肥胖患者大网膜脂肪组织中TNF-α转换酶基因的表达及其意义
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中国糖尿病杂志 2000年第5期第8卷 短篇报告
福建省立医院内分泌研究室 邮政编码 350001 陈刚 林丽香 庄维特 姚瑾 林建立
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000516 TNF-α转换酶(TNF-α converting enzyme,TACE)基因是1997年刚克隆的基因，其产物能使TNF-α前体转变为TNF-α。现将我们对肥胖患者大网膜脂肪组织中TNF-α转换酶基因表达的初步研究报告如下。
材料与方法
1.研究对象：①实验组：大网膜脂肪组织取自胆石症患者腹部手术，患者无急性全身及局部炎症，无肿瘤，无糖尿病，无引起胰岛素抵抗的其它疾患，如柯兴综合征、多囊卵巢综合征等，以肥胖(BMI≥30kg/m2)、空腹血浆胰岛素增高(>20mIU/L)为标准入选，共6例，标本来自福建省立医院。②对照组：脂肪组织取自胃、十二指肠患者腹部手术。患者体重、血胰岛素均在正常范围，无急性全身及局部炎症，无肿瘤，标本共6例。
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2.RNA提取：按照Trizol RNA提取试剂盒步骤。
3.cDNA的合成：以Oligo-(dT)15为引物，AMV逆转录酶(Promaga公司)将RNA逆转录成cDNA。
4.半定量RT-PCR扩增TACE、GAPDH cDNA片断：①引物设计：TACE引物序列为(上游引物5'-CGGGATCCATGTTAAAAGTGGATAATGAAG-3',下游引物5'-GCGCGAAGCTTACTCTTCTCCTTCATCCAC-3'),内标GAPDH引物序列为(上游引物5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3',下游引物5'-GGTEATGAGTCCTTCCACGAT-3');②PCR反应条件：95℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟；③PCR结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果拍照后用图像分析灰度扫描，进行半定量分析。以TACE与GAPDH的PCR产物条带灰度值之比(TACE/GAPDH)作为反映TACE RNA水平的相对指标。
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附表 6例患者的临床资料 患者
BMI
(kg/m2)
血压
(mmHg)
空腹血糖
(mmol/L)
空腹胰岛素
(mIU/L)
血脂(mmol/L)
TC
TG
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HDL
LDL
例1
31.05
110/85
4.7
51
2.92
2.19
0.83
1.09
例2
31.75
, 百拇医药
120/80
5.3
63
3.98
0.88
1.29
2.29
例3
30.11
155/80
3.8
41
3.21
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1.56
0.85
1.82
例4
32.10
135/75
3.6
38
3.45
2.03
1.11
2.08
例5
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30.01
110/80
3.9
49
3.40
1.32
1.12
1.75
例6
37.09
110/80
4.8
78
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3.83
1.98
0.98
1.94
注：胰岛素测定正常值为4～20mIU/L 5. 统计方法：t检验。
结 果
6例患者的临床资料见附表。
肥胖合并胰岛素抵抗患者TACE/GAPDH值显著高于正常对照组(t＝14.3, P<0.01), 说明肥胖合并胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE RNA水平显著高于正常对照组。
讨 论
TACE是一种与细胞膜结合的非整合素(disintergrin)金属蛋白酶[1]，它是adamalysins家族的新成员[2]，在小鼠中，TACE定位于第12号染色体[3]，在人类，它位于第2号染色体[4]。它的主要功能是使TNF-α前体分子转变为成熟的TNF-α，从而发挥各种生理功能。
, 百拇医药
肥胖合并胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE RNA水平显著高于正常人(P<0.01)。由于TACE是催化TNF-α前体转变为有生物活性TNF-α的关键酶，因此胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE表达增多，会引起患者体内有活性的TNF-α增多。由于TNF-α可抑制脂肪细胞上胰岛素受体和胰岛素受体底物-1的酪氨酸磷酸化，并能下调脂肪细胞上胰岛素敏感的4型葡萄糖运载体[5]，因此TNF-α增多会产生胰岛素抵抗。由于胰岛素是促脂肪生成激素，所以体内胰岛素水平升高进一步加重肥胖，造成恶性循环；TNF-α增多通过旁分泌和自分泌作用，抑制脂肪合成，促进脂肪分解，抑制前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，促进脂肪细胞凋亡，限制脂肪细胞进一步堆积，还可能通过神经-内分泌-免疫网络调节体脂分布，这可能是机体的一种保护反应，具有积极意义；由此可见TNF-α是肥胖和胰岛素抵抗的共同发病基础，TACE通过TNF-α在肥胖和胰岛素抵抗的发病机制中起重要作用。
此外在动物实验和人单核细胞体外培养实验中发现金属蛋白酶组织抑制物-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3)，能抑制组织TACE的活性[6，7]，降低体内TNF-α的水平。因此TIMP-3能减轻胰岛素抵抗，为胰岛素抵抗的治疗提供了一个新的途径。由于胰岛素抵抗是2型糖尿病、肥胖、高脂血症、高血压、冠心病等疾病的共同发病基础，所以TIMP-3作为一种新药具有广阔的应用前景。
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参 考 文 献
1，Moss ML,Jin SL,Milla ME,et al. Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumour-necrosis factor-alpha.Nature,1997,385:733.
