转基因小鼠中人清道夫受体AI基因的稳定遗传和特异表达
作者：万腊香 杨永宗 Sookja S. Chung Stephen S.M. Chung 曹德良 吴孟津 万载阳 陈修
单位：吴孟津(衡阳医学院分子生物学研究中心， 湖南省衡阳市 421001)；万载阳(衡阳医学院分子生物学研究中心， 湖南省衡阳市 421001)；陈修(湖南医科大学药理学教研室，湖南省长沙市 410078)
关键词：人清道夫受体AI；小鼠， 转基因；遗传；基因表达；内皮，血管；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000103[摘 要] 为阐明人清道夫受体AI (hSR-AI)的功能及在动脉粥样硬化发生中的作用,本研究首 先构建了含鼠 tie-1启动子和人清道夫受体AI cDNA的表达载体，经酶切及测序鉴定后，用 显微注射 的方法将制备好的tie-1-hSR-A-BGH poly A片段注入受精卵，将注射后存活的受精卵移入IC R假孕母鼠，产下的仔鼠经聚合酶链反应和Southern blot分析，筛选出整合有外源目的基 因的阳性转 基因鼠；对小鼠组织RNA行逆转录聚合酶链反应及组织切片免疫组织化学染色，检测人清道 夫受体AI在小鼠体内的表 达水平及表达部位；光镜及电镜观察转基因鼠血管及其它组织的病理变化。结果发现， 重 组Tie-1/hSR-AI质粒中鼠tie-1启动子和人清道夫受体AI cDNA序列正确，显微注射后存活的 561枚受 精卵分别移入19只ICR假孕母鼠，有13只受孕，共产下56只仔鼠，存活54只，经过整合检测 ，检出7只阳性鼠，整合效率为13%。在G1、 G2、 G3 代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别 为47.8%、 71.3%、 75.0% 和 100%。5只雄性转基因鼠的主动脉、肾、肝等组织中均有人清 道夫受体 AI表达，且主要集中在血管的内皮细胞上；转基因鼠主动脉内皮细胞明显水肿，表面呈多囊 状和虫蚀样改变，胞质中有较多水泡，中膜有糖原沉积样灶性病变，平滑肌细胞中亦有水肿 ；血浆甘油三酯水平明显高于非C57BL/6鼠(P<0.05)，总胆固醇水平虽 不比C57BL/6高，但雄 性鼠总胆固醇水平明显高于雌性(P<0.01)。这些结果提示，已成功建立 了鼠tie-1启动子 驱动人清道夫受体AI在血管内皮细胞特异性表达的转基因鼠。外源基因能在子代鼠中稳定遗 传。转 基因鼠血管出现内膜水样变性及中膜粘液样变性等动脉粥样硬化的早期病理改变，表明人 清道夫受体AI转基因鼠可能易感动脉粥样硬化，成为新的动脉粥样硬化模型。
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[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0005-08
Genetics Stability and Expression Specificity of Human Scavenger Receptor -A I o n Endothelial Cells in Transgenic Mice
WU Meng-Jin WAN Zai-Yang WAN La-Xiang YANG Yong-Zong
(Researching Center of Molecular Biology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001, China)
Sookja Kim CHUNG Stephen S.M.CHUNG
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(Institute Of Molecular Biology, University of Hong Kong, Hon g Kong, China)
CAO De-Liang
(Department of Pharmacology, School of Medicine, New Haven, Con necticut 06510,USA)
CHEN Xiu
(Department of Pharmacology, Hunan Medical University, Changsha 410078, China)
ABSRACT Aim To establish a new transgenic mice model for determi ning the function and roles of human scavenger receptor A in atherosclerosis in vivo. Methods Human scavenger receptor A-I minige ne-driven tie-1 promoter was constr ucted by endonuclease digestion and confirmed by sequence analysis. Transgenic m ice were produced via microinjection method. PCR, Southern blot were used to s creen the positive transgenic mice. Transgenic mice line established by mating with C57BL/6 mice and offspring were identified by P CR so as to research transgenic mice transmission. Northern blot, RT-PCR, immun oh istochemical analysis, light and transmission electron microscopy were used to i nvestigate the expression location of human SR-A and lesions of arteries and vas cular endothelial cells in transgenic mice. Results The fragment sequence of mousetie-1 promoter and human SR-AI cDNA are similar to their sequences in Genebank and no ATG before the translation initia tion sites of human SR-A by sequence analysis. About 3.4 kb tie-1-promoter-hS R- AI-cDNA-BGH polyA fragment were obtained by AatⅡand XhoⅠdigests. 