活性氧的氧化还原机制在介入性损伤后血管平滑肌细胞增殖中的作用
作者：盛林 刘亚军 潘其兴
单位：盛林(山东医科大学附属医院心内科，济南 250012)；刘亚军(山东省平度市人民医院心内科，平度 266700)；潘其兴(山东医科大学附属医院心内科，济南 250012)
关键词：活性氧；肌，平滑；增殖；氧化还原
中国动脉硬化杂志000125[摘 要] 介入性动脉损伤后，局部血管平滑肌细胞和成纤维细胞均可通过NADH/NADPH氧化酶途径产生活性氧。而活性氧作为第二信使可改变细胞内氧化还原平衡状态，直接或间接地激活细胞内多种信号蛋白激酶和转录因子，促进血管平滑肌细胞增殖，最终导致血管再狭窄。
[中图分类号] R329.2+8 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0083-05
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再狭窄(restenosis，RS)是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous trans luminal coronary angioplasty , PTCA)远期疗效的主要障碍。近年研究报道抗氧化剂可显著降低PTCA后RS的发生[1,2]，提示氧化还原作用可能是影响再狭窄发生、发展的重要机制之一。本文就PTCA 后活性氧产生的途径和活性氧(O2-、H2O2、.OH、O2·)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖的影响作一综述，以探讨氧化还原机制在血管损伤后VSMC增殖中的作用和应用抗氧化剂防治血管再狭窄的潜在治疗价值。
1 介入性动脉损伤后活性氧产生增多
文献[3]报道PTCA后极短时间内局部血管壁细胞即可产生超氧阴离子(O2-)及脂质过氧化产物，冠状静脉内脂质过氧化产物丙二醛含量也较PTCA前显著增高。Grech等[4]使用自旋捕捉和电子顺磁共振分光技术，首次直接定量检测急性心肌梗死患者冠状静脉氧自由基水平，证实PTCA后 O2- 生成增加，并观察到PTCA后早期O2-增加有两个高峰期，即PTCA后1.5～3.5 h和18～24 h达高峰(已排除再闭塞)。第一次高峰与缺血再灌注后O2-爆发式产生有关，而第二次高峰可能与损伤血管局部的中性白细胞浸润、激活并释放O2-有关[3～5]。上述研究虽然获得了PTCA后早期O2-及丙二醛生成增多的直接证据，但无法排除因机械性损伤导致细胞破坏和动脉硬化斑块破裂等因素参与释放O2-和脂质过氧化物的可能性。由于受研究技术和方法的限制，尚无法在活体上证实产生O2-的真正的细胞来源。Nunes等[6]对猪冠状动脉 PTCA 14天后O2- 的生成情况以及应用抗氧化剂对O2-的影响进行了研究，结果表明，损伤血管段与未损伤血管段、同一血管的损伤段与未损伤段相比，O2-产生前者是后者的2～3倍。而经抗氧化剂维生素C、E或两者联合处理后，O2-产生明显减少，且与正常对照组无明显差异。Nunes和Kara还对猪PTCA后血管损伤段O2-的细胞来源进行了深入研究，认为VSMC、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和中性白细胞都参与了O2-的生成过程[6,7]。冠状动脉损伤后3天损伤处有中性白细胞，7天后消失，14天时仅有少量单核/巨噬细胞，据此推断，中性白细胞、单核/巨噬细胞不可能是冠状动脉损伤晚期(14天)O2-生成的主要来源。剥离损伤段血管内皮细胞后再测局部O2-，发现O2-仅减少了10%，因此，内皮细胞也不可能是O2-的主要来源。Nunes等据此认为，PTCA后O2-可能主要来自血管中膜和新生内膜的平滑肌细胞和成纤维细胞。但是应当指出，由于PTCA前人冠状动脉粥样斑块与猪的正常冠状动脉有较大不同，故Nunes的这一观点有待证实。
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2 介入性动脉损伤后超氧阴离子增多的机制
