诊断超声辐照大鼠睾丸组织对Fas/FasL蛋白表达的影响
作者：杜联芳 张青萍 刘望彭
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉,同济医科大学附属同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学附属第一医院超声科)
关键词：超声学;大鼠;睾丸;抗原,CD95
中华超声影像学杂志000815
【摘要】 目的 探讨诊断超声对大鼠睾丸组织生精细胞Fas/FasL蛋白表达的影响。方法 32只SD雄性大鼠随机分为4组：I组(对照组)、II组(辐照10 min组)、III组(辐照20 min组)和IV组(辐照30 min组)。应用HP 8500彩色多普勒超声诊断仪对大鼠睾丸组织分别进行不同时间的持续辐照，24 h后处死动物,取睾丸组织应用免疫组织化学方法观察标本中Fas/FasL表达情况。结果 正常对照组睾丸组织同时表达Fas和FasL,其表达率分别为 59.96%和 67.42%。超声辐照后除10 min组外其他各组Fas和FasL的表达率均明显增高(P<0.001)。 Fas在20 min组总阳性率为 68.79%,在30 min组为 74.89%, FasL在20 min组为 73.81%,在30 min组为 81.72%。其表达率随辐照时间延长而增加(P<0.001),强阳性细胞增加更为明显。结论 诊断超声辐照大鼠睾丸组织20 min以上可引起Fas和FasL高表达，提示可导致细胞凋亡。
, 百拇医药
Study of Fas/FasL protein expression in rat testes after diagnostic ultrasound radiation
DU Lianfang，ZHANG Qingping，LIU Wangpeng
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To investigate the role of Fas/FasL protein expression in rat testes after diagnostic ultrasound radiation. Methods Thirty-two male Sprague-Danles rats were randomly divided into 4 groups of eight according to different radiating time: group I (bland radiation ),group II (10 min ),group III (20 min ),and group IV ( 30 min ). Rat testes were radiated by HP 8500 color Doppler ultrasonography with 7.5 MHz linear phased array transducer. Their testes were removed at 24 h after radiation. Expression of Fas/FasL protein was analyzed with immunohistochemistry.Results The positive rates of Fas/FasL protein were higher in experiment groups except group II than in control group, in which the rate of expression of Fas and FasL were 59.96%and 67.42% respectively.After radiation the positive rate was increased in groups III and IV, Fas expression reaching to 68.79% in group III and 74.89% in group IV,FasL expression reaching to 73.81% in group III and 81.72% in group IV respectively. There was no difference between control group and group I (P>0.05).Conclusions Radiation continuously over 20 minutes by diagnostic ultrasound may result in higher expression of Fas and FasL,and further germ cell apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Ultrasonics;Rats;Testis;Antigens,CD95