561 survival embryos injected with purified human SR-A minigene were implanted into the ovidu cts of 19 ICR pseudopregnant mice.Among the 54 survived pups from 13 foster m ot hers, 7 founders were identified with PCR and Southern blot analysis. Integrat io n rate of exogenous was 13%. PCR positive rates were 47.8%, 71.3%, 75.0% and 10 0% in G1, G2, G3 and homozygous transgenic mice, respectively. The results of RT -PCR and immunohistochemical analysis showed human SR-A I specifically expressed on endothelial cells of aorta, liver and renal artery of transgenic mice. Plasma tr iglyceride level of transgenic mice was significantly higher than the level of n on-transgenic mice (P<0.05 vs control). There was no differenc e in total plasm a cholesterol level between transgenic and non-transgenic mice. But in transge ni c mice, total plasma cholesterol level was significantly higher of males than of females (P<0.01). SEM of the luminal surface of aorta reveal ed an irregular, elevated bumpy and swelling surface. There was disruption of the endothelial la yer and some blood cell was observed adhering to the surface of them in transgen ic mice. TEM of aorta of transgenic mice showed that vesicles, multivesicle bo di es and swelling mitochondria filled in plasma of endothelial cells. Vacuolar a nd mucoid degeneration were observed in the media of aortic ardh sections in trans genic mice with HE staining. Conclusions A transgenic mice model with overexpressed human SR-A on ECs were s uccessfully established in this study. The transgene stable inherited across g en eration after generation. The high level of plasma lipid, hydropic and mucoid d eg eneration of arterial wall in transgenic mice may accelerate the development of atherosclerosis. Our studies provide a new transgenic model for investigation of the function and roles of SR-A in atherosclerosis.
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MeSH Receptor， Scavenger； Mice, Transgenic； Genetics； Ge ne Expression; Endothelium,Vascular； Atherosclerosis
清道夫受体A(scavenger receptor A,SR-A)是一类三聚体糖蛋白，其配体非常广泛，能结合和内化多种多聚阴离子化合物如修饰脂蛋白、马来酰牛血清白蛋白、多聚次黄苷酸、多糖、某些磷脂等生物大分子，可能参与机体的防御、细胞粘附和信号转导等多种生理及病理过程[1-3]。由于清道夫受体不受细胞内游离胆固醇的反馈调节，巨噬细胞能不断摄取修饰脂蛋白，致使胆固醇酯在细胞内聚集，形成泡沫细胞。研究发现，在人类动脉粥样硬化不同阶段的斑块中，尤其是早期斑块的巨噬细胞上SR-A活性增强[4]，提示SR-A在动脉粥样硬化(ath erosclerosis, As)斑块中泡沫细胞形成过程中可能起着重要作用。
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清道夫受体(SR-A)有Ⅰ和Ⅱ型两种异构体，二者由同一基因编码，但剪切方式不同。牛、鼠、兔、人的Ⅰ、Ⅱ型SR的cDNA序列已被克隆，两型SR-A的氨基酸序列及蛋白质结构均已基本查清[5]，两型之间的主要区别在于Ⅱ型缺乏富含半胱氨酸的Ⅵ区，而被6～17个C-末端氨基酸残基所取代，但二者有相似的配体结合活性。目前，对SR-A功能的了解多为体外研究结果，或源于对小鼠和牛SR-A的研究[6，7]，为了进一步探讨人SR-A在体内的功能及在AS斑块形成中的作用，本研究利用tie-1基因启动子的血管内皮细胞组织特异性，成功地建立了能在血管内皮细胞特异表达人SR-AI的转基因鼠，高表达人SR-AI的血管内皮细胞吞饮作用增强，形态结构也发生明显改变。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 AatⅡ、XhoⅠ、NruⅠ、ApaⅠ、AflⅡ、BglⅡ、SmaⅠ等限制性内切酶及1kb和100bp DNA标准分子质量等购自New England Biolabs Inc.; SDS 和Tri s碱购自Serva 公司；蛋白酶K、琼脂糖、dNTP、随机引物标记试剂盒、逆转录试剂盒等购自Promega公司；RNA抽提试剂盒购自Qiagene公司；测序试剂盒购自PE公司；α-32P-CTP购自北京亚辉生物医学工程公司。引物均由上海生工合成。抗人SR-A的单克隆抗体由日本T.Kodama教授制备并赠送.