目前认为，血管损伤后参与O2-生成的途径可能主要包括：①线粒体的氧化呼吸作用；②膜结合的NADH/NADPH依赖的电子转移链；③花生四烯酸代谢酶；④黄嘌呤氧化酶；⑤某些组织代谢产物的自氧化作用。其中NADH/NADPH途径可能是产生O2-的最重要的途径[8～10]。PTCA机械性损伤导致血管局部发生一系列复杂的病理生理变化，使巨噬细胞和VSMC等释放多种细胞因子、生长因子以及某些血管肽类物质(如血管紧张素Ⅱ)[11～13]。这些物质可以诱导VSMC和成纤维细胞通过NADH/NADPH氧化酶产生O2-[8,10,14]。Kamal等[9]用差速离心法分析VSMC亚细胞成分中O2-生成情况，对不同亚细胞成分的标记酶活性和化学发光之间的关系进行统计分析。结果显示，只有NADH-细胞色素C还原酶活性与化学发光的分布范围相关，并且与NADH依赖性生成O2-的微粒体的位置分布相吻合，提示微粒体NADH依赖性的电子传递链系统可能是生成O2-的重要机制。Rajagonpalan等[10]和Griending等[15]最近的研究结果也表明，VSMC膜结合的NADH/NADPH氧化酶可能是生成O2-的最主要的途径。其他系统例如环氧合酶、脂氧合酶、胞质的黄嘌呤氧化酶系统、线粒体电子传递链可能不是主要途径。
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经皮冠状动脉腔内血管成形术后O2-增多的机制还与O2-清除物减少有关。Lafon[16]和Blann[17]报道，PTCA后患者血浆和红细胞中O2-清除物如硒、α-生育酚和谷胱甘肽过氧化酶均减少，这可能是由于细胞内O2-过多而清除物被消耗所致。
3 活性氧诱导血管平滑肌细胞增殖的信号转导
活性氧除具有消灭病原微生物的基本作用外,还具有其他一些重要的生物活性：即充当对外界刺激反应的细胞内第二信使，活化信号，转导级联反应，刺激VSMC分裂、增殖。例如，细胞因子和生长因子可诱导VSMC产生活性氧[14,18～20]，继而改变细胞内氧化还原状态，活化对氧化还原敏感的信号蛋白酶或转录因子，调节原癌基因表达，促进细胞增殖。
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3.1 超氧阴离子刺激血管平滑肌细胞增殖的信号调控作用
LY83583能自由通过细胞膜进入VSMC内,通过NADH/NADPH氧化酶产生 O2-。 Bass等[21]报道，1 μmol/L、LY83583刺激VSMC产生O2-的量为对照组的4.5倍，3H胸腺嘧啶掺入率和细胞计数也较对照组分别增加175%和300%，并且证明了O2-诱导VSMC增殖的关键环节是活化了细胞外信号调节酶(extracellular signal-regulated kinase , ERK) 。证据有三：①对抗ERK单克隆抗体免疫沉淀蛋白分析证明LY83583激活的是ERK2(42 kDa mitogen activated protein kinase , 42 kDa MAPK)和ERK1(44 kDa MAPK)；②Tiron能清除LY83583产生的O2-,当VSMC培养基中同时加入Tiron和LY83583时，Tiron能显著抑制LY83583对MAPK的活化作用；③O2-活化MAPK是蛋白激酶C依赖性的，蛋白激酶C活化后通过直接激活Ras/ERK通路诱导VSMC原癌基因表达。用佛波醇12 ,13-丁二酸盐(phorbol 12,13-dibutyrate，PDBU)预处理使VSMC的蛋白激酶C活性下调后，再用LY83583刺激VSMC则不能激活ERK。Bhunia等[22]进一步揭示，内源性O2-通过改变细胞内氧化还原状态，活化了对氧化还原敏感的信号蛋白激酶 P21(ras)和44 kDa MAPK，进而调节c-fos表达，促进VSMC增殖。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和还原型谷胱甘肽可以通过补充巯基来改变细胞内氧化还原状态，阻断MAPK和P21(ras)活化。
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3.2 活性氧对核因子-κB的信号调控作用
