别为19F、23F、不能分型、15B、19B、33F；对红霉素不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型为16A、23F、19F、不能分型、6B、14型；对复方磺胺甲基异唑不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型为23F、6A、不能分型、6B、19F、14型。
讨论
最近20年来，耐青霉素肺炎链球菌在世界许多地区快速增长， 严重威胁全世界人民健康。目前在世界许多国家都开展了耐青霉素肺炎链球菌的流行病学调查研究，例如，美国、南非、法国、韩国、中东欧和南美等国[2-7]。目前主要焦点出现在以下10个地区[8]：(1) 亚洲(韩国、日本、越南、泰国)；(2) 西南欧(西班牙、法国、葡萄牙)；(3) 中东欧(匈牙利、罗马尼亚、保家利亚、土耳其)；(4) 俄罗斯西北部；(5) 南非；(6) 巴布亚新几内亚；(7) 阿拉斯加；(8) 美国东南部；(9) 美国西南部；(10) 南美。亚洲耐药菌株高发的四国均是我国的邻国，但从我们这次检测的结果来看，北京地区肺炎链球菌的总携带率为37.8%，对青霉素的敏感率为91.0%，不敏感率为9.0%，而韩国、日本、越南、泰国的不敏感率分别为79.7%、65.3%、60.8%和57.9%，差异有显著意义。对红霉素和复方磺胺甲基异唑不敏感率分别为76.8%和74.7%，而韩国分别为77.8%和62.6%，差异无显著意义。[9]我们的结论是，目前在我国β-内酰胺类的耐药还不常见，但红霉素和复方磺胺甲基异唑耐药却非常严重，红霉素耐药菌株最常见于近期服用过大环内酯类药物的儿童。
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美国疾病控制中心对1978～1994年从3 884例6岁以下儿童中分离出的肺炎链球菌进行血清分型，常见的7种血清型是14、6B、19F、18C、23F、4和9V，占所有菌株的78%。因此美国的Wyeth Lederle 公司以此为依据，研制出一种7价的肺炎链球菌结合疫苗。此疫苗可以防止86%的菌血症，83%的脑膜炎和65%的中耳炎[10]。在我们的研究发现，只有33.9%的菌株包含在这7价结合疫苗中。有人认为, 咽部携带的肺炎链球菌在一定程度上代表侵袭性肺炎链球菌[11]。由此我们认为，中国侵袭性肺炎链球菌的分布可能不同于欧美地区，是否在中国推广这种结合疫苗还须进一步调查研究。
耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径[12]：克隆传播和基因水平转移。前者是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。后者是把耐药基因转移到敏感菌株中。过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。我们从42例携带敏感菌株的标本中又发现6株被隐匿的耐药菌株，其中2株对青霉素不敏感，其血清型和PFGE结果与敏感菌株的不同。这一发现证实鼻咽部存在隐匿性耐药克隆株。随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。
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志谢 北京儿童医院门诊部、检验科细菌室、儿科研究所微生物室和江载芳教授
作者单位：Whitney CG(美国疾病控制中心)
Levine OS(美国疾病控制中心)
Dowell SF(美国疾病控制中心)
参考文献
1，Austrian R. The pneumococcus at the millennium:not down,not out.J Infect Dis,1999,179 Suppl:338-341.
2，Spika JS, Facklam RR, Plikaytis BD, et al. Antimicrobial resistance of streptococcus pneumoniae in the United States 1979-1987. J Infect Dis, 1991, 163: 1273-1278.
, 百拇医药
3，Martin C, Sibold C, Hakenbeck R. Relatedness of penicillin-binding protein 1a gene from different clones of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae isolated in South Africa and Spain. EMBO J, 1992, 11: 3831-3836.
4，Lefevre JC, Bertrand MA, Faucon G. Molecular analysis by pulsed-field gel electrophoresis of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae from Toulouse, France. Eur Clin Microbiol Infect Dis, 1995,14: 491-497.