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1.1.2 质粒 含有人SR-AcDNA全长的pXhSR1质粒由日本T.Kodama教授制备并赠送。含小鼠tie-1启动子DNA的pTie/Sma质粒由荷兰K.Alitalo教授构建、香港大学分子生物学研究所保存。
1.1.3 实验动物 F1(来源于C57BL/6×DBA)、ICR假孕母鼠由香港大学实验动物部提供，C57BL/6小鼠由香港大学实验动物部和协和医科大学实验动物繁育场提供。所有动物均喂饲常规颗粒饲料，自由饮水。超排卵F1与C57BL/6小鼠交配提供显微注射用受精卵。
1.2 Tie/hSR-AI表达载体的构建及鉴定
pTie/Sma质粒DNA分别用ApaⅠ、AflⅡ完全酶切，1.5%琼脂糖电泳及Geneclean sample Ⅱ试剂盒分离和纯化为788bp的鼠tie-1启动子片段。pXhSR1质粒DNA分别用NruⅠ和HindⅢ切去载体上的CMV启动子，再将鼠tie-1启动子连接到pXhSR1上，即用鼠tie-1启动子代替pXhSR1上的CMV启动子。
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将构建好的新载体转化DH5α宿主菌，涂抹于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，再挑选6个转化子扩增培养后提取质粒，分别用SmaⅠ和BglⅡ酶切鉴定。同时对鼠tie-1启动子、人SR-AIcDNA及二者间的序列通过自动测序仪测序，确定从鼠tie-1启动子至人SR-AIcDNA序列是否正确。
1.3 显微注射用人清道夫受体AI基因的制备
显微注射用的人SR-AI基因包括从鼠tie-1启动子、人SR-AcDNA及polyA信号序列(tie-1-hSR-AI-BGHpolyA)，约3.4kb长(图1，Figure1)。新构建的质粒用AtaⅡ和XhoⅠ联合酶切即可获得tie-1-hSR-AI-BGHpolyA片段，经电泳分离后按改良的琼脂糖凝胶电洗脱法纯化该片段，然后溶于0.1TE缓冲液中。通过紫外分光光度计及电泳两种方法测定DNA的浓度及质量，再稀释成5mg/L，每20μL一份，于-20℃保存，用于显微注射。
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图1. 人清道夫受体AⅠ的基因结构
Figure 1. The construct of the human SR-A minigene.
The sequence s and location of polymerase reaction (PCR)
primers S (upstream primer) and R (downstream prim er)
are indicated together with the sizes of the amplified fragments.
The regio n between the 3′ end of tie-1 promoter and 5′
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end of human SR-A cDNA was ident ified not to contain ATG
with sequencing analysis. Translation of human SR-A wa s initiated from its ATG.
