家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞增殖
作者：徐仓宝 张亚萍 王亚文
单位：西安医科大学动脉粥样硬化研究室， 陕西省西安市 710061
关键词：肌，平滑，血管；条件培养基；增殖；自分泌；旁分泌；生长抑制因子；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000105[摘 要] 为探讨血管平滑肌细胞自分泌和旁分泌对血管平滑肌细胞增殖的抑 制作用，采用家兔主动脉贴块培养法培养血管平滑肌细胞，并制备平滑肌细胞条件培养基。 采用孔径100 kDa和10 kDa的Millipore滤膜，将平滑肌细胞条件培养基分部。平滑肌细胞增 殖测定采用宝灵曼试剂盒XTT法。结果提示，家兔血管平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑 肌细胞的增殖，浓度50%的平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞的增殖率高达45%，且 该生长抑制活性物质具有剂量依赖、加热56℃ 30 min稳定和分子质量小于10 kDa的特点。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R364.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0017-04
The Conditioned Medium from Rabbit Aortic Smooth Muscle Cells Inhibited Prolifer ation of Vascular cular Smooth Muscle Cell
XU Cang-Bao ZHANG Ya-Ping WANG Ya-Wen
(Laboratory for Atherosclerosis Research, Xi'an Medical University, Xi'an 710061 , China)
ABSTRACT Aim To ascertain whether vascular smooth muscle cells inhibit vascular smooth muscle cell proliferation by autocrine or paracrine of growth inhibitors. Methods Conditioned medium from rabbit aortic smooth muscle cell was used in this study. The conditioned mediu m was filtered by cut off M.W. 100 kDa or 10 kDa (Millipore). Smooth muscle cell proliferation was assayed by the measurement of XTT (Boehringer Mannhein). Results Rabbit aortic smooth muscle cell conditio ned medium inhibited smooth muscle cell proliferation, 50% smooth muscle cell co nditioned medium achieved 45% inhibitory rate of smooth muscle cell proliferatio n. This inhibition activity substance is dose dependent, 56℃, 30 min heat stab le and M.W.less than 10 kDa. Conclusions Rabbit aortic smooth muscle cell could inhibit smooth muscle cell proliferation by autocrine or paracrine growth inhib itors.
, 百拇医药
MeSH Muscle,Smooth,Vascular; Conditioned Medium; Proliferation ; Autocrine; Paracrine； Growth Inhibitor; Atherosclerosis
动脉平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化发生和发展中起 重要作用 [1]。当动脉局部受损或在生长因子刺激下，动脉平滑肌细胞从中层移行到内膜下 ，并在内膜下增殖，参与损伤的修复过程。大量研究资料表明，动脉平滑肌细胞能够分泌血 小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、纤维母细胞生长因子(fibrobl ast growth factor, FGF)以及转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β )等，并通过自分泌或旁分泌的方式调节平滑肌细胞自身的增殖[2]。但是，动脉平滑肌细 胞分泌生长抑制因子， 参与平滑肌细胞增殖调控的研究报道甚少。我们既往的研究证明，动脉内皮细胞分泌生长刺 激活性物质和生长抑制活性物质，二者的平衡调节平滑肌细胞的增殖[3-5]。本 研究采用家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基，观察其对动 脉平滑肌细胞增殖的影响作用，旨在探讨动脉平滑肌细胞通过自分泌或旁分泌或旁分泌生长 抑制活性物质调节平滑肌细胞增殖的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 家兔主动脉平滑肌细胞的培养和鉴定
家兔12周左右，耳缘静脉注气处死，取主动脉纵向剖开，去除动脉外膜和内皮，然后将动脉 中层平滑肌切成表面积为1×1 mm2的小块，种植在底表面积为12.5 cm2的玻璃培养 瓶中，用含15%新生小牛血清(new born bovine serum, NBS)的DMEM/F12 (Sigma) 11培 养基，在37℃,5%CO2条件下进行培养，0.25%胰酶消化传代，5～10代平滑肌细胞用于 实验[6]。平滑肌细胞台盼蓝染色，活细胞数在98%以上。平滑肌细胞的鉴定采用 α-actin免疫组织学织化学染色阳性，以及形态学典型的“峰和谷”样生长状态判定。