2，Black RA,Rauch CT,Kozlosky CJ,et al. A metalloproteinase disintegrinthat releases tumour-necrosis factor-alpha from cell. Nature,1997,385:729.
3，Yamazaki K,Mizui Y,Sagane K,et al. Genetic mapping of mouse tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE) to chromosome 12.Genomics,1998,49:336.
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4，Hirohata S,Seldin MF,Apte SS. Chromosomal assignment of two ADAM genes,TACE (ADAM17) and MLTNB (ADAM19) ,to human chromosomes 2 and 5,respectively, and of MLTNB to mouse chromosome 11. Genomics,1998,54:178.
5，Skolnik EY,Marcusohn J.Inhibition of insulin receptor signaling by TNF:potential role in obesity and non-insulin-dependent diabetes mellitus.Cytokine Growth Factor Rev,1996,7:161.
6，Amour A,Slocombe PM,Webster A,et al. TNF-alpha converting enzyme (TACE) is inhibited by TIMP-3.FEBS Lett,1998,435:39.
7，Borland G,Murphy G,Ager A.Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 inhibits shedding of L-selectin from leukocytes.J Biol Chem,1999,274:2810.
(收稿：1999-11-15 修回：2000-06-21)
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关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000516 TNF-α转换酶(TNF-α converting enzyme,TACE)基因是1997年刚克隆的基因，其产物能使TNF-α前体转变为TNF-α。现将我们对肥胖患者大网膜脂肪组织中TNF-α转换酶基因表达的初步研究报告如下。
材料与方法
1.研究对象：①实验组：大网膜脂肪组织取自胆石症患者腹部手术，患者无急性全身及局部炎症，无肿瘤，无糖尿病，无引起胰岛素抵抗的其它疾患，如柯兴综合征、多囊卵巢综合征等，以肥胖(BMI≥30kg/m2)、空腹血浆胰岛素增高(>20mIU/L)为标准入选，共6例，标本来自福建省立医院。②对照组：脂肪组织取自胃、十二指肠患者腹部手术。患者体重、血胰岛素均在正常范围，无急性全身及局部炎症，无肿瘤，标本共6例。
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2.RNA提取：按照Trizol RNA提取试剂盒步骤。
3.cDNA的合成：以Oligo-(dT)15为引物，AMV逆转录酶(Promaga公司)将RNA逆转录成cDNA。
4.半定量RT-PCR扩增TACE、GAPDH cDNA片断：①引物设计：TACE引物序列为(上游引物5'-CGGGATCCATGTTAAAAGTGGATAATGAAG-3',下游引物5'-GCGCGAAGCTTACTCTTCTCCTTCATCCAC-3'),内标GAPDH引物序列为(上游引物5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3',下游引物5'-GGTEATGAGTCCTTCCACGAT-3');②PCR反应条件：95℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟；③PCR结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果拍照后用图像分析灰度扫描，进行半定量分析。以TACE与GAPDH的PCR产物条带灰度值之比(TACE/GAPDH)作为反映TACE RNA水平的相对指标。
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附表 6例患者的临床资料 患者
BMI
(kg/m2)
血压
(mmHg)
空腹血糖
(mmol/L)
空腹胰岛素
(mIU/L)
血脂(mmol/L)
TC
TG
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HDL
LDL
例1
31.05
110/85
4.7
51
2.92
2.19
0.83
1.09
例2
31.75
, 百拇医药
120/80
5.3
63
3.98
0.88
1.29
2.29
例3
30.11
155/80
3.8
41
3.21
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1.56
0.85
1.82
例4
32.10
135/75
3.6
38
3.45
2.03
1.11
2.08
例5