性腺的正常生长发育和功能是以大量的生殖细胞减少为特征的,在这种细胞减少中凋亡起关键作用,由细胞死亡程序控制,维持基本的体内平衡和自身稳定.在男性睾丸中75%以上的生精细胞要通过这种过程而死亡[1]。Fas 系统参与这一过程的调节并起关键作用[2,3]。诊断超声辐照大鼠睾丸组织后可引起凋亡，Fas/FasL是否参与，我们进行了如下实验。
材 料 与 方 法
一、实验动物分组及模型标本制备
健康SD雄性大鼠32只(山西医科大学实验动物中心提供)，出生后28～30 d，体重65～75 g，随机分为4组:I组为对照组,II组为辐照10 min组,III组为辐照20 min组,IV组为辐照30 min组。使用仪器为美国HP 8500彩色多普勒超声诊断仪,探头频率 7.5 MHz,超声输出功率为 6.8 mW,空间平均时间平均声强(Isata)为 3.4 mW/cm2，该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试。采用特制支架,将大鼠固定于平板上,探头置于会阴部,直接接触睾丸,固定持续辐照,根据分组不同分别进行空白对照和10 min、20 min、30 min辐照。辐照后24 h用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射,麻醉后取出睾丸,置于10%甲醛溶液中固定24 h,常规石腊包埋、切片(4μm),将切片捞于预先涂有粘片剂的载玻片上,置57℃烤箱烘干30 min。
, 百拇医药
二、Fas/FasL蛋白表达的检测
Fas/FasL多克隆抗体由美国Santa Cruz Biotechnology 公司生产,免疫组化染色的过氧化物酶标记选用链霉卵白素SP试剂盒(北京中山生物技术公司提供),操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)取代Fas/FasL抗体。光学显微镜下观察阳性细胞并计数,每张切片选取5个高倍视野(400×),计数500个细胞求得阳性百分率。
三、统计学分析
所有数据以
±s表示,各辐照组间及辐照组与对照组间阳性细胞比较采用t检验。
结 果
正常大鼠睾丸组织内生精细胞同时表达Fas/FasL。Fas阳性表达率(59.96±14.46)%,FasL阳性表达率(67.42±13.28)%。Fas强阳性细胞表现为细胞膜、细胞核及核膜呈棕褐色，近基膜小细胞多为阴性细胞，近管腔大细胞多为强阳性细胞，Fas弱阳性细胞表现为细胞膜、细胞核及核膜呈浅棕色或棕黄色，仅显示细胞轮廓者为阴性细胞。FasL强阳性细胞为细胞膜、胞浆和核被染成深棕色或棕褐色，弱阳性细胞呈浅棕色或棕黄色，仅显示细胞轮廓者为阴性细胞。
, 百拇医药
超声辐照后,各组生殖细胞Fas/FasL总阳性细胞除10 min组外均有所增加，且随辐照时间延长，阳性细胞增加更明显，以强阳性细胞增加最为显著，其结果及与对照组的比较见表1和表2。
表1 超声辐照组与对照组Fas蛋白表达比较(±s) 组别
例数
Fas强阳性率(%)
Fas弱阳性率(%)
Fas总阳性率(%)
I组
8
14.98± 2.83
, 百拇医药
42.90±12.66
59.96±14.46
II组
8
20.74±6.69※
38.13±10.92※
58.87±14.09
III组
8
35.49±12.08※ △
33.43±13.71※ △
, 百拇医药
68.79±14.48※ △
IV组
8
44.93±13.45※ △ ▲
29.96±8.56※ △ ▲
74.89±16.21※ △ ▲
注: ※与对照组相比较,P<0.001;△与10 min组比较,P<0.001;▲与20 min组比较,P<0.001表2 超声辐照组与对照组FasL蛋白表达比较(±s) 组别
例数
, 百拇医药
FasL强阳性率(%)
FasL弱阳性率(%)
FasL总阳性率(%)
I组
8
30.71±12.05
36.73±12.13
67.42±13.28
II组
8
30.54±11.39
35.86±12.06
, http://www.100md.com
66.40±12.35
III组
8
35.97±12.60※ △
38.02±11.84△
73.81±17.27※ △
IV组
8
48.76±14.41※ △ ▲
32.95±13.50△
, 百拇医药 81.72±17.03※ △ ▲
注:※与对照组比较,P<0.001;△与10 min组比较,P<0.001;▲与20 min组比较,P<0.001讨 论
Fas/FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白,Fas/FasL交联后,能传导细胞凋亡信号,引起Fas抗原表达细胞的凋亡。目前已发现多种组织细胞能分别表达Fas及FasL,有些甚至能同时表达Fas和FasL。本研究证实大鼠睾丸组织生精细胞能同时表达Fas和FasL,且其表达率相近,Fas阳性率 59.96%,FasL阳性率 67.42%。超声持续辐照 20 min以上,睾丸内Fas和FasL的阳性表达率均明显增加,分别为 74.89%和 81.72%,两者呈平行上升关系。有些组织虽Fas和FasL同时表达,但两者分布及表达不一致,即Fas强FasL弱或Fas弱FasL强,但两者阳性程度均随组织炎症坏死程度加重而增强。推测其意义可能为:同一细胞自身的Fas和FasL交联,通过顺式触发使细胞发生“自杀(suicide)”或分别表达Fas和FasL的相邻细胞相互交联,导致“同胞残杀”(fratricide)”[4]。有文献报道,给大鼠注射二甲基磺酸乙烷(ethane dimethanesulfonate,EDS)后,睾丸Leydig细胞Fas受体和Fas配体的蛋白表达水平均增加,其染色强度在凋亡早期增加[5],说明Fas和FasL表达与细胞凋亡增加呈平行关系[6]。