, 百拇医药 5，Song IH, Yang JW, Peck KR, et al. Spread multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in South Korea. Clin Infect Dis, 1997, 25: 747-749.
6，Appelbaum PC, Gladkova C, Hryniewicz W, et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-A multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis, 1996, 23: 712-717.
7，Tomasz A, Corso A. Molecular epidemiologic characterization of penicillin-resistant invasive pediatric isolates recovered in six Latin-American countries: an overview. Microb Drug Dis, 1998, 4: 195-207.
, 百拇医药
8，Baquero F. Pneumococcal resistance to beta-lactam antibiotics: a global geographic overview. Microb Drug Resist, 1995, 1:115-120.
9，Song JH, Lee NY, Ichiyama S. Spread of drug-resistant Streptococcus pneumoniae in Asian countries: Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP) Study. Clin Infect Dis 1999,28:1206-1211.
10，Butler JC, Breiman RF, Lipman HB, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994: implication for development of a conjugate vaccine. J Infect Dis, 1995, 171:885-889.
11，Lloyd-Evans N, O′Dempsey TJD, Baldeh I, et al. Nasopharyngeal carriage of pneumococci in Gambian children and in their families. Pediatr Infect Dis J, 1996, 15: 866-871.
12，王辉, 陈民均. 耐青霉素肺炎链球菌的分子生物学特征. 国外医药抗生素分册, 1998, 19: 292.
(收稿日期：1999-07-30), http://www.100md.com
单位：俞桑洁(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；王槿芳(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；李洁(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；李艳(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；杨永弘(100045 北京市儿科研究所微生物免疫室)；王雪莲(首都医科大学附属北京儿童医院)
关键词：链球菌，肺炎；抗药性，微生物；疫苗，结合；带病原状态
中华儿科杂志000706 【摘要】 目的 了解儿童肺炎链球菌携带者耐药菌株的流行情况，比较携带者菌株血清型与肺炎链球菌结合疫苗血清型的符合率，寻找单个患儿同时携带敏感和耐药菌株的可能性。方法 (1)对1997年11月～12月在北京儿童医院普通门诊登记的3个月～5岁儿童进行问卷调查；(2)采集鼻咽拭子和尿标本，培养、分离和鉴定肺炎链球菌，并测定尿标本中的抗生素活性；(3)根据NCCLS方法使用微量稀释法测定肺炎链球菌对青霉素、头孢呋新、头孢噻肟、复方新诺明、红霉素和氯霉素的敏感性；(4)从最初发现的青霉素、红霉素敏感株中寻找“隐匿性耐药克隆株”。结果 (1)502例受试儿童中，分离出190株肺炎链球菌，携带率为37.8%(190/502)，对青霉素的敏感率为91.1%；(2)只有33.9%的菌株血清型与建议使用的肺炎链球菌结合疫苗血清型相符；(3)42例含青霉素和红霉素敏感菌株鼻咽拭子中发现6株(14%)“隐匿性耐药克隆株”。结论 在携带者中，肺炎链球菌对β-内酰胺类耐药还不常见，但对红霉素和复方新诺明耐药却非常严重；建议使用的结合疫苗血清型不能覆盖大部分携带菌株；耐药菌株的小部分隐匿在敏感菌株中，抗生素使用可能导致耐药菌株暴露出来。
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Resistance, serotypes and “hidden resistant clones” of Streptococcu pneumoniae among children in Beijing
YU Sangjie, WANG Jinfang, LI Jie, et al. Laberatory of Microbiology and Immunology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing 100045, China