1.2 条件培养基的制备
, 百拇医药 传代后的平滑肌细胞在底面积为25 cm2玻璃培养瓶中生长融合后，再继续培养3天，用PB S (pH 7.4)洗3次，换成无血清培养基5 mL， 48 h后收集条件培养基，离心10 min，去除细 胞碎片，-20℃保存。实验时分别在24 h，48 h及72 h收集条件培养基[4]。
1.3 条件培养基的过滤分离
采用Millipore滤膜，孔径100 kDa或10 kDa，将平滑肌细胞条件培养基粗分为分子质量小于 100 kDa或小于10 kDa两部分[7]。
1.4 平滑肌细胞增殖测定
采用XTT法(Boehringer Mannhein)[8]。简而言之，培养细胞在24孔板中，PBS洗 三次，加入XTT检测液(XTT/PBS 1∶2) 0.5 mL，在37℃，5% CO2条件下培养12 h，收集 XTT检测液，紫外分光光度计(PE， Lamda 5) 492 nm处读数。
, 百拇医药
1.5 实验步骤
平滑肌细胞按每孔6 000个细胞种植在24孔培养板(NUNC)中，用15% NBS的DMEM/F12培养基， 在37℃，5%CO2条件下培养24 h，用PBS洗三次，换成0.25 mL无血清培养基加0.25 mL 无血清条件培养基。对照组为0.5 mL无血清培养基。然后在37℃， 5% CO2条件下培养48 h，进行XTT检测。条件培养基不同作用时间试验分别在24 h，48 h和72 h进行XTT检测。平 滑肌细胞增殖抑制率按以下公式计算：
增殖抑制率(%)=[1-实验组XTT OD(
)值/对照组XTT OD值()]×100%
1.6 条件培养基热稳定实验
, 百拇医药
将条件培养基加热至56℃ 30 min，待冷却后，按1∶1比例与无血清培养基进行混合，然 后用于实验。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(±s)表示。统计学采用 t检验，以P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平滑肌细胞的增殖抑制作用
无血清平滑肌细胞条件培养基与无血清培养基按1∶3、 1∶1和3∶1混合，得到25%、 50% 和75%的平滑肌细胞条件培养基。把不同浓度的条件培养基加入24孔板平滑肌细胞培养中， 每孔1 mL,培养48 h，用XTT法测定细胞增殖，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率，结果如表1 (Table 1)所示。
, 百拇医药
表1.不同浓度家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平滑肌细胞增殖的抑制作用
Table 1. Effects of different does of conditioned medium from
rabbit aortic smo oth muscle cells on inhibition of smooth muscle cell proliferation Groups
n
OD of XTT
Inhibiting rate(%)
Control (SF)
4
, 百拇医药
1.423±0.083
0
25% CM
4
1.178±0.074b
17
50% CM
4
0.780±0.192c
45
75% CM
4
, http://www.100md.com
0.438±0.025d
69
CM=conditioned medium, SF=Serum free medium. b: P<0.05 ， c: P<0.01, d: P<0.001， compa red with control group.
由表1 (Table 1)可以看出，与无血清培养基相比，无血清平滑肌细胞条 件培养基对平滑肌细胞增殖有显著抑制作用，且随着浓度增大，抑制作用增强(r＝-0.9960 , P<0.001)。
2.2 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集时间对平滑肌细胞增殖抑制作用 的影响
融合三天后的平滑肌细胞，用PBS洗3次，换成无血清培养基，分别在换液后24 h、48 h和72 h收集条件培养基，与无血清培养基按1∶1混合后，加入24孔板平滑肌细胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，用XTT法测定细胞增殖，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。结果如表2 (Tab le 2)所示。可见，平滑肌细胞条件培养基不同收集时间对条件培养基抑制 平滑肌增殖作用有一定的影响，随着收集时间的延长，生长抑制活性有增强的趋势。
, http://www.100md.com
表2. 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集
时间对平滑肌细胞增殖抑制作用的影响
Table 1. Effects of different collecting time of conditioned medium from
rabbi t aortic smooth muscle cells on inhibition of smooth muscle cell proliferation Groups
n
OD of XTT
Inhibiting rate(%)
Control (SF)
, 百拇医药
4
1.533±0.323
0
24 h
4
1.102±0.235c
28
48 h
4
0.940±0.112c
39
72 h
, 百拇医药
4
0.842±0.155c
45
CM=conditioned medium, SF=Serum free medium. c: P<0.01 , compared with control group.