LY83583对MAPK的活化效应弱于佛波醇肉豆蔻醋酸盐(phorbol myristate acetate，PMA)，但两者诱导c-fos和c-myc mRNA转录的活性却相似，提示MAPK可能不是活性氧诱导VSMC增殖的唯一信号调控机制。目前认为，核因子-κB(nuclear factor-κB核因子-κB)是活性氧丝裂效应的另一重要调控机制，两者关系十分密切。VSMC在介入性损伤、病毒(巨细胞病毒等)感染或细胞因子刺激时，活性氧生成增多，并通过以下途径活化NF-κB[23～29]。①Ras-GTP或具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Raf-1，可能是多种诱导物诱导NF-κB活化的共同环节。当细胞内活性氧增多时，Ras或Raf-1被激活，Raf-1直接使NF-κB-IκB复合物磷酸化，导致IκB解离，活化的NF-κB转入核内调节靶基因。②NF-κB活化后与巨细胞病毒启动子中的κB位点结合，调节病毒即刻早期基因(immediately-early gene即刻早期基因)表达IE72和IE84两种蛋白。其中IE72以反式激活自身启动子促进巨细胞病毒复制，而IE84则与野生型p53结合阻断其功能，从而促使VSMC过度增殖。③活化的NF-κB还可以反式激活环氧化酶-2启动子，转译环氧化酶-2。花生四烯酸通过环氧化酶-2进行代谢并活化NADPH氧化酶，产生更多的活性氧 。活性氧再通过上述②、③两个正反馈途径进一步刺激病毒复制和VSMC增殖。④活化的蛋白激酶C使NF-κB-IκB复合物磷酸化，解除IκB的抑制作用，释放出有活性的NF-κB。⑤Shibutani等[29]进一步证明巨细胞病毒感染人主动脉平滑肌细胞后首先激活G蛋白，然后再依次MAPK激酶→MAPK→胞浆磷脂酶A2→花生四烯酸→活性氧，最后激活NF-κB。
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3.3 过氧化氢的信号调控作用
研究表明，细胞内、外过氧化氢浓度适度增加，可以促使VSMC增殖[14,19,20]。 Sundaresan等[14]报道，血小板源性生长因子刺激VSMC数分钟后，细胞内过氧化氢浓度即可升高，同时伴随MAPK酪氨酸磷酸化和3H胸腺嘧啶掺入率增加。然而随着细胞内过氧化氢清除物过氧化氢酶浓度增加，MAPK的活化效应受到抑制，可见，过氧化氢作为第二信使参与了血小板源性生长因子刺激VSMC增殖的信号转导过程。其机制可能是血小板源性生长因子刺激细胞内过氧化氢浓度升高，选择性灭活酪氨酸磷酯酶的催化活性[30]，改变了激酶-磷酸酯酶之间的平衡，从而活化了MAPK。但是,也有大量文献报道过氧化氢可以触发VSMC凋亡[31,32]。Li等[32]研究显示，反复接触黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤或过氧化氢-铁(Ⅱ)将诱导VSMC发生凋亡。深入研究揭示，导致VSMC凋亡的活性氧分子不是O2-，而是过氧化氢-铁(Ⅱ)。造成上述过氧化氢发挥不同生物学效应的机制目前还不清楚，推测研究方法，包括细胞增殖的评价方法不同和过氧化氢浓度及使用方法的不同可能是重要原因。在活体组织上，VSMC在活性氧刺激下是否表达抗凋亡基因bcl-xL，是细胞能否发生凋亡的关键[33]。Malik等[34]的研究提示，介入损伤后中膜VSMC在血管损伤早期以凋亡为主，而晚期(>14天)则以增殖为主。内膜VSMC由于抗凋亡基因bcl-xL表达上调而不易发生凋亡。但Pollman没有指出是何种活性氧分子诱导凋亡和增殖。总之，上述研究提示过氧化氢可能具有刺激VSMC增殖和诱导VSMC凋亡的双重作用。在RS和动脉粥样硬化形成过程中的不同阶段，过氧化氢可能由于细胞外不同条件刺激而发挥不同的信号调控作用。
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4 活性氧调控信号转导的氧化还原机制
细胞内氧化还原状态决定于活性氧及其氧化产物与抗氧化物，尤其是巯基/二硫化物之间的平衡。在许多类型细胞中，对氧化还原敏感的蛋白激酶和转录因子都参与了细胞信号转导，例如MAPK、p21、激活物蛋白-1(activator protein-1激活物蛋白)和 NF-κB等。这些蛋白分子上半胱氨酸侧链的CH2-SH是感受胞液氧化还原状态的关键结构，它与蛋白激酶之间的信息传递以及转录因子与DNA结合有密切关系。AP-1和NF-κB是目前研究得较为清楚的受氧化还原调节的两个转录因子。 AP-1是Jun和Fos蛋白二聚体。Fos和Jun蛋白DNA结合域内赖氨酸-半胱氨酸-精氨酸结构中的半胱氨酸是高度保守的单一半胱氨酸。半胱氨酸保持在还原状态是AP-1结合DNA所必需的条件[35]。当细胞内活性氧增多时，半胱氨酸被氧化成可逆的次黄酸和亚硫酸，能促进AP-1与DNA结合。而半胱氨酸的巯基被烷化剂或巯基氧化剂二酰胺氧化为二硫键时，AP-1与DNA结合的活性明显下降，提示保持半胱氨酸的还原状态可以调控AP-1转录活性。胞液中的硫氧还原蛋白具有氧化还原作用，可以通过其分子表面巯基的还原作用使AP-1分子DNA结合域的半胱氨酸残基保持还原状态，从而增强AP-1的转录活性[35]。