【Abstract】 Objective Streptococcus pneumoniae (Sp) has long been one of the most important bacterial pathogen causing pneumonia, meningitis, otitis media, sinusitis, and septicemia. During the recent 2 decades, the resistance of Sp to penicillin has been rapidly increasing in many parts of the world. The authors designed the present study to determine the prevalence of drug resistance among streptococcus pneumoniae carried by children in China, to determine the prevalence of vaccine serotypes among carriage strains and to look for carriage of both susceptible and resistant Sp clones in individual patients. Methods The subjects enrolled 502 patients with upper respiratory infections who were 3 months to 5 years of age attending a general outpatient clinic at Beijing Children′s Hospital from Nov. to Dec.1997. A standardized questionnaire addressing age, symptoms of upper respiratory infections, recent antimicrobial use, breastfeeding, day care attendance, household size, smoke exposure, and parental education was completed for all the cases. Nasopharyngeal specimens and urine were collected for culture and antimicrobial activity, respectively. Sp was identified by optochin sensitivity and bile solubility. Sp serotyping was performed by using quelling reaction. Sensitivity to penicillin, cefuroxime, co-trimoxazole, erythromycin, and chloramphenicol was determined using broth microdilution according to NCCLS methods. Urine sensitivity for antimicrobial activity was tested by pan-susceptible Micrococcus luteus method. Forty-two swabs were checked for “hidden clones” by selective plates containing penicillin or erythromycin compared to isolates found on gentamycin using antimicrobial susceptibility, serotype, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). ResultsNasopharyngeal carriage of Sp among less than 5 years old children was 37.8% of the 502 subjects with upper respiratory infections. Beta-lactam non-susceptible strains remain uncommon (only 8%～9%) in this population. Resistance to erythromycin and co-trimoxazole was very common (more than 70%). Only 33.9% of the isolates were those included in proposed pneumococcal conjugate vaccine formulations. Forty-two samples containing Sp susceptible to both penicillin and erythromycin were tested for “hidden resistant clones” and 6 (14%) resistant clones were found. Conclusions Beta-lactam resistance remains uncommon among the subjects studied in spite of widespread beta-lactam use. However, it is necessary to monitor beta-lactam resistance every year. Erythromycin and co-trimoxazole resistance was very common. Erythromycin-resistant strains were more common in children who recently took a macrolide. A small number of antibiotics-resistant Sp strains were present in patients carrying susceptible Sp strains. Therefore, use of antimicrobial agents could lead to prominence of these resistant