1.4 转基因小鼠的制备
按文献[8]的方法将已纯化好的线状tie-1- hSR-AI-BGHpolyA显微注射到F1小鼠受精卵的雄原核中，挑选注射后仍然存活的受精卵，移植到ICR假孕母鼠的输卵管壶腹部，缝合伤口，待其孕娠，分娩，产下的仔鼠即为转基因小鼠G0代。经PCR和Southern blot筛选出的G0代阳性转基因鼠作为首建鼠(Founder)分别与C57BL/6小鼠交配产生的后代即为G1小鼠，G1与G1交配产生的后代为G2，……。每代子鼠用PCR进行整合检测。
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1.5 鼠尾组织基因组DNA的抽提
取4周龄转基因鼠尾2.0cm，用蛋白酶K消化后，加入1/4体积饱和氯化钠，混匀，12000g离心15min，转上清液至另一个1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，倒转混匀，即有DNA絮状物，钩取DNA絮状物至1mL75%乙醇中，洗两次，离心1min，去掉上清液，空气干燥沉淀，再加入200μLTE缓冲液，待DNA完全溶解后，用紫外分光光度计测DNA浓度，-20℃保存备用。
1.6 鼠尾组织DNA的PCR检测
根据小鼠tie-1启动子和人SR-AIcDNA序列分别设计PCR上、下游引物，扩增产物为350bpDNA。因此，只有tie-1-hSR-A-BGHpolyA片段完整整合时才能扩增出该PCR产物，仅有tie-1启动子或SR-AI均无扩增产物。同时用质粒DNA和正常C57BL/6鼠尾基因组DNA分别作阳性和阴性对照；用一对肌蛋白基因的特异性引物作内对照。PCR反应产物用2%琼脂糖电泳，全自动凝胶分析系统照相、分析。
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1.7 鼠尾组织DNA的Southern blot检测
分别取25μg小鼠基因组DNA用PstI酶切后电泳，再转膜固定，按文献[9]方法与α-32P-dCTP标记的探针杂交过夜，然后洗膜，-70℃放射自显影。
1.8 鼠组织RNA的逆转录聚合酶链反应检测
用断头法处死动物，分别取阳性转基因鼠及正常C57BL/6小鼠的小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织，按RNA试剂盒说明提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，并通过电泳确定组织RNA无降解后，用人SR-AI的特异性引物，以肌蛋白基因的特异性引物作内对照，按逆转录试剂盒说明书进行RT-PCR。RT-PCR扩增产物为447bpDNA片段。
1.9 鼠组织切片免疫组织化学染色
, 百拇医药 取阳性转基因鼠及正常C57BL/6小鼠的小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织分别作石蜡切片，利用ABC试剂盒提供的试剂按文献[10]做免疫组织化学染色，一抗为抗人SR-A特异性抗体，二抗为鼠抗人IgG。
1.10 鼠组织切片HE染色
分别取小鼠小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察这些组织有无病理改变，重点观察主动脉及各组织中血管。
1.11 鼠组织冰冻切片油红O染色
小鼠主动脉弓、肾、肝等组织的冰冻切片附贴于载玻片上，60%异丙醇浸30s～1min后，浸入油红O工作液10～15min；用60%异丙醇洗后，再以蒸馏水冲洗，苏木精染色3～5min，蒸馏水冲洗二次，然后10%聚乙烯吡咯酮封片。光学显微镜下，脂滴将染成桔黄色，胞核为蓝色。
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1.12 扫描电镜和透射电镜标本制备
取主动脉弓部组织分别按常规方法用于制备扫描电镜和透射电镜标本，观察血管内皮细胞超微结构及血管壁形态改变。
1.13 血浆总胆固醇和甘油三酯水平的测定
用消毒刀片割破小鼠尾静脉，让血自然流出，用肝素化试管收集约150μL全血，用酶法分别测定血浆胆固醇和甘油三酯浓度，具体步骤按试剂盒说明书操作，浓度均用mg/L表示。
1.14 统计学处理
实验数据以
±s表示,用SSPS统计软件包进行统计分析。
2 结果
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2.1 Tie/人清道夫受体A表达载体的构建
用小鼠tie-1启动子代替pXhSR1上的CMV启动子，构建好的新载体命名为Tie/hSR-A质粒。经酶切及测序鉴定，鼠tie-1启动子与人SR-AIcDNA序列正确，它们之间的载体序列中无ATG密码子，提示转基因不会从人SR-AIcDNA之前的任何部位开始翻译，而是利用其cDNA上的ATG位点开始翻译(图1,Figure1)。因此，不会引起人SR-A基因密码子的摆动，保证了人SR-A蛋白质翻译的准确性。用XhoⅠ和AatⅡ联合酶切Tie-1/hSR-AI质粒，收获3.4kb的电泳带，纯化后再电泳，显示为单一的3.4kb带，且无拖尾降解现象，表明纯化后的片段符合显微注射的要求。
2.2 转人清道夫受体A基因鼠(G0)的制备
共显微注射了872枚受精卵，注射后存活561枚，显微注射后受精卵的存活率为64%.将存活的受精卵分别移入19只假孕ICR母鼠的双侧输卵管中，每只约30枚，每侧15枚。结果共有13只母鼠受孕，受孕率为68.4%(13/19)，共产下56只仔鼠，胚胎存活率为10%(56/561)，出生后死亡2只，仔鼠存活率为96%。
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2.3 阳性鼠的筛选及鉴定
对G0小鼠尾组织DNA进行PCR扩增，在54只存活的G0小鼠中检出阳性鼠7只(图2,Figure2)，阳性整合率为13%(7/54)。并通过基因组Southernblot分析进一步得到证实。这7只阳性鼠即为首建鼠，其中5只为雄性,2只为雌性。
图2. 用PCR方法筛选转基因鼠
Figure 2. Screening transgenic mice by PCR.