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NF-κB分子中高度保守的Rel同源区起始部一段短链氨基酸(RxxRxRxxC结构，R=精氨酸，C=半胱氨酸，X=其它氨基酸)，是直接结合DNA所必需的。而且，该结构中唯一的半胱氨酸也必需保持在还原状态才能有效地结合DNA[36]。胞液中氧化型谷胱甘肽浓度中等程度升高能有效活化NF-κB，而氧化型谷胱甘肽浓度过高则抑制NF-κB与DNA结合，过低则不能激活NF-κB[8]。VSMC经氧化物或干扰素-α短暂刺激后，胞液中氧化物和硫氧还原蛋白生成增多。氧化物使NF-κB从NF-κB-IκB复合物中解离出来，而硫氧还原蛋白使NF-κB保持在还原状态，从而促进NF-κB核转位并结合DNA。谷胱甘肽等抗氧化剂通过调节细胞氧化还原环境抑制 NF-κB-IκB 解离，降低 NF-κB 活性[38,39]。
5 结语
介入性动脉损伤后通过NADH/NADPH氧化酶使VSMC活性氧生成增加。后者作为第二信使改变细胞内氧化还原状态，参与许多与细胞信号转导有关的蛋白激酶和转录因子活化，通过Ras/ERK、NF-κB以及其他尚未阐明的信号通路激活靶基因，调控VSMC增殖和分化。因此，氧化还原机制在再狭窄发生中具有重要作用，阐明VSMC增殖的氧化还原机制不仅有助于进一步揭示再狭窄发生的本质，而且可以为抗氧化疗法防治再狭窄提供理论依据。
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[作者简介] 盛林，男，1961年出生,山东医科大学98级博士研究生
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(此文1999-05-07收到， 1999-11-30修回), 百拇医药
单位：盛林(山东医科大学附属医院心内科，济南 250012)；刘亚军(山东省平度市人民医院心内科，平度 266700)；潘其兴(山东医科大学附属医院心内科，济南 250012)
关键词：活性氧；肌，平滑；增殖；氧化还原
中国动脉硬化杂志000125[摘 要] 介入性动脉损伤后，局部血管平滑肌细胞和成纤维细胞均可通过NADH/NADPH氧化酶途径产生活性氧。而活性氧作为第二信使可改变细胞内氧化还原平衡状态，直接或间接地激活细胞内多种信号蛋白激酶和转录因子，促进血管平滑肌细胞增殖，最终导致血管再狭窄。
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再狭窄(restenosis，RS)是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous trans luminal coronary angioplasty , PTCA)远期疗效的主要障碍。近年研究报道抗氧化剂可显著降低PTCA后RS的发生[1,2]，提示氧化还原作用可能是影响再狭窄发生、发展的重要机制之一。本文就PTCA 后活性氧产生的途径和活性氧(O2-、H2O2、.OH、O2·)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖的影响作一综述，以探讨氧化还原机制在血管损伤后VSMC增殖中的作用和应用抗氧化剂防治血管再狭窄的潜在治疗价值。
1 介入性动脉损伤后活性氧产生增多