, 百拇医药
有关Fas/FasL在睾丸组织内定位问题,存在不同的观点,有学者认为Fas集中于生精细胞,FasL集中于Sertoli细胞[7,8]。本实验发现Fas和FasL均在生精细胞中表达,这可能与研究对象的种属、年龄、机体免疫状况和生存环境有关。例如光照时间的长短就可影响睾丸组织的凋亡和Fas的表达[9]。有实验将雄性小鼠的光照时间改变为8 h,黑暗时间为16 h,另一组是光照时间16 h,黑暗时间为8 h,如此持续2、4、6、8、10周,如期切除睾丸检测凋亡活性和Fas表达,结果发现除2周外,其他各组短光照时间组比长光照时间组每个曲细精管内凋亡细胞增加2～3倍。Western blot分析显示Fas蛋白在短光照组呈高调节状态,Fas染色首先集中在精母细胞和精子细胞,且血浆睾酮浓度下降,提示Fas在生殖细胞凋亡中的调节作用可能源于睾丸内睾酮浓度的下降,而睾酮可能通过抑制Fas而在生殖细胞的生存方面起作用[7]。
诊断超声持续辐照 20 min以上,可引起睾丸生殖细胞凋亡,Fas及FasL蛋白高表达,但其基因转录水平以及与超声生物效应关系如何有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Reyes Fuentes A, Chavarria Olarte ME. The participation of apoptosis in the development and function of the male gonad. Gynecol Obstet, 1999,67:330-340.
2，Wang RA, Nakne PK, Koji T. Autonomous cell death of mouse male germ cells during fetal and postnatal period. Reprod, 1998,58:1250-1256.
3，Mcclure RF, Heppelmann CJ,Paya CV. Constitutive Fas ligand gene transcription in Sertoli cells is regulated by Spl. Biol Chem, 1999, 274:7756-7762.
, 百拇医药
4，Galle PR, Hofmannn WJ, Walczak H, et al. Involvement of the CD95 (APO-/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Exp Med, 1995,182:1223-1227.
5，Taylor MF, de Boer-Brouwer M, Woolveridge I ,et al. Leydig cell apoptosis after the administration of ethane dimenthanesulfonate to the adult male rat is a Fas-mediated process. Endocrinology, 1999, 140: 3797-3804.
6，宋勇,毛宝龄.急性呼吸窘迫综合症患者肺组织Fas/FasL系统表达的意义.中国危重病急救医学,1999,11:96-98.
, 百拇医药
7，Nandi S, Baltimore, Maryland. Germ cell apoptosis in the testes of Sprague Dawley rats following testosterone withdrawal by ethane 1,2-dimenthanesulfonate administration : relationship to Fas? Biol Reprod, 1999,61: 70-75.
8，Lee J, Richburg JH, Youukin SC, et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis. Endocrinology, 1997,138: 2081-2088.
9，Young KA, Zirkin BR, Nelson RJ. Short photoperiods evoke testicular apoptosis in white-footed mice (Peromyscus leucopus). Endocrinology, 1999,140 :3133-3139.