2.3 条件培养基热稳定实验
将条件培养基加热至56℃ 30 min，冷却后，与无血清培养基按1∶1混合，加入24孔板平 滑肌细胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，测XTT值，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。实验 结果如图1 (Figure 1)所示。
, 百拇医药 图1. 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基生长抑制活性的热稳定实验
Figure 1. Effect of heat on growth inhibiting activity of conditioned
medium fr om rabbit aortic smooth muscle cells
SF = serum free medium, no heat = no heat conditioned medium, heated = heated
co nditioned medium. a: P>0.05, compared with no heat conditioned m edium.
由图1 (Figure 1)可以看出，加热前后，家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制平滑肌细 胞增殖的活性无显著变化 (P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.4 条件培养基分部试验
采用孔径100 kDa或 10 kDa Millipore滤膜，将条件培养基粗分为分子质量小于10 kDa和 小于100 kDa两个部分，然后把它们分别与无血清培养基按1∶1混合，加入24孔板平滑肌细 胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，测XTT值，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。结果如图2 ( Figure 2)所示。 可见，与家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基相比，分子质量小于100 kDa部分和分 子质量小于10 kDa部分，三者之间对平滑肌细胞增殖抑制作用没有显著性差异(P>0.05)。
图2. 不同分部的家兔主动脉平滑肌细胞条件
培养基对平滑肌细胞增殖的抑制作用
Figure 2. Effect of different fractions of conditi oned medium from
, 百拇医药
rabbit aortic smooth muscle cells on smooth muscle cell prolife ration
SF=serum free medium,CM=conditioned medium, <10 kDa=M.W.less
than 10 kDa of cond itioned medium, <100 kDa=M.W less than 100 kDa
of conditioned medium, n= number of wells
3 讨论
本文对家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基影响平滑肌细胞增殖的作用进行了实验观察，结果 提示：平滑肌细胞条件培养基可以抑制平滑肌细胞增殖，且该生长抑制活性物质具有剂量依 赖，热稳定，分子质量小于10 kDa的特点。这与我们以前报道的牛主动脉内皮细胞条件培养 基中的小分子生长抑制活性物质相类似[3，4]。血管细胞条件培养基中存在着许 多刺激平滑肌细胞增殖的因子，如：PDGF， FGF等，同时也存在着抑制平滑肌增殖的因子， 如：TGF-β，肝素样物质。但TGF-β和肝素样物质分子质量比10 kDa大。平滑肌细胞分泌的 一氧化氮(nitric oxide, NO)和前列环素(prostaglandin I2, PGI2)，它们虽分子质 量小，且具有抑制平滑肌细胞增殖的作用，但因其半衰期仅数秒钟到数分钟，不可能通过条 件培养基发挥其抑制细胞增殖的活性[9]。本研究结果提示家兔平滑肌细胞条件培 养基中存在一种小分子生长抑制物质，但其性质有待于进一步试验澄清。从理论上讲，条件 培养基对细胞增殖起负调节还是正调节作用，是由条件培养基中生长刺激活性物质和生长抑 制活性物质之间的平衡决定。若生长刺激活性物质占优势，则刺激细胞增殖，若生长抑制活 性物质占优势，则抑制细胞增殖。在本实验条件下，家兔主动脉平滑肌条件培养基中生长抑 制活性可能占优势。因此，条件培养基中的多种生长因子可能不能够发挥生长刺激作用，这 与Orlidge等[10]和Dodge等[7]人的研究结果有相同之处[11] ，同时，也与生理 状态下体内血管平滑肌细胞处于静止和非增殖状态相符合。由此推测，在各种动脉粥样硬化 的“危险因子”作用下，血管壁局部生长刺激活性和生长抑制活性之间的平衡紊乱，使得生 长刺激活性占优势，引起平滑肌细胞大量增殖，从而参与动脉粥样硬化病灶的形成和发展。
, 百拇医药
参考文献
[1] Ross R. 90年代动脉粥样硬化发病机制的研究进展和方向[J]. 中国动脉硬化杂志， 1993， 1(1)： 79-84
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[3] Xu CB, PessahR H Stavenow L. Interactions between cultured bovine arterial endothelial and smooth muscle cells:Effects of injury on the release of growth stimulating and growth inhibiting substances [J]. Pharmacol & Toxicol, 1991, 69: 195-200
, 百拇医药
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[5] Xu CB, Stavenow L，and Pessen-Rasmussen H. Interactions betwee n cultured bovine arterial endothelial and smooth muscle cells;Studies on the re lease of prostacyclin by endothelial cells [J]. Artery, 1992, 19: 94-111
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[7] Dodge AB, Lu X, D′Amore PA. Density-dependent endothelial cew ll production of an inhibitor of smooth muscle cell growth [J]. J Cell Biochem,1993, 53(1): 21-31