文献[3]报道PTCA后极短时间内局部血管壁细胞即可产生超氧阴离子(O2-)及脂质过氧化产物，冠状静脉内脂质过氧化产物丙二醛含量也较PTCA前显著增高。Grech等[4]使用自旋捕捉和电子顺磁共振分光技术，首次直接定量检测急性心肌梗死患者冠状静脉氧自由基水平，证实PTCA后 O2- 生成增加，并观察到PTCA后早期O2-增加有两个高峰期，即PTCA后1.5～3.5 h和18～24 h达高峰(已排除再闭塞)。第一次高峰与缺血再灌注后O2-爆发式产生有关，而第二次高峰可能与损伤血管局部的中性白细胞浸润、激活并释放O2-有关[3～5]。上述研究虽然获得了PTCA后早期O2-及丙二醛生成增多的直接证据，但无法排除因机械性损伤导致细胞破坏和动脉硬化斑块破裂等因素参与释放O2-和脂质过氧化物的可能性。由于受研究技术和方法的限制，尚无法在活体上证实产生O2-的真正的细胞来源。Nunes等[6]对猪冠状动脉 PTCA 14天后O2- 的生成情况以及应用抗氧化剂对O2-的影响进行了研究，结果表明，损伤血管段与未损伤血管段、同一血管的损伤段与未损伤段相比，O2-产生前者是后者的2～3倍。而经抗氧化剂维生素C、E或两者联合处理后，O2-产生明显减少，且与正常对照组无明显差异。Nunes和Kara还对猪PTCA后血管损伤段O2-的细胞来源进行了深入研究，认为VSMC、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和中性白细胞都参与了O2-的生成过程[6,7]。冠状动脉损伤后3天损伤处有中性白细胞，7天后消失，14天时仅有少量单核/巨噬细胞，据此推断，中性白细胞、单核/巨噬细胞不可能是冠状动脉损伤晚期(14天)O2-生成的主要来源。剥离损伤段血管内皮细胞后再测局部O2-，发现O2-仅减少了10%，因此，内皮细胞也不可能是O2-的主要来源。Nunes等据此认为，PTCA后O2-可能主要来自血管中膜和新生内膜的平滑肌细胞和成纤维细胞。但是应当指出，由于PTCA前人冠状动脉粥样斑块与猪的正常冠状动脉有较大不同，故Nunes的这一观点有待证实。
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2 介入性动脉损伤后超氧阴离子增多的机制
目前认为，血管损伤后参与O2-生成的途径可能主要包括：①线粒体的氧化呼吸作用；②膜结合的NADH/NADPH依赖的电子转移链；③花生四烯酸代谢酶；④黄嘌呤氧化酶；⑤某些组织代谢产物的自氧化作用。其中NADH/NADPH途径可能是产生O2-的最重要的途径[8～10]。PTCA机械性损伤导致血管局部发生一系列复杂的病理生理变化，使巨噬细胞和VSMC等释放多种细胞因子、生长因子以及某些血管肽类物质(如血管紧张素Ⅱ)[11～13]。这些物质可以诱导VSMC和成纤维细胞通过NADH/NADPH氧化酶产生O2-[8,10,14]。Kamal等[9]用差速离心法分析VSMC亚细胞成分中O2-生成情况，对不同亚细胞成分的标记酶活性和化学发光之间的关系进行统计分析。结果显示，只有NADH-细胞色素C还原酶活性与化学发光的分布范围相关，并且与NADH依赖性生成O2-的微粒体的位置分布相吻合，提示微粒体NADH依赖性的电子传递链系统可能是生成O2-的重要机制。Rajagonpalan等[10]和Griending等[15]最近的研究结果也表明，VSMC膜结合的NADH/NADPH氧化酶可能是生成O2-的最主要的途径。其他系统例如环氧合酶、脂氧合酶、胞质的黄嘌呤氧化酶系统、线粒体电子传递链可能不是主要途径。
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经皮冠状动脉腔内血管成形术后O2-增多的机制还与O2-清除物减少有关。Lafon[16]和Blann[17]报道，PTCA后患者血浆和红细胞中O2-清除物如硒、α-生育酚和谷胱甘肽过氧化酶均减少，这可能是由于细胞内O2-过多而清除物被消耗所致。
3 活性氧诱导血管平滑肌细胞增殖的信号转导
活性氧除具有消灭病原微生物的基本作用外,还具有其他一些重要的生物活性：即充当对外界刺激反应的细胞内第二信使，活化信号，转导级联反应，刺激VSMC分裂、增殖。例如，细胞因子和生长因子可诱导VSMC产生活性氧[14,18～20]，继而改变细胞内氧化还原状态，活化对氧化还原敏感的信号蛋白酶或转录因子，调节原癌基因表达，促进细胞增殖。
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3.1 超氧阴离子刺激血管平滑肌细胞增殖的信号调控作用