(收稿日期：1999-11-29), http://www.100md.com
单位：杜联芳 张青萍(430030 武汉,同济医科大学附属同济医院超声科)；刘望彭(山西医科大学附属第一医院超声科)
关键词：超声学;大鼠;睾丸;抗原,CD95
中华超声影像学杂志000815
【摘要】 目的 探讨诊断超声对大鼠睾丸组织生精细胞Fas/FasL蛋白表达的影响。方法 32只SD雄性大鼠随机分为4组：I组(对照组)、II组(辐照10 min组)、III组(辐照20 min组)和IV组(辐照30 min组)。应用HP 8500彩色多普勒超声诊断仪对大鼠睾丸组织分别进行不同时间的持续辐照，24 h后处死动物,取睾丸组织应用免疫组织化学方法观察标本中Fas/FasL表达情况。结果 正常对照组睾丸组织同时表达Fas和FasL,其表达率分别为 59.96%和 67.42%。超声辐照后除10 min组外其他各组Fas和FasL的表达率均明显增高(P<0.001)。 Fas在20 min组总阳性率为 68.79%,在30 min组为 74.89%, FasL在20 min组为 73.81%,在30 min组为 81.72%。其表达率随辐照时间延长而增加(P<0.001),强阳性细胞增加更为明显。结论 诊断超声辐照大鼠睾丸组织20 min以上可引起Fas和FasL高表达，提示可导致细胞凋亡。
, 百拇医药
Study of Fas/FasL protein expression in rat testes after diagnostic ultrasound radiation
DU Lianfang，ZHANG Qingping，LIU Wangpeng
(Department of Ultrasound,Tongji Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430030,China)
【Abstract】 Objective To investigate the role of Fas/FasL protein expression in rat testes after diagnostic ultrasound radiation. Methods Thirty-two male Sprague-Danles rats were randomly divided into 4 groups of eight according to different radiating time: group I (bland radiation ),group II (10 min ),group III (20 min ),and group IV ( 30 min ). Rat testes were radiated by HP 8500 color Doppler ultrasonography with 7.5 MHz linear phased array transducer. Their testes were removed at 24 h after radiation. Expression of Fas/FasL protein was analyzed with immunohistochemistry.Results The positive rates of Fas/FasL protein were higher in experiment groups except group II than in control group, in which the rate of expression of Fas and FasL were 59.96%and 67.42% respectively.After radiation the positive rate was increased in groups III and IV, Fas expression reaching to 68.79% in group III and 74.89% in group IV,FasL expression reaching to 73.81% in group III and 81.72% in group IV respectively. There was no difference between control group and group I (P>0.05).Conclusions Radiation continuously over 20 minutes by diagnostic ultrasound may result in higher expression of Fas and FasL,and further germ cell apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Ultrasonics;Rats;Testis;Antigens,CD95