Lane 1: 100 bp DNA ladder; lane 2-8: Transgenic mice of
F1 generation; lane 9-11 : No Transgenic mice in F1 generation;
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lane 12: Positive control with plasmid as template; lane 13: negative control (C57BL/6 mice).
对PCR阳性G1鼠的各种组织RNA进行RT-PCR，电泳结果显示(图3,Figure3)，5只雄性首建鼠的G1鼠的主动脉、肾、肝等组织均有447bp特异性扩增带，而小肠、脑、心脏等组织RNA未检出特异性扩增带。提示，人SR-AI能在小鼠主动脉组织或血管丰富的组织中表达。小鼠组织切片免疫组织化学结果发现，主动脉内皮表面有棕褐色弧线形或月伢状颗粒，内皮细胞脱落处不着色，其它部位未见阳性颗粒(图4,Figure4)。肾内血管也见到同样的改变。提示人SR-AI基因表达有血管内皮细胞特异性。
图3. 用RT-PCR方法检测人SR-AI基因在转基因小鼠组织中的表达
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Figure 3. Expression of human SR-A mRNA extracted from
tissues of mice by Reve rse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Lane 1: PCR marker (1 543 bp, 994 bp, 697 bp, 515 bp, 377 bp, 237 bp); lane 2,3:
Aorta and liver tissue of C57BL/6 mice lane 4-8:Tissue of brain, heart
,liver, kidney and aorta from transgenic mice, r espectively.
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图4. 转基因鼠主动脉免疫组织化学染色照片
Figure 4.Photomicrograph of immunohistochemical
staining of aorta in transgen ic mice using
monoclonal antibody to human SR-A. ×400
2.4 转基因鼠的繁殖与建系
5个雄性转基因鼠的繁殖较快，每窝3～8个鼠崽，目前已繁殖至第3或4代，各代小鼠均进行PCR筛选，G1、G2、G3的PCR阳性率分别为47.8%、71.3%和75.0%。纯合子鼠生长发育正常，其子代PCR阳性率为100%。提示，人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传。
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2.5 转基因鼠血管组织形态改变
光镜下，转基因鼠主动脉组织经HE染色后发现，血管壁三层结构完整，除主动脉瓣尖处内膜有增生外，其它处内膜无明显增厚，内皮细胞有脱落，保留下来的内皮细胞多为细胞核。中膜有空泡样变形，多呈灶性改变，病灶内弹力纤维断裂，HE染色呈淡兰色(图5,Figure5)，而油红O染色不着色，说明为粘液样变性。主动脉中膜平滑肌细胞及肾脏内血管中膜平滑肌细胞均有空泡样变形。而肝、小肠、心脏和脑等组织或其内血管均未发现明显的病理改变。
图5. 转基因鼠主动脉HE染色照片
Figure 5. Photomicrograph of aorta section
of transgenic mice with HE staining . ×400
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2.6 转基因鼠血管内皮细胞超微结构的改变
扫描电镜下，正常C57BL/6小鼠血管内皮细胞呈卵石样镶嵌排列，方向与血流方向一致，表面光滑(图6A,Figure6A)。而转基因鼠内皮细胞排列较乱，细胞核较扁平，细胞核间距离明显增宽，表明内皮细胞有明显肿胀增厚。其表面有许多囊状突起，也有许多虫蚀样改变，似为囊状物破裂后留下的破口或袋状改变(图6B,Figure6B),内皮细胞表面有较多 血细胞粘附，包括变形的红细胞及单核细胞、淋巴细胞等。
图6. 扫描电镜下小鼠主动脉内皮.
