糖尿病小鼠血清糖基化终产物水平增高
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中国糖尿病杂志 2000年第5期第8卷 短篇报告
东南大学附属中大医院内分泌科邮政编码 210009 孙子林 刘乃丰 孙桂菊 童嘉毅 王伯荣 刘必成
关键词：
摘要：中国糖尿病杂志000525 DCCT[1]和UKPDS[2]研究均证明长期持续高血糖与糖尿病慢性血管病变的发生密切相关。高血糖导致血管病变发生发展的机制尚不完全清楚，蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可能发挥重要作用[3]。为了从整体水平研究AGEs与糖尿病慢性并发症之间的关系，我们运用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定糖尿病小鼠血清AGEs水平，并分析其与肾功能、尿蛋白及尿微量白蛋白排泄之间的关系，现报告如下。
材料和方法
一、材料
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1.试剂：牛血清白蛋白(BSA)为BM产品，人血清白蛋白(HSA)、明胶、四氧嘧啶、邻苯二胺(OPD)为Sigma产品，生物素化羊抗兔IgG、链霉亲和素-HRP系Vector产品，其它试剂均为国产分析纯。
2.仪器及器材：Model 550酶标仪为美国Bio-Rad公司产品，SN-682B型γ计数仪为上海核福光电仪器有限公司产品。
3.动物：雌性新西兰白兔两只，兔龄4～5个月，体重2～2.5kg，购自江苏省农科院种殖场；雄性昆明种小鼠，18～22g，由东南大学医学院动物实验中心提供。
二、方法
1.糖尿病动物模型的制备：小白鼠40只随机分为两组，实验组按400mg/kg腹腔一次性注入四氧嘧啶，分别于30天、60天各处死一半，处死前24小时收集尿液计算尿量并测定24小时尿蛋白定量(24h UPro,Bradford法)、尿白蛋白排泄量(UAE，放免法)，收集血清测血糖(葡萄糖氧化酶法)、尿素氮、肌酐(Cr)及AGEs。
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2.AGEs的制备：50g/L HSA、BSA分别与0.5mol/L葡萄糖共溶于pH7.4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，过滤灭菌后置37℃避光孵育90天，用PBS充分透析以去除未结合物。不加葡萄糖的HSA、BSA同上操作用做对照。样品调定至1mg/ml，按常规方法测定AGE荧光值及荧光光谱扫描。Sephadex-G200纯化AGE-BSA。
3.抗AGE抗体的制备：参照Hourichi方法[4]。用纯化的AGE-BSA与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化后，背部皮下多点注射免疫新西兰白兔(1.0mg/次)，此后1次/周，同样剂量加强5次，最后一次以AGE-BSA 2.0mg与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，再隔10天后无菌条件下颈动脉放血收集血清，QAE-Sephadex A-50纯化获取IgG。
4.运用竞争性ELISA检测血清AGEs：100μl/孔AGE-HSA(5μg/ml)包板，室温孵育过夜。PBS-T液漂洗6次，0.5%明胶封闭1小时。再次漂洗后，加入抗AGE IgG(1∶2000稀释)和血清(1∶4稀释，一式三份)或标准品(纯化AGE-BSA，浓度分别为0.625、2.5、10、50、100mg/L)各50μl/孔，置37℃孵育1小时。同上漂洗后，加入100μl/孔生物素化羊抗兔IgG(1∶4000稀释)，37℃孵育1小时。漂洗，加入100μl/孔链霉亲和素-HRP(1∶4000稀释)，37℃孵育半小时。漂洗，加入100μl/孔OPD液，37℃孵育20分钟，加入100μl/孔2mmol/L H2SO4终止反应。空白孔调零，酶标仪测490nm吸光度。根据事先输入的标准品浓度及其在微孔板上的位置，酶标仪自动求出样本的AGEs浓度值。浓度以U/ml表示，1U AGEs相当于1μg/ml AGE-BSA。
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5.数据处理：所有数据均以
±s表示，采用非配对资料两样本均数t检验进行差异显著性检验，相关采用直线相关分析。
结 果
1.一般资料[5]：实验组血糖为对照组3倍左右，体重下降(约为对照组的2/3)，早期尿量增多，3周后逐步减少，24h UPro升高达对照组6倍，尿素氮、肌酐为对照组2倍，UAE为对照组3～4倍。模型组60天时上述指标增高较30天时更为明显。
2.AGE荧光检测：AGE-BSA和AGE-HSA荧光值分别为5.31±0.21和5.44±0.19；而BSA和HSA分别为0.174±0.011和0.202±0.015。荧光光谱扫描显示AGE-BSA和AGE-HSA激发高峰位于360nm，发射高峰位于446nm。
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3.ELISA测定AGEs：糖尿病小鼠血清AGEs明显高于对照组，约为对照组的6～8倍(30天组：4.28±1.32 vs 0.51±0.35U/ml;60天组：6.74±2.28 vs 1.16±0.60U/ml)。
4.血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE相关分析：对血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE进行相关分析，显示血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE均呈显著正相关(r值分别为0.57、0.60、0.56，P<0.005)。