性腺的正常生长发育和功能是以大量的生殖细胞减少为特征的,在这种细胞减少中凋亡起关键作用,由细胞死亡程序控制,维持基本的体内平衡和自身稳定.在男性睾丸中75%以上的生精细胞要通过这种过程而死亡[1]。Fas 系统参与这一过程的调节并起关键作用[2,3]。诊断超声辐照大鼠睾丸组织后可引起凋亡，Fas/FasL是否参与，我们进行了如下实验。
材 料 与 方 法
一、实验动物分组及模型标本制备
健康SD雄性大鼠32只(山西医科大学实验动物中心提供)，出生后28～30 d，体重65～75 g，随机分为4组:I组为对照组,II组为辐照10 min组,III组为辐照20 min组,IV组为辐照30 min组。使用仪器为美国HP 8500彩色多普勒超声诊断仪,探头频率 7.5 MHz,超声输出功率为 6.8 mW,空间平均时间平均声强(Isata)为 3.4 mW/cm2，该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试。采用特制支架,将大鼠固定于平板上,探头置于会阴部,直接接触睾丸,固定持续辐照,根据分组不同分别进行空白对照和10 min、20 min、30 min辐照。辐照后24 h用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射,麻醉后取出睾丸,置于10%甲醛溶液中固定24 h,常规石腊包埋、切片(4μm),将切片捞于预先涂有粘片剂的载玻片上,置57℃烤箱烘干30 min。
, 百拇医药
二、Fas/FasL蛋白表达的检测
Fas/FasL多克隆抗体由美国Santa Cruz Biotechnology 公司生产,免疫组化染色的过氧化物酶标记选用链霉卵白素SP试剂盒(北京中山生物技术公司提供),操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)取代Fas/FasL抗体。光学显微镜下观察阳性细胞并计数,每张切片选取5个高倍视野(400×),计数500个细胞求得阳性百分率。
三、统计学分析
所有数据以
±s表示,各辐照组间及辐照组与对照组间阳性细胞比较采用t检验。结 果
正常大鼠睾丸组织内生精细胞同时表达Fas/FasL。Fas阳性表达率(59.96±14.46)%,FasL阳性表达率(67.42±13.28)%。Fas强阳性细胞表现为细胞膜、细胞核及核膜呈棕褐色，近基膜小细胞多为阴性细胞，近管腔大细胞多为强阳性细胞，Fas弱阳性细胞表现为细胞膜、细胞核及核膜呈浅棕色或棕黄色，仅显示细胞轮廓者为阴性细胞。FasL强阳性细胞为细胞膜、胞浆和核被染成深棕色或棕褐色，弱阳性细胞呈浅棕色或棕黄色，仅显示细胞轮廓者为阴性细胞。
, 百拇医药
超声辐照后,各组生殖细胞Fas/FasL总阳性细胞除10 min组外均有所增加，且随辐照时间延长，阳性细胞增加更明显，以强阳性细胞增加最为显著，其结果及与对照组的比较见表1和表2。
表1 超声辐照组与对照组Fas蛋白表达比较(
±s) 组别例数
Fas强阳性率(%)
Fas弱阳性率(%)
Fas总阳性率(%)
I组
8
14.98± 2.83
, 百拇医药
42.90±12.66
59.96±14.46
II组
8
20.74±6.69※
38.13±10.92※
58.87±14.09
III组
8
35.49±12.08※ △
33.43±13.71※ △
, 百拇医药
68.79±14.48※ △
IV组
8
44.93±13.45※ △ ▲
29.96±8.56※ △ ▲
74.89±16.21※ △ ▲
注: ※与对照组相比较,P<0.001;△与10 min组比较,P<0.001;▲与20 min组比较,P<0.001表2 超声辐照组与对照组FasL蛋白表达比较(
±s) 组别例数
, 百拇医药
FasL强阳性率(%)
FasL弱阳性率(%)
FasL总阳性率(%)
I组
8
30.71±12.05
36.73±12.13
67.42±13.28
II组
8
30.54±11.39
35.86±12.06
, http://www.100md.com
66.40±12.35
III组
8
35.97±12.60※ △
38.02±11.84△
73.81±17.27※ △
IV组
8
48.76±14.41※ △ ▲
32.95±13.50△
, 百拇医药 81.72±17.03※ △ ▲
注:※与对照组比较,P<0.001;△与10 min组比较,P<0.001;▲与20 min组比较,P<0.001讨 论
Fas/FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白,Fas/FasL交联后,能传导细胞凋亡信号,引起Fas抗原表达细胞的凋亡。目前已发现多种组织细胞能分别表达Fas及FasL,有些甚至能同时表达Fas和FasL。本研究证实大鼠睾丸组织生精细胞能同时表达Fas和FasL,且其表达率相近,Fas阳性率 59.96%,FasL阳性率 67.42%。超声持续辐照 20 min以上,睾丸内Fas和FasL的阳性表达率均明显增加,分别为 74.89%和 81.72%,两者呈平行上升关系。有些组织虽Fas和FasL同时表达,但两者分布及表达不一致,即Fas强FasL弱或Fas弱FasL强,但两者阳性程度均随组织炎症坏死程度加重而增强。推测其意义可能为:同一细胞自身的Fas和FasL交联,通过顺式触发使细胞发生“自杀(suicide)”或分别表达Fas和FasL的相邻细胞相互交联,导致“同胞残杀”(fratricide)”[4]。有文献报道,给大鼠注射二甲基磺酸乙烷(ethane dimethanesulfonate,EDS)后,睾丸Leydig细胞Fas受体和Fas配体的蛋白表达水平均增加,其染色强度在凋亡早期增加[5],说明Fas和FasL表达与细胞凋亡增加呈平行关系[6]。