A.C57BL/6小鼠， B.转基因小鼠.
Figure 6. Photography of luminal surface
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of aorta of mice under SEM.
A.C57BL/6J mice ×1500， B. transgenic mice ×1000
透射电镜下，C57BL/6小鼠血管内皮形态正常(图7A，Figure7A)。而转基因鼠内皮细胞体积增大，内有多个透亮的水泡，水泡破裂处留下不完整的胞膜，胞质中线粒体肿胀，细胞核被挤向一侧，染色质边聚。中膜平滑肌细胞中亦可见小而圆的空泡样改变(图7B,Figure7B)。
图7. 小鼠主动脉内皮细胞超微结构
A.C57BL/6小鼠，B.转基因小鼠
Figure 7. Ultrastructure of aortic endothelial
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cell from mice under TEM.
A. normal C57BL/6 mice ×4000， B. transgenic mouse ×8000
2.7 转基因鼠血浆总胆固醇及甘油三酯水平的变化
喂正常颗粒饲料下，与C57BL/6小鼠相比，转基因鼠血浆总胆固醇浓度差异无显著性，而甘油三酯浓度明显高于C57BL/6小鼠(P<0.05)。转基因鼠系中雄性鼠总胆固醇浓度明显高于雌性(P<0.01),而甘油三酯浓度的差异无显著性(表1,Table1)。C57BL/6小鼠甘油三酯及胆固醇水平改变亦无性别差异。
表1. 小鼠血浆总胆固醇和甘油三酯浓度 (mg/L)
Table 1. Concentration of plasma total cholesterol and triglyceride Mouseline
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n
TC
TG
C57 M
8
770±150c
550±190c
F
5
760±90
600±130
Total
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770±130
570±170
TglineM
17
810±150de
740±200
F
14
670±150e
810±190
Total
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31
750±160a
770±230b
C57:C57BL/6 mice; Tg line: transgenic mice line Plasma lipid levels in C57BL/6 and heterozygous transgenic human SR-AI mice unde r regular chow. Data represent mean ± SD. Plasma lipid levels of transgenic mic e were compared to them of C57BL/6 a: P>0.05, b:P<0.05. Males were compared to fem ale of C57BL/6 and transgenic mice, c:P>0.05， d：P<0.01, respectively. Mal es of transgenic mice were compared males of C57BL/6, female of transgenic mice to females of C57BL/6, e: P>0.05, f: P<0.05.