[8] Roehm NW, Rodgers GH，et al. An improved colorimetric assay f o r cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT [J]. J Immunol Methods, 1991, 142(2): 257-265
, 百拇医药
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[11] McMurray HF, Proudfoot D, et al. A small molecular mass inh ibitor of growth of 3T3 cells and porcine aortic smooth muscle cells released fr om the macrophage cell line P388D1 [J]. J Cell Sci, 1993, 106 (4): 1 301-11
(此文1999-05-24收到， 2000-03-07修回), 百拇医药
单位：西安医科大学动脉粥样硬化研究室， 陕西省西安市 710061
关键词：肌，平滑，血管；条件培养基；增殖；自分泌；旁分泌；生长抑制因子；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000105[摘 要] 为探讨血管平滑肌细胞自分泌和旁分泌对血管平滑肌细胞增殖的抑 制作用，采用家兔主动脉贴块培养法培养血管平滑肌细胞，并制备平滑肌细胞条件培养基。 采用孔径100 kDa和10 kDa的Millipore滤膜，将平滑肌细胞条件培养基分部。平滑肌细胞增 殖测定采用宝灵曼试剂盒XTT法。结果提示，家兔血管平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑 肌细胞的增殖，浓度50%的平滑肌细胞条件培养基抑制血管平滑肌细胞的增殖率高达45%，且 该生长抑制活性物质具有剂量依赖、加热56℃ 30 min稳定和分子质量小于10 kDa的特点。
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[中图分类号] R364.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0017-04
The Conditioned Medium from Rabbit Aortic Smooth Muscle Cells Inhibited Prolifer ation of Vascular cular Smooth Muscle Cell
XU Cang-Bao ZHANG Ya-Ping WANG Ya-Wen
(Laboratory for Atherosclerosis Research, Xi'an Medical University, Xi'an 710061 , China)
ABSTRACT Aim To ascertain whether vascular smooth muscle cells inhibit vascular smooth muscle cell proliferation by autocrine or paracrine of growth inhibitors. Methods Conditioned medium from rabbit aortic smooth muscle cell was used in this study. The conditioned mediu m was filtered by cut off M.W. 100 kDa or 10 kDa (Millipore). Smooth muscle cell proliferation was assayed by the measurement of XTT (Boehringer Mannhein). Results Rabbit aortic smooth muscle cell conditio ned medium inhibited smooth muscle cell proliferation, 50% smooth muscle cell co nditioned medium achieved 45% inhibitory rate of smooth muscle cell proliferatio n. This inhibition activity substance is dose dependent, 56℃, 30 min heat stab le and M.W.less than 10 kDa. Conclusions Rabbit aortic smooth muscle cell could inhibit smooth muscle cell proliferation by autocrine or paracrine growth inhib itors.
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MeSH Muscle,Smooth,Vascular; Conditioned Medium; Proliferation ; Autocrine; Paracrine； Growth Inhibitor; Atherosclerosis
动脉平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化发生和发展中起 重要作用 [1]。当动脉局部受损或在生长因子刺激下，动脉平滑肌细胞从中层移行到内膜下 ，并在内膜下增殖，参与损伤的修复过程。大量研究资料表明，动脉平滑肌细胞能够分泌血 小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、纤维母细胞生长因子(fibrobl ast growth factor, FGF)以及转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β )等，并通过自分泌或旁分泌的方式调节平滑肌细胞自身的增殖[2]。但是，动脉平滑肌细 胞分泌生长抑制因子， 参与平滑肌细胞增殖调控的研究报道甚少。我们既往的研究证明，动脉内皮细胞分泌生长刺 激活性物质和生长抑制活性物质，二者的平衡调节平滑肌细胞的增殖[3-5]。本 研究采用家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基，观察其对动 脉平滑肌细胞增殖的影响作用，旨在探讨动脉平滑肌细胞通过自分泌或旁分泌或旁分泌生长 抑制活性物质调节平滑肌细胞增殖的作用。
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1 材料与方法
1.1 家兔主动脉平滑肌细胞的培养和鉴定