, 百拇医药
有关Fas/FasL在睾丸组织内定位问题,存在不同的观点,有学者认为Fas集中于生精细胞,FasL集中于Sertoli细胞[7,8]。本实验发现Fas和FasL均在生精细胞中表达,这可能与研究对象的种属、年龄、机体免疫状况和生存环境有关。例如光照时间的长短就可影响睾丸组织的凋亡和Fas的表达[9]。有实验将雄性小鼠的光照时间改变为8 h,黑暗时间为16 h,另一组是光照时间16 h,黑暗时间为8 h,如此持续2、4、6、8、10周,如期切除睾丸检测凋亡活性和Fas表达,结果发现除2周外,其他各组短光照时间组比长光照时间组每个曲细精管内凋亡细胞增加2～3倍。Western blot分析显示Fas蛋白在短光照组呈高调节状态,Fas染色首先集中在精母细胞和精子细胞,且血浆睾酮浓度下降,提示Fas在生殖细胞凋亡中的调节作用可能源于睾丸内睾酮浓度的下降,而睾酮可能通过抑制Fas而在生殖细胞的生存方面起作用[7]。
诊断超声持续辐照 20 min以上,可引起睾丸生殖细胞凋亡,Fas及FasL蛋白高表达,但其基因转录水平以及与超声生物效应关系如何有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Reyes Fuentes A, Chavarria Olarte ME. The participation of apoptosis in the development and function of the male gonad. Gynecol Obstet, 1999,67:330-340.
2，Wang RA, Nakne PK, Koji T. Autonomous cell death of mouse male germ cells during fetal and postnatal period. Reprod, 1998,58:1250-1256.
3，Mcclure RF, Heppelmann CJ,Paya CV. Constitutive Fas ligand gene transcription in Sertoli cells is regulated by Spl. Biol Chem, 1999, 274:7756-7762.
, 百拇医药
4，Galle PR, Hofmannn WJ, Walczak H, et al. Involvement of the CD95 (APO-/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Exp Med, 1995,182:1223-1227.
5，Taylor MF, de Boer-Brouwer M, Woolveridge I ,et al. Leydig cell apoptosis after the administration of ethane dimenthanesulfonate to the adult male rat is a Fas-mediated process. Endocrinology, 1999, 140: 3797-3804.
6，宋勇,毛宝龄.急性呼吸窘迫综合症患者肺组织Fas/FasL系统表达的意义.中国危重病急救医学,1999,11:96-98.
, 百拇医药
7，Nandi S, Baltimore, Maryland. Germ cell apoptosis in the testes of Sprague Dawley rats following testosterone withdrawal by ethane 1,2-dimenthanesulfonate administration : relationship to Fas? Biol Reprod, 1999,61: 70-75.
8，Lee J, Richburg JH, Youukin SC, et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis. Endocrinology, 1997,138: 2081-2088.
9，Young KA, Zirkin BR, Nelson RJ. Short photoperiods evoke testicular apoptosis in white-footed mice (Peromyscus leucopus). Endocrinology, 1999,140 :3133-3139.
(收稿日期：1999-11-29), http://www.100md.com