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3 讨论
3.1 转基因小鼠的整合效率及遗传稳定性
显微注射是目前最常用的制备转基因动物的方法，注射的DNA片段可以是环状也可以是线状，一般线状DNA比环状DNA整合效率高[11，12]，本实验中亦用线状DNA进行显微注射。实验中共注射872枚受精卵，移植到19只ICR假孕母鼠，有13只受孕，共产生56只仔鼠，经检测有7只已整合有人SR-AI转基因，整合效率为13%，仍偏低。
转基因的整合是随机的，由于生物体在长期进化过程中形成的本身独特的体系，具有一定的排它性，在遗传过程中基因组有可能丢失一部分，所以基因整合效率可能不稳定。在转基因鼠的筛选和鉴定中，我们设计了分别与鼠tie-1启动子和人SR-AIcDNA序列相对应的一对特异性引物，只有tie-1启动子和人SR-AIcDNA完整整合在一起时才有PCR扩增产物，否则，将不被扩增。实验证实，PCR结果与Southernblot分析结果完全吻合。因此，PCR阳性鼠即表示tie-1启动子与人SR-AIcDNA完整整合在其基因组DNA中，在转基因鼠的传代中，用PCR方法即能确定外源人SR-A基因是否完整有效地传给了子代鼠，从而简化了后续的筛选工作。从本研究结果看，G1、G2、G3小鼠PCR阳性率分别为47.8%、71.3%和75%，纯合子小鼠则能100%的将外源基因传给子代，提示：(1)外源基因经显微注射导入受精卵后，可以整合到染色体上，并且可以经有性生殖遗传给后代；(2)第二代到第三代的阳性率仍为70%以上，外源人SR-A基因可能“永久”地在转基因小鼠中保留，并能稳定地遗传。
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3.2 外源基因在转基因小鼠内皮细胞上表达的特异性
所用外源基因一般由两个区域构成，即启动/调节区和蛋白质编码区，启动子的组织特异性将决定转基因的表达特异性。Tie-1基因编码一种内皮细胞酪氨酸激酶受体，该受体在内皮细胞的正常生长发育中起着重要的作用[13，14]。Korhonen等[13]用连接于tie-1基因启动子的LacZ报告基因进行的转基因研究结果表明，在成年小鼠，tie-1启动子的活性主要在冠状动脉、瓣膜、主动脉内皮细胞及肺和肾脏的血管内皮细胞上，而在脑和肝组织中活性很低，提示tie-1启动子具有血管内皮细胞表达特异性。本研究首次将人SR-AIcDNA与小鼠tie-1启动子组成的融合基因用于制备转基因鼠，RT-PCR结果显示，人SR-AI基因能在小鼠主动脉及肝、肾等组织中表达，而在脑、小肠、心脏等组织中不表达。进一步通过免疫组织化学检测证实，人SR-AI的表达主要集中在大血管的内皮细胞上，与tie-1启动子的活性基本一致，表明鼠tie-1启动子驱动人SR-AI基因在血管内皮细胞上特异性表达。
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3.3 外源基因对转基因鼠血管内皮细胞的影响
清道夫受体(SR)-A主要存在于不同组织和器官的巨噬细胞上，尤其是枯否细胞和脾淋巴结的巨噬细胞，肝窦内皮细胞、成纤维细胞和AS斑块内平滑肌细胞亦有表达[15，16]。研究表明原代培养的兔静脉和牛主动脉内皮细胞无SR-A受体mRNA表达，用佛波酯诱导亦不能增加SR-A的表达和乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)的摄入，表明血管内皮细胞缺乏SR-A活性[17]。内皮细胞是血管壁组织和血液之间的屏障，直接与血液脂蛋白接触，对脂蛋白在血管壁中的转运、修饰及代谢起着关键性作用。因此，改变血管内皮细胞的SR-A活性，观察脂代谢和血管壁功能与结构的变化，可能有利于了解人SR-AI功能。
正常血管内皮细胞通过内吞、透胞作用或细胞表面特异性受体摄取血液中的脂蛋白等大分子物质。内皮细胞通透性增高时，血液成分特别是血浆蛋白等大分子物质经内皮运输即可增加[18，19]，若超过了生理限度，这些物质就可能在血管壁、组织间隙堆积，促进动脉硬化形成。光镜及电镜观察到，转人SR-AI基因鼠主动脉内膜明显肿胀，内皮细胞胞质中出现许多吞饮小泡，提示内皮细胞高表达人SR-AI导致内皮细胞吞饮作用增强，吞饮许多阴离子化合物包括血浆脂蛋白和糖蛋白等，并转运到内膜下，导致中膜弹性纤维的破坏及粘液样变性和平滑肌细胞的损害。内皮表面的囊状或虫蚀样改变可能与内皮细胞过多摄取，致吞饮小泡破裂有关。在喂饲正常颗粒饲料的情况下，转人SR-AI基因鼠血管壁未见典型的动脉粥样硬化斑块形成，可能因血液中修饰脂蛋白的含量较低有关。但血管壁的这些病理改变与人类As的早期病理改变极为相似[20]。当血脂浓度增高时，内皮细胞高表达人SR-AI可能有利于As的形成。