讨 论
运用ELISA法测定AGEs的关键在于获得高效特异的抗AGEs抗体。本研究参照Hourichi的方法[4]，将BSA和HSA与葡萄糖在体外孵育制备AGE-BSA和AGE-HSA用做免疫原或包被抗原，荧光光谱扫描及AGE荧光值检测证实BSA和HSA均转变为相应的AGEs。以纯化的AGE-BSA免疫新西兰白兔成功地获得了抗AGEs抗体，抗体效价达1∶2000，特异性鉴定显示其与不同源性的AGEs均有交叉反应，而与非糖基化蛋白质和Amadori产物无免疫反应发生，证明该抗体是特异的抗AGEs抗体，而且体外制备和体内形成的AGEs均拥有共同的抗原决定簇[4]。因此运用该抗体建立的竞争性ELISA系统测定的AGEs代表血清总的AGEs水平。我们的结果显示糖尿病小鼠血清AGEs显著高于对照组，约为对照组的6～8倍；而且随糖尿病病程延长，水平增高。
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本研究还对AGEs与Cr、24hUPro、UAE进行直线相关分析，结果显示血清AGEs与肾功能(血Cr)、24hUPro、UAE之间均呈显著正相关，进一步证实AGEs可能与糖尿病肾病的发生发展有关[3，6]。
参考文献
1，The diabetes control and complication trial research group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med,1993,329:977.
2，UK prospective diabetes study (UKPDS) group.Effect of intensive blood-glucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes (UKPDS 34).Lancet,1998,352:854.
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3，Vlassara H.Recent progress in advanced glycation end products and diabetic complications.Diabetes,1997,46(suppl):S19.
4，Hourichi S,Araki N,Morino Y,et al.Immunochemical approach to characterize advanced glycation end products of the maillard reaction.J Biol Chem,1991,266:7329.
5，孙子林，刘乃丰，刘必成，等.小分子AGE-肽在小鼠糖尿病肾病发生中的作用.南京铁道医学院学报，1999，18：145.
6，黄宇峰，林善锬.糖尿病肾小球内非酶糖化与苯那普利的抑制作用及机制.中华肾脏病杂志，1999，15：241.
(收稿：1999-02-09 修回：2000-05-15), http://www.100md.com
关键词：
摘要：中国糖尿病杂志000525 DCCT[1]和UKPDS[2]研究均证明长期持续高血糖与糖尿病慢性血管病变的发生密切相关。高血糖导致血管病变发生发展的机制尚不完全清楚，蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可能发挥重要作用[3]。为了从整体水平研究AGEs与糖尿病慢性并发症之间的关系，我们运用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定糖尿病小鼠血清AGEs水平，并分析其与肾功能、尿蛋白及尿微量白蛋白排泄之间的关系，现报告如下。
材料和方法
一、材料
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1.试剂：牛血清白蛋白(BSA)为BM产品，人血清白蛋白(HSA)、明胶、四氧嘧啶、邻苯二胺(OPD)为Sigma产品，生物素化羊抗兔IgG、链霉亲和素-HRP系Vector产品，其它试剂均为国产分析纯。
2.仪器及器材：Model 550酶标仪为美国Bio-Rad公司产品，SN-682B型γ计数仪为上海核福光电仪器有限公司产品。
3.动物：雌性新西兰白兔两只，兔龄4～5个月，体重2～2.5kg，购自江苏省农科院种殖场；雄性昆明种小鼠，18～22g，由东南大学医学院动物实验中心提供。
二、方法
1.糖尿病动物模型的制备：小白鼠40只随机分为两组，实验组按400mg/kg腹腔一次性注入四氧嘧啶，分别于30天、60天各处死一半，处死前24小时收集尿液计算尿量并测定24小时尿蛋白定量(24h UPro,Bradford法)、尿白蛋白排泄量(UAE，放免法)，收集血清测血糖(葡萄糖氧化酶法)、尿素氮、肌酐(Cr)及AGEs。
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2.AGEs的制备：50g/L HSA、BSA分别与0.5mol/L葡萄糖共溶于pH7.4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，过滤灭菌后置37℃避光孵育90天，用PBS充分透析以去除未结合物。不加葡萄糖的HSA、BSA同上操作用做对照。样品调定至1mg/ml，按常规方法测定AGE荧光值及荧光光谱扫描。Sephadex-G200纯化AGE-BSA。
3.抗AGE抗体的制备：参照Hourichi方法[4]。用纯化的AGE-BSA与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化后，背部皮下多点注射免疫新西兰白兔(1.0mg/次)，此后1次/周，同样剂量加强5次，最后一次以AGE-BSA 2.0mg与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，再隔10天后无菌条件下颈动脉放血收集血清，QAE-Sephadex A-50纯化获取IgG。