strains. Use of antibiotics might eradicate susceptible strains, but would leave the resistant strains alive in mucous membrane, which could be more dangerous for invasive disease. This study showed that the proposed conjugate vaccine serotypes did not cover majority of strains isolated; however, the distribution for invasive Sp strains may differ. Therefore, more studies should be done in this field in China.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococcus pneumoniae; Drug resistance, microbial; Vaccines, conjugate; Carrier state
肺炎链球菌是一个引起所有年龄组高发病率和病死率的主要致病菌，尤其在儿童和老年人，包括发展中国家和发达国家。1941年，每天10 000单位青霉素4次给药，连用4 d可治愈肺炎链球菌性肺炎患者，而今接受每天24 000 000单位青霉素，仍有死于肺炎链球菌感染的患者[1]。我国抗生素过度使用的现象较为普遍，但对耐药菌株流行病学情况知之甚少。一般认为，抗生素的使用可导致杀死敏感菌株，却使耐药菌株存活下来，并引发疾病。疫苗预防接种可减少抗生素的使用和降低耐药菌株出现的压力。为此我们对502例上呼吸道感染患儿进行了肺炎链球菌鼻咽部携带率和耐药情况的调查，寻找“隐匿性耐药克隆株”，比较我国肺炎链球菌的血清型与建议使用的结合疫苗血清型的差异，旨在为临床合理用药和肺炎链球菌结合疫苗的合理使用提供科学依据。
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资料和方法
一、 资料收集
1. 问卷对象：对1997年11月～12月在北京儿童医院普通门诊登记的3个月～5岁的上呼吸道感染患儿做问卷调查，合格答卷共502份，将502例作为研究对象。
2. 问卷内容：年龄、性别、上呼吸道感染症状、最近使用抗生素情况、既往和目前母乳喂养情况、入托情况、家居面积、接触吸烟者情况和父母受教育情况等。
3. 采集受试者鼻咽拭子和尿标本用于细菌培养和抗生素活性试验。
二、 检测方法
1. 细菌培养：鼻咽拭子标本首先放入含脱脂奶，葡萄糖和甘油的转运培养基中，再接种到含庆大霉素的胰大豆琼脂 (tryptone soya agar，TSA)血平皿上，然后在35℃，5% CO2 过夜孵育。
, http://www.100md.com
2. 肺炎链球菌的鉴定：用Optochin敏感性和胆汁溶解试验。
3. 药物敏感试验：根据美国临床实验室国家标准化委员会(NCCLS)的标准，使用微量稀释法测定细菌对青霉素、头孢呋新、头孢噻肟、复方新诺明、红霉素和氯霉素的敏感性(采用Sensititre 96孔板，美国疾病控制中心赠)。
4. 在普通血琼脂平皿上接种对所有抗生素均非常敏感的微球菌(ATCC3947)，用无菌滤纸片浸入受试者尿标本，然后放入含微球菌的普通血琼脂平皿上，35℃，5%CO2过夜孵育，通过测定滤纸周围抑菌环大小来判断抗生素的活性。
5. 肺炎链球菌分型：使用Quellung反应方法。
6. 寻找“隐匿性耐药克隆株”：用最初发现对青霉素和红霉素敏感的肺炎链球菌，转运培养接种在以下TSA血平皿上：(1)只含庆大霉素 (5.0 μg/ml)；(2)含庆大霉素和青霉素(0.25 μg/ml)；(3)含庆大霉素和红霉素(1.0 μg/ml)。用在含青霉素或红霉素TSA血平皿上生长的菌株与只含庆大霉素TSA血平皿上生长的菌株进行比较：(1)抗生素的敏感性；(2)血清型；(3)脉冲电场凝胶电泳(PFGE)。
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结果
一、 问卷调查结果
合格的受试儿童502名，问卷调查内容包括年龄、性别、上呼吸道感染症状、最近使用抗生素情况、既往和目前母乳喂养情况、入托情况、家居面积、接触吸烟者情况和父母受教育情况等，结果如表1。
表1 502例上呼吸道感染儿童的一般情况 一般情况
百分率(%)
咳嗽
96.8
流涕
79.6
发热
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55.1
耳痛
6.6
最近3个月看过病
57.2
目前母乳喂养
16.5
入托幼儿园
49.1
母亲高中以上文化程度
50.0
与成人吸烟者一同居住
60.2
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注：家中共同居住人数(中位数)4人 二、 抗生素使用情况
1.358名受试者称最近1个月服用过抗生素。
2.将尿抗生素活性与抗生素使用情况进行对照，502例中两项对照完整的405例，经一致性χ2检验，χ2=67.35， P<0.01, 说明两者有一致性；差异性McNemar χ2检验，χ2M ＝0.9, P>0.05, 说明两者差异无显著意义(表2)。
表2 502例尿抗生素活性与抗生素使用对照(例数) 尿抗生素
活性
抗生素使用
合计
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有
无
不明
有
259
50
13
322
无
40
56
5
101
未查
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59
15
5
79
合计
358
121
23
502
三、肺炎链球菌的携带情况
1. 502例受试患儿中190例携带肺炎链球菌，携带率为37.8%。
2. 最近1个月使用过抗生素的患儿携带率是较低的[相对危险度(RR) 0.5， 95%可信区间(95% CI) 0.4～0.6]。