家兔12周左右，耳缘静脉注气处死，取主动脉纵向剖开，去除动脉外膜和内皮，然后将动脉 中层平滑肌切成表面积为1×1 mm2的小块，种植在底表面积为12.5 cm2的玻璃培养 瓶中，用含15%新生小牛血清(new born bovine serum, NBS)的DMEM/F12 (Sigma) 11培 养基，在37℃,5%CO2条件下进行培养，0.25%胰酶消化传代，5～10代平滑肌细胞用于 实验[6]。平滑肌细胞台盼蓝染色，活细胞数在98%以上。平滑肌细胞的鉴定采用 α-actin免疫组织学织化学染色阳性，以及形态学典型的“峰和谷”样生长状态判定。
1.2 条件培养基的制备
, 百拇医药 传代后的平滑肌细胞在底面积为25 cm2玻璃培养瓶中生长融合后，再继续培养3天，用PB S (pH 7.4)洗3次，换成无血清培养基5 mL， 48 h后收集条件培养基，离心10 min，去除细 胞碎片，-20℃保存。实验时分别在24 h，48 h及72 h收集条件培养基[4]。
1.3 条件培养基的过滤分离
采用Millipore滤膜，孔径100 kDa或10 kDa，将平滑肌细胞条件培养基粗分为分子质量小于 100 kDa或小于10 kDa两部分[7]。
1.4 平滑肌细胞增殖测定
采用XTT法(Boehringer Mannhein)[8]。简而言之，培养细胞在24孔板中，PBS洗 三次，加入XTT检测液(XTT/PBS 1∶2) 0.5 mL，在37℃，5% CO2条件下培养12 h，收集 XTT检测液，紫外分光光度计(PE， Lamda 5) 492 nm处读数。
, 百拇医药
1.5 实验步骤
平滑肌细胞按每孔6 000个细胞种植在24孔培养板(NUNC)中，用15% NBS的DMEM/F12培养基， 在37℃，5%CO2条件下培养24 h，用PBS洗三次，换成0.25 mL无血清培养基加0.25 mL 无血清条件培养基。对照组为0.5 mL无血清培养基。然后在37℃， 5% CO2条件下培养48 h，进行XTT检测。条件培养基不同作用时间试验分别在24 h，48 h和72 h进行XTT检测。平 滑肌细胞增殖抑制率按以下公式计算：
增殖抑制率(%)=[1-实验组XTT OD(
)值/对照组XTT OD值()]×100%1.6 条件培养基热稳定实验
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将条件培养基加热至56℃ 30 min，待冷却后，按1∶1比例与无血清培养基进行混合，然 后用于实验。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(
±s)表示。统计学采用 t检验，以P<0.05表示差异有显著性。2 结果
2.1 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平滑肌细胞的增殖抑制作用
无血清平滑肌细胞条件培养基与无血清培养基按1∶3、 1∶1和3∶1混合，得到25%、 50% 和75%的平滑肌细胞条件培养基。把不同浓度的条件培养基加入24孔板平滑肌细胞培养中， 每孔1 mL,培养48 h，用XTT法测定细胞增殖，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率，结果如表1 (Table 1)所示。
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表1.不同浓度家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基对平滑肌细胞增殖的抑制作用
Table 1. Effects of different does of conditioned medium from
rabbit aortic smo oth muscle cells on inhibition of smooth muscle cell proliferation Groups
n
OD of XTT
Inhibiting rate(%)
Control (SF)
4
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1.423±0.083
0
25% CM
4
1.178±0.074b
17
50% CM
4
0.780±0.192c
45
75% CM
4
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0.438±0.025d
69
CM=conditioned medium, SF=Serum free medium. b: P<0.05 ， c: P<0.01, d: P<0.001， compa red with control group.
由表1 (Table 1)可以看出，与无血清培养基相比，无血清平滑肌细胞条 件培养基对平滑肌细胞增殖有显著抑制作用，且随着浓度增大，抑制作用增强(r＝-0.9960 , P<0.001)。
2.2 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集时间对平滑肌细胞增殖抑制作用 的影响
融合三天后的平滑肌细胞，用PBS洗3次，换成无血清培养基，分别在换液后24 h、48 h和72 h收集条件培养基，与无血清培养基按1∶1混合后，加入24孔板平滑肌细胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，用XTT法测定细胞增殖，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。结果如表2 (Tab le 2)所示。可见，平滑肌细胞条件培养基不同收集时间对条件培养基抑制 平滑肌增殖作用有一定的影响，随着收集时间的延长，生长抑制活性有增强的趋势。
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表2. 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基不同收集
时间对平滑肌细胞增殖抑制作用的影响
Table 1. Effects of different collecting time of conditioned medium from
rabbi t aortic smooth muscle cells on inhibition of smooth muscle cell proliferation Groups
n
OD of XTT
Inhibiting rate(%)
Control (SF)
, 百拇医药
4
1.533±0.323
0
24 h
4
1.102±0.235c
28
48 h
4
0.940±0.112c
39
72 h
, 百拇医药
4
0.842±0.155c
45
CM=conditioned medium, SF=Serum free medium. c: P<0.01 , compared with control group.