LY83583能自由通过细胞膜进入VSMC内,通过NADH/NADPH氧化酶产生 O2-。 Bass等[21]报道，1 μmol/L、LY83583刺激VSMC产生O2-的量为对照组的4.5倍，3H胸腺嘧啶掺入率和细胞计数也较对照组分别增加175%和300%，并且证明了O2-诱导VSMC增殖的关键环节是活化了细胞外信号调节酶(extracellular signal-regulated kinase , ERK) 。证据有三：①对抗ERK单克隆抗体免疫沉淀蛋白分析证明LY83583激活的是ERK2(42 kDa mitogen activated protein kinase , 42 kDa MAPK)和ERK1(44 kDa MAPK)；②Tiron能清除LY83583产生的O2-,当VSMC培养基中同时加入Tiron和LY83583时，Tiron能显著抑制LY83583对MAPK的活化作用；③O2-活化MAPK是蛋白激酶C依赖性的，蛋白激酶C活化后通过直接激活Ras/ERK通路诱导VSMC原癌基因表达。用佛波醇12 ,13-丁二酸盐(phorbol 12,13-dibutyrate，PDBU)预处理使VSMC的蛋白激酶C活性下调后，再用LY83583刺激VSMC则不能激活ERK。Bhunia等[22]进一步揭示，内源性O2-通过改变细胞内氧化还原状态，活化了对氧化还原敏感的信号蛋白激酶 P21(ras)和44 kDa MAPK，进而调节c-fos表达，促进VSMC增殖。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和还原型谷胱甘肽可以通过补充巯基来改变细胞内氧化还原状态，阻断MAPK和P21(ras)活化。
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3.2 活性氧对核因子-κB的信号调控作用
LY83583对MAPK的活化效应弱于佛波醇肉豆蔻醋酸盐(phorbol myristate acetate，PMA)，但两者诱导c-fos和c-myc mRNA转录的活性却相似，提示MAPK可能不是活性氧诱导VSMC增殖的唯一信号调控机制。目前认为，核因子-κB(nuclear factor-κB核因子-κB)是活性氧丝裂效应的另一重要调控机制，两者关系十分密切。VSMC在介入性损伤、病毒(巨细胞病毒等)感染或细胞因子刺激时，活性氧生成增多，并通过以下途径活化NF-κB[23～29]。①Ras-GTP或具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Raf-1，可能是多种诱导物诱导NF-κB活化的共同环节。当细胞内活性氧增多时，Ras或Raf-1被激活，Raf-1直接使NF-κB-IκB复合物磷酸化，导致IκB解离，活化的NF-κB转入核内调节靶基因。②NF-κB活化后与巨细胞病毒启动子中的κB位点结合，调节病毒即刻早期基因(immediately-early gene即刻早期基因)表达IE72和IE84两种蛋白。其中IE72以反式激活自身启动子促进巨细胞病毒复制，而IE84则与野生型p53结合阻断其功能，从而促使VSMC过度增殖。③活化的NF-κB还可以反式激活环氧化酶-2启动子，转译环氧化酶-2。花生四烯酸通过环氧化酶-2进行代谢并活化NADPH氧化酶，产生更多的活性氧 。活性氧再通过上述②、③两个正反馈途径进一步刺激病毒复制和VSMC增殖。④活化的蛋白激酶C使NF-κB-IκB复合物磷酸化，解除IκB的抑制作用，释放出有活性的NF-κB。⑤Shibutani等[29]进一步证明巨细胞病毒感染人主动脉平滑肌细胞后首先激活G蛋白，然后再依次MAPK激酶→MAPK→胞浆磷脂酶A2→花生四烯酸→活性氧，最后激活NF-κB。
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3.3 过氧化氢的信号调控作用
研究表明，细胞内、外过氧化氢浓度适度增加，可以促使VSMC增殖[14,19,20]。 Sundaresan等[14]报道，血小板源性生长因子刺激VSMC数分钟后，细胞内过氧化氢浓度即可升高，同时伴随MAPK酪氨酸磷酸化和3H胸腺嘧啶掺入率增加。然而随着细胞内过氧化氢清除物过氧化氢酶浓度增加，MAPK的活化效应受到抑制，可见，过氧化氢作为第二信使参与了血小板源性生长因子刺激VSMC增殖的信号转导过程。其机制可能是血小板源性生长因子刺激细胞内过氧化氢浓度升高，选择性灭活酪氨酸磷酯酶的催化活性[30]，改变了激酶-磷酸酯酶之间的平衡，从而活化了MAPK。但是,也有大量文献报道过氧化氢可以触发VSMC凋亡[31,32]。