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3. 将使用过抗生素的患儿进行对照，母亲具有初中以上文化水平的患儿携带率低(RR 0.7，95% CI 0.6～0.9)；有耳痛的患儿携带率高(RR 1.7，95%CI 1.2～2.3)。
4. 以未使用抗生素者为对照组，使用过不同抗生素者肺炎链球菌携带率均较低，RR减少，u检验结果P<0.05，P<0.01(表3)。
表3 抗生素对肺炎链球菌携带率的影响 组别
例数
携带肺炎链球菌
RR
(95%CI)
u值
例数
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携带率(%)
没有用抗生素
131
79
60.31
1.00
使用青霉素
181
37
20.44
0.34(0.25～0.47)
6.60*
, http://www.100md.com 使用头孢菌素
137
39
28.47
0.47(0.34～0.66)
4.33*
使用大环内酯
类抗生素
93
37
39.78
0.66
(0.45～0.96)
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2.19**
* P<0.01， ** P<0.05
四、肺炎链球菌的耐药情况
1. 对190株肺炎链球菌的药敏试验中，对青霉素、红霉素和复方磺胺甲基异唑的敏感率分别为91.1%、23.2%和25.3%(表4)。
2. 最近1个月服用大环内酯类药的儿童携带耐红霉素菌株的可能性更大(39%比27% RR 1.5，95% CI 1.1～2.0)。
表4 190 株肺炎链球菌Sensititre法药敏结果分布(%)
抗生素种类
敏感
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中度敏感
耐药
青霉素
91.1
7.4
1.6
头孢呋新
95.8
1.6
2.6
头孢噻肟
100
0
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0
红霉素
23.2
0
76.8
复方磺胺甲基异唑
25.3
53.2
21.6
氯霉素
77.4
0
22.6
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五、隐匿性耐药克隆株
对42份含有对青霉素和红霉素敏感的肺炎链球菌的标本做了“隐匿性耐药克隆株”的检测，共发现6株“隐匿性耐药克隆株”，占14%。将这6株菌株分别编号为1～6号，其中4号菌株分离出3种菌株，即对青霉素和红霉素均敏感的6A型菌株、对青霉素不敏感的不能分型菌株和对红霉素不敏感的6A型菌株，经过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分析，虽然两种6A型菌株血清型相同，但分子生物学分型不同，因此这3种菌株是不同型的肺炎链球菌。其他结果见表5。
表5 6株隐匿性耐药克隆株血清型和PFGE结果 编号
敏感菌株
血清型
青霉素不敏感
菌株血清型
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红霉素不敏感
菌株血清型
PFGE结果
1
11
6A
2
15C
23F
3
35F
14
4
, 百拇医药 6A
NT*
6A
3种不同型
5
NT*
6A
6
34
23F
23F
23F相同
但不同于34
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* NT示不能分型 六、190株肺炎链球菌的血清分型
在所有菌株中排在前6位的常见血清型是6A、23F、不能分型、6B、19F和14 型, 分别占13.2%、11.6%、11.1%、7.4%、7.4%和5.3%。只有33.9%的菌株血清型包括在建议使用的肺炎链球菌结合疫苗成分中(4、6B、9V、14、18C、19F、23F+/- 1和5)。对青霉素不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型分别为19F、23F、不能分型、15B、19B、33F；对红霉素不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型为16A、23F、19F、不能分型、6B、14型；对复方磺胺甲基异唑不敏感的菌株中排在前6位的常见血清型为23F、6A、不能分型、6B、19F、14型。
讨论
最近20年来，耐青霉素肺炎链球菌在世界许多地区快速增长， 严重威胁全世界人民健康。目前在世界许多国家都开展了耐青霉素肺炎链球菌的流行病学调查研究，例如，美国、南非、法国、韩国、中东欧和南美等国[2-7]。目前主要焦点出现在以下10个地区[8]：(1) 亚洲(韩国、日本、越南、泰国)；(2) 西南欧(西班牙、法国、葡萄牙)；(3) 中东欧(匈牙利、罗马尼亚、保家利亚、土耳其)；(4) 俄罗斯西北部；(5) 南非；(6) 巴布亚新几内亚；(7) 阿拉斯加；(8) 美国东南部；(9) 美国西南部；(10) 南美。亚洲耐药菌株高发的四国均是我国的邻国，但从我们这次检测的结果来看，北京地区肺炎链球菌的总携带率为37.8%，对青霉素的敏感率为91.0%，不敏感率为9.0%，而韩国、日本、越南、泰国的不敏感率分别为79.7%、65.3%、60.8%和57.9%，差异有显著意义。对红霉素和复方磺胺甲基异唑不敏感率分别为76.8%和74.7%，而韩国分别为77.8%和62.6%，差异无显著意义。[9]我们的结论是，目前在我国β-内酰胺类的耐药还不常见，但红霉素和复方磺胺甲基异唑耐药却非常严重，红霉素耐药菌株最常见于近期服用过大环内酯类药物的儿童。
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美国疾病控制中心对1978～1994年从3 884例6岁以下儿童中分离出的肺炎链球菌进行血清分型，常见的7种血清型是14、6B、19F、18C、23F、4和9V，占所有菌株的78%。因此美国的Wyeth Lederle 公司以此为依据，研制出一种7价的肺炎链球菌结合疫苗。此疫苗可以防止86%的菌血症，83%的脑膜炎和65%的中耳炎[10]。在我们的研究发现，只有33.9%的菌株包含在这7价结合疫苗中。有人认为, 咽部携带的肺炎链球菌在一定程度上代表侵袭性肺炎链球菌[11]。由此我们认为，中国侵袭性肺炎链球菌的分布可能不同于欧美地区，是否在中国推广这种结合疫苗还须进一步调查研究。
耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径[12]：克隆传播和基因水平转移。前者是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。后者是把耐药基因转移到敏感菌株中。过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。我们从42例携带敏感菌株的标本中又发现6株被隐匿的耐药菌株，其中2株对青霉素不敏感，其血清型和PFGE结果与敏感菌株的不同。这一发现证实鼻咽部存在隐匿性耐药克隆株。随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。
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志谢 北京儿童医院门诊部、检验科细菌室、儿科研究所微生物室和江载芳教授
作者单位：Whitney CG(美国疾病控制中心)
Levine OS(美国疾病控制中心)
Dowell SF(美国疾病控制中心)
参考文献
1，Austrian R. The pneumococcus at the millennium:not down,not out.J Infect Dis,1999,179 Suppl:338-341.
2，Spika JS, Facklam RR, Plikaytis BD, et al. Antimicrobial resistance of streptococcus pneumoniae in the United States 1979-1987. J Infect Dis, 1991, 163: 1273-1278.
, 百拇医药
3，Martin C, Sibold C, Hakenbeck R. Relatedness of penicillin-binding protein 1a gene from different clones of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae isolated in South Africa and Spain. EMBO J, 1992, 11: 3831-3836.
4，Lefevre JC, Bertrand MA, Faucon G. Molecular analysis by pulsed-field gel electrophoresis of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae from Toulouse, France. Eur Clin Microbiol Infect Dis, 1995,14: 491-497.
, 百拇医药 5，Song IH, Yang JW, Peck KR, et al. Spread multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in South Korea. Clin Infect Dis, 1997, 25: 747-749.
6，Appelbaum PC, Gladkova C, Hryniewicz W, et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-A multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis, 1996, 23: 712-717.
7，Tomasz A, Corso A. Molecular epidemiologic characterization of penicillin-resistant invasive pediatric isolates recovered in six Latin-American countries: an overview. Microb Drug Dis, 1998, 4: 195-207.
, 百拇医药
8，Baquero F. Pneumococcal resistance to beta-lactam antibiotics: a global geographic overview. Microb Drug Resist, 1995, 1:115-120.
9，Song JH, Lee NY, Ichiyama S. Spread of drug-resistant Streptococcus pneumoniae in Asian countries: Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP) Study. Clin Infect Dis 1999,28:1206-1211.
10，Butler JC, Breiman RF, Lipman HB, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994: implication for development of a conjugate vaccine. J Infect Dis, 1995, 171:885-889.
11，Lloyd-Evans N, O′Dempsey TJD, Baldeh I, et al. Nasopharyngeal carriage of pneumococci in Gambian children and in their families. Pediatr Infect Dis J, 1996, 15: 866-871.
12，王辉, 陈民均. 耐青霉素肺炎链球菌的分子生物学特征. 国外医药抗生素分册, 1998, 19: 292.
(收稿日期：1999-07-30), http://www.100md.com