2.3 条件培养基热稳定实验
将条件培养基加热至56℃ 30 min，冷却后，与无血清培养基按1∶1混合，加入24孔板平 滑肌细胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，测XTT值，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。实验 结果如图1 (Figure 1)所示。
, 百拇医药 图1. 家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基生长抑制活性的热稳定实验
Figure 1. Effect of heat on growth inhibiting activity of conditioned
medium fr om rabbit aortic smooth muscle cells
SF = serum free medium, no heat = no heat conditioned medium, heated = heated
co nditioned medium. a: P>0.05, compared with no heat conditioned m edium.
由图1 (Figure 1)可以看出，加热前后，家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基抑制平滑肌细 胞增殖的活性无显著变化 (P>0.05)。
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2.4 条件培养基分部试验
采用孔径100 kDa或 10 kDa Millipore滤膜，将条件培养基粗分为分子质量小于10 kDa和 小于100 kDa两个部分，然后把它们分别与无血清培养基按1∶1混合，加入24孔板平滑肌细 胞培养中，每孔1 mL，培养48 h，测XTT值，计算平滑肌细胞增殖抑制百分率。结果如图2 ( Figure 2)所示。 可见，与家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基相比，分子质量小于100 kDa部分和分 子质量小于10 kDa部分，三者之间对平滑肌细胞增殖抑制作用没有显著性差异(P>0.05)。
图2. 不同分部的家兔主动脉平滑肌细胞条件
培养基对平滑肌细胞增殖的抑制作用
Figure 2. Effect of different fractions of conditi oned medium from
, 百拇医药
rabbit aortic smooth muscle cells on smooth muscle cell prolife ration
SF=serum free medium,CM=conditioned medium, <10 kDa=M.W.less
than 10 kDa of cond itioned medium, <100 kDa=M.W less than 100 kDa
of conditioned medium, n= number of wells
3 讨论
本文对家兔主动脉平滑肌细胞条件培养基影响平滑肌细胞增殖的作用进行了实验观察，结果 提示：平滑肌细胞条件培养基可以抑制平滑肌细胞增殖，且该生长抑制活性物质具有剂量依 赖，热稳定，分子质量小于10 kDa的特点。这与我们以前报道的牛主动脉内皮细胞条件培养 基中的小分子生长抑制活性物质相类似[3，4]。血管细胞条件培养基中存在着许 多刺激平滑肌细胞增殖的因子，如：PDGF， FGF等，同时也存在着抑制平滑肌增殖的因子， 如：TGF-β，肝素样物质。但TGF-β和肝素样物质分子质量比10 kDa大。平滑肌细胞分泌的 一氧化氮(nitric oxide, NO)和前列环素(prostaglandin I2, PGI2)，它们虽分子质 量小，且具有抑制平滑肌细胞增殖的作用，但因其半衰期仅数秒钟到数分钟，不可能通过条 件培养基发挥其抑制细胞增殖的活性[9]。本研究结果提示家兔平滑肌细胞条件培 养基中存在一种小分子生长抑制物质，但其性质有待于进一步试验澄清。从理论上讲，条件 培养基对细胞增殖起负调节还是正调节作用，是由条件培养基中生长刺激活性物质和生长抑 制活性物质之间的平衡决定。若生长刺激活性物质占优势，则刺激细胞增殖，若生长抑制活 性物质占优势，则抑制细胞增殖。在本实验条件下，家兔主动脉平滑肌条件培养基中生长抑 制活性可能占优势。因此，条件培养基中的多种生长因子可能不能够发挥生长刺激作用，这 与Orlidge等[10]和Dodge等[7]人的研究结果有相同之处[11] ，同时，也与生理 状态下体内血管平滑肌细胞处于静止和非增殖状态相符合。由此推测，在各种动脉粥样硬化 的“危险因子”作用下，血管壁局部生长刺激活性和生长抑制活性之间的平衡紊乱，使得生 长刺激活性占优势，引起平滑肌细胞大量增殖，从而参与动脉粥样硬化病灶的形成和发展。
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参考文献
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(此文1999-05-24收到， 2000-03-07修回), 百拇医药