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30.01
110/80
3.9
49
3.40
1.32
1.12
1.75
例6
37.09
110/80
4.8
78
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3.83
1.98
0.98
1.94
注：胰岛素测定正常值为4～20mIU/L 5. 统计方法：t检验。
结 果
6例患者的临床资料见附表。
肥胖合并胰岛素抵抗患者TACE/GAPDH值显著高于正常对照组(t＝14.3, P<0.01), 说明肥胖合并胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE RNA水平显著高于正常对照组。
讨 论
TACE是一种与细胞膜结合的非整合素(disintergrin)金属蛋白酶[1]，它是adamalysins家族的新成员[2]，在小鼠中，TACE定位于第12号染色体[3]，在人类，它位于第2号染色体[4]。它的主要功能是使TNF-α前体分子转变为成熟的TNF-α，从而发挥各种生理功能。
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肥胖合并胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE RNA水平显著高于正常人(P<0.01)。由于TACE是催化TNF-α前体转变为有生物活性TNF-α的关键酶，因此胰岛素抵抗患者大网膜脂肪组织中TACE表达增多，会引起患者体内有活性的TNF-α增多。由于TNF-α可抑制脂肪细胞上胰岛素受体和胰岛素受体底物-1的酪氨酸磷酸化，并能下调脂肪细胞上胰岛素敏感的4型葡萄糖运载体[5]，因此TNF-α增多会产生胰岛素抵抗。由于胰岛素是促脂肪生成激素，所以体内胰岛素水平升高进一步加重肥胖，造成恶性循环；TNF-α增多通过旁分泌和自分泌作用，抑制脂肪合成，促进脂肪分解，抑制前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，促进脂肪细胞凋亡，限制脂肪细胞进一步堆积，还可能通过神经-内分泌-免疫网络调节体脂分布，这可能是机体的一种保护反应，具有积极意义；由此可见TNF-α是肥胖和胰岛素抵抗的共同发病基础，TACE通过TNF-α在肥胖和胰岛素抵抗的发病机制中起重要作用。
此外在动物实验和人单核细胞体外培养实验中发现金属蛋白酶组织抑制物-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3)，能抑制组织TACE的活性[6，7]，降低体内TNF-α的水平。因此TIMP-3能减轻胰岛素抵抗，为胰岛素抵抗的治疗提供了一个新的途径。由于胰岛素抵抗是2型糖尿病、肥胖、高脂血症、高血压、冠心病等疾病的共同发病基础，所以TIMP-3作为一种新药具有广阔的应用前景。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Moss ML,Jin SL,Milla ME,et al. Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumour-necrosis factor-alpha.Nature,1997,385:733.
2，Black RA,Rauch CT,Kozlosky CJ,et al. A metalloproteinase disintegrinthat releases tumour-necrosis factor-alpha from cell. Nature,1997,385:729.
3，Yamazaki K,Mizui Y,Sagane K,et al. Genetic mapping of mouse tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE) to chromosome 12.Genomics,1998,49:336.
, http://www.100md.com
4，Hirohata S,Seldin MF,Apte SS. Chromosomal assignment of two ADAM genes,TACE (ADAM17) and MLTNB (ADAM19) ,to human chromosomes 2 and 5,respectively, and of MLTNB to mouse chromosome 11. Genomics,1998,54:178.
5，Skolnik EY,Marcusohn J.Inhibition of insulin receptor signaling by TNF:potential role in obesity and non-insulin-dependent diabetes mellitus.Cytokine Growth Factor Rev,1996,7:161.
6，Amour A,Slocombe PM,Webster A,et al. TNF-alpha converting enzyme (TACE) is inhibited by TIMP-3.FEBS Lett,1998,435:39.
7，Borland G,Murphy G,Ager A.Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 inhibits shedding of L-selectin from leukocytes.J Biol Chem,1999,274:2810.
(收稿：1999-11-15 修回：2000-06-21)
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