Li等[32]研究显示，反复接触黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤或过氧化氢-铁(Ⅱ)将诱导VSMC发生凋亡。深入研究揭示，导致VSMC凋亡的活性氧分子不是O2-，而是过氧化氢-铁(Ⅱ)。造成上述过氧化氢发挥不同生物学效应的机制目前还不清楚，推测研究方法，包括细胞增殖的评价方法不同和过氧化氢浓度及使用方法的不同可能是重要原因。在活体组织上，VSMC在活性氧刺激下是否表达抗凋亡基因bcl-xL，是细胞能否发生凋亡的关键[33]。Malik等[34]的研究提示，介入损伤后中膜VSMC在血管损伤早期以凋亡为主，而晚期(>14天)则以增殖为主。内膜VSMC由于抗凋亡基因bcl-xL表达上调而不易发生凋亡。但Pollman没有指出是何种活性氧分子诱导凋亡和增殖。总之，上述研究提示过氧化氢可能具有刺激VSMC增殖和诱导VSMC凋亡的双重作用。在RS和动脉粥样硬化形成过程中的不同阶段，过氧化氢可能由于细胞外不同条件刺激而发挥不同的信号调控作用。
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4 活性氧调控信号转导的氧化还原机制
细胞内氧化还原状态决定于活性氧及其氧化产物与抗氧化物，尤其是巯基/二硫化物之间的平衡。在许多类型细胞中，对氧化还原敏感的蛋白激酶和转录因子都参与了细胞信号转导，例如MAPK、p21、激活物蛋白-1(activator protein-1激活物蛋白)和 NF-κB等。这些蛋白分子上半胱氨酸侧链的CH2-SH是感受胞液氧化还原状态的关键结构，它与蛋白激酶之间的信息传递以及转录因子与DNA结合有密切关系。AP-1和NF-κB是目前研究得较为清楚的受氧化还原调节的两个转录因子。 AP-1是Jun和Fos蛋白二聚体。Fos和Jun蛋白DNA结合域内赖氨酸-半胱氨酸-精氨酸结构中的半胱氨酸是高度保守的单一半胱氨酸。半胱氨酸保持在还原状态是AP-1结合DNA所必需的条件[35]。当细胞内活性氧增多时，半胱氨酸被氧化成可逆的次黄酸和亚硫酸，能促进AP-1与DNA结合。而半胱氨酸的巯基被烷化剂或巯基氧化剂二酰胺氧化为二硫键时，AP-1与DNA结合的活性明显下降，提示保持半胱氨酸的还原状态可以调控AP-1转录活性。胞液中的硫氧还原蛋白具有氧化还原作用，可以通过其分子表面巯基的还原作用使AP-1分子DNA结合域的半胱氨酸残基保持还原状态，从而增强AP-1的转录活性[35]。
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NF-κB分子中高度保守的Rel同源区起始部一段短链氨基酸(RxxRxRxxC结构，R=精氨酸，C=半胱氨酸，X=其它氨基酸)，是直接结合DNA所必需的。而且，该结构中唯一的半胱氨酸也必需保持在还原状态才能有效地结合DNA[36]。胞液中氧化型谷胱甘肽浓度中等程度升高能有效活化NF-κB，而氧化型谷胱甘肽浓度过高则抑制NF-κB与DNA结合，过低则不能激活NF-κB[8]。VSMC经氧化物或干扰素-α短暂刺激后，胞液中氧化物和硫氧还原蛋白生成增多。氧化物使NF-κB从NF-κB-IκB复合物中解离出来，而硫氧还原蛋白使NF-κB保持在还原状态，从而促进NF-κB核转位并结合DNA。谷胱甘肽等抗氧化剂通过调节细胞氧化还原环境抑制 NF-κB-IκB 解离，降低 NF-κB 活性[38,39]。
5 结语
介入性动脉损伤后通过NADH/NADPH氧化酶使VSMC活性氧生成增加。后者作为第二信使改变细胞内氧化还原状态，参与许多与细胞信号转导有关的蛋白激酶和转录因子活化，通过Ras/ERK、NF-κB以及其他尚未阐明的信号通路激活靶基因，调控VSMC增殖和分化。因此，氧化还原机制在再狭窄发生中具有重要作用，阐明VSMC增殖的氧化还原机制不仅有助于进一步揭示再狭窄发生的本质，而且可以为抗氧化疗法防治再狭窄提供理论依据。
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[作者简介] 盛林，男，1961年出生,山东医科大学98级博士研究生
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(此文1999-05-07收到， 1999-11-30修回), 百拇医药