4.运用竞争性ELISA检测血清AGEs：100μl/孔AGE-HSA(5μg/ml)包板，室温孵育过夜。PBS-T液漂洗6次，0.5%明胶封闭1小时。再次漂洗后，加入抗AGE IgG(1∶2000稀释)和血清(1∶4稀释，一式三份)或标准品(纯化AGE-BSA，浓度分别为0.625、2.5、10、50、100mg/L)各50μl/孔，置37℃孵育1小时。同上漂洗后，加入100μl/孔生物素化羊抗兔IgG(1∶4000稀释)，37℃孵育1小时。漂洗，加入100μl/孔链霉亲和素-HRP(1∶4000稀释)，37℃孵育半小时。漂洗，加入100μl/孔OPD液，37℃孵育20分钟，加入100μl/孔2mmol/L H2SO4终止反应。空白孔调零，酶标仪测490nm吸光度。根据事先输入的标准品浓度及其在微孔板上的位置，酶标仪自动求出样本的AGEs浓度值。浓度以U/ml表示，1U AGEs相当于1μg/ml AGE-BSA。
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5.数据处理：所有数据均以
±s表示，采用非配对资料两样本均数t检验进行差异显著性检验，相关采用直线相关分析。结 果
1.一般资料[5]：实验组血糖为对照组3倍左右，体重下降(约为对照组的2/3)，早期尿量增多，3周后逐步减少，24h UPro升高达对照组6倍，尿素氮、肌酐为对照组2倍，UAE为对照组3～4倍。模型组60天时上述指标增高较30天时更为明显。
2.AGE荧光检测：AGE-BSA和AGE-HSA荧光值分别为5.31±0.21和5.44±0.19；而BSA和HSA分别为0.174±0.011和0.202±0.015。荧光光谱扫描显示AGE-BSA和AGE-HSA激发高峰位于360nm，发射高峰位于446nm。
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3.ELISA测定AGEs：糖尿病小鼠血清AGEs明显高于对照组，约为对照组的6～8倍(30天组：4.28±1.32 vs 0.51±0.35U/ml;60天组：6.74±2.28 vs 1.16±0.60U/ml)。
4.血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE相关分析：对血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE进行相关分析，显示血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE均呈显著正相关(r值分别为0.57、0.60、0.56，P<0.005)。
讨 论
运用ELISA法测定AGEs的关键在于获得高效特异的抗AGEs抗体。本研究参照Hourichi的方法[4]，将BSA和HSA与葡萄糖在体外孵育制备AGE-BSA和AGE-HSA用做免疫原或包被抗原，荧光光谱扫描及AGE荧光值检测证实BSA和HSA均转变为相应的AGEs。以纯化的AGE-BSA免疫新西兰白兔成功地获得了抗AGEs抗体，抗体效价达1∶2000，特异性鉴定显示其与不同源性的AGEs均有交叉反应，而与非糖基化蛋白质和Amadori产物无免疫反应发生，证明该抗体是特异的抗AGEs抗体，而且体外制备和体内形成的AGEs均拥有共同的抗原决定簇[4]。因此运用该抗体建立的竞争性ELISA系统测定的AGEs代表血清总的AGEs水平。我们的结果显示糖尿病小鼠血清AGEs显著高于对照组，约为对照组的6～8倍；而且随糖尿病病程延长，水平增高。
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本研究还对AGEs与Cr、24hUPro、UAE进行直线相关分析，结果显示血清AGEs与肾功能(血Cr)、24hUPro、UAE之间均呈显著正相关，进一步证实AGEs可能与糖尿病肾病的发生发展有关[3，6]。
参考文献
1，The diabetes control and complication trial research group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med,1993,329:977.
2，UK prospective diabetes study (UKPDS) group.Effect of intensive blood-glucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes (UKPDS 34).Lancet,1998,352:854.
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3，Vlassara H.Recent progress in advanced glycation end products and diabetic complications.Diabetes,1997,46(suppl):S19.
4，Hourichi S,Araki N,Morino Y,et al.Immunochemical approach to characterize advanced glycation end products of the maillard reaction.J Biol Chem,1991,266:7329.
5，孙子林，刘乃丰，刘必成，等.小分子AGE-肽在小鼠糖尿病肾病发生中的作用.南京铁道医学院学报，1999，18：145.
6，黄宇峰，林善锬.糖尿病肾小球内非酶糖化与苯那普利的抑制作用及机制.中华肾脏病杂志，1999，15：241.
(收稿：1999-02-09 修回：2000-05-15), http://www.100md.com