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在喂正常颗粒饲料情况下，转人SR-AI基因鼠的血脂有较大的改变，与正常C57BL/6小鼠相比，其甘油三酯水平明显升高，而血清总胆固醇变化不明显；但在转基因鼠系内，血清总胆固醇水平高低与性别有关，雄性鼠胆固醇水平明显高于雌性，也高于C57BL/6小鼠，而甘油三酯的变化却无性别差异；同时发现雄性转基因鼠内皮细胞的损害及血管壁病变也较雌性鼠严重。转hSR-AI小鼠这些代谢变化机理不清，可能与人SR-AI对脂蛋白的识别和吞噬与血脂成分不同有关。转人SR-AI基因鼠血脂的性别差异也可能为我们研究激素与As的关系提供很好的动物模型，因为人As发病时间及病变程度与性别差异密切相关，有证据表明，男性的血脂通常高于绝经期前同年龄组的女性[21]。
SR-A的配体非常广泛，除了能结合和内化多种多聚阴离子化合物，同时也能识别和介导吞噬体内受损害的蛋白质、细胞以及炎症或组织损伤部位的细胞碎片，清除体内异物。本研究建立的人SR-AI转基因鼠将有助于人类SR-A在体内的功能和与As关系的研究。
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致谢 该转基因小鼠是研究者在香港大学分子生物学研究所学习期间完成的，在此，作者特别感谢该所各位老师和同事给予的指导和帮助。
(此文编辑 胡必利)
[基金项目] 国家自然科学资金资助项目(项目编号39900061)
[作者简介] 万腊香，女，1964年出生，湖南省慈利县人，在读博士生。杨永宗，男，1937年11月出生，福建仙游县人，病理生理学教授，博士研究生导师。陈 修，男，1928年出生，药理学教授，博士研究生导师。
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(此文1999-12-24收到， 2000-03-10修回), http://www.100md.com
单位：吴孟津(衡阳医学院分子生物学研究中心， 湖南省衡阳市 421001)；万载阳(衡阳医学院分子生物学研究中心， 湖南省衡阳市 421001)；陈修(湖南医科大学药理学教研室，湖南省长沙市 410078)
关键词：人清道夫受体AI；小鼠， 转基因；遗传；基因表达；内皮，血管；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000103[摘 要] 为阐明人清道夫受体AI (hSR-AI)的功能及在动脉粥样硬化发生中的作用,本研究首 先构建了含鼠 tie-1启动子和人清道夫受体AI cDNA的表达载体，经酶切及测序鉴定后，用 显微注射 的方法将制备好的tie-1-hSR-A-BGH poly A片段注入受精卵，将注射后存活的受精卵移入IC R假孕母鼠，产下的仔鼠经聚合酶链反应和Southern blot分析，筛选出整合有外源目的基 因的阳性转 基因鼠；对小鼠组织RNA行逆转录聚合酶链反应及组织切片免疫组织化学染色，检测人清道 夫受体AI在小鼠体内的表 达水平及表达部位；光镜及电镜观察转基因鼠血管及其它组织的病理变化。结果发现， 重 组Tie-1/hSR-AI质粒中鼠tie-1启动子和人清道夫受体AI cDNA序列正确，显微注射后存活的 561枚受 精卵分别移入19只ICR假孕母鼠，有13只受孕，共产下56只仔鼠，存活54只，经过整合检测 ，检出7只阳性鼠，整合效率为13%。在G1、 G2、 G3 代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别 为47.8%、 71.3%、 75.0% 和 100%。5只雄性转基因鼠的主动脉、肾、肝等组织中均有人清 道夫受体 AI表达，且主要集中在血管的内皮细胞上；转基因鼠主动脉内皮细胞明显水肿，表面呈多囊 状和虫蚀样改变，胞质中有较多水泡，中膜有糖原沉积样灶性病变，平滑肌细胞中亦有水肿 ；血浆甘油三酯水平明显高于非C57BL/6鼠(P<0.05)，总胆固醇水平虽 不比C57BL/6高，但雄 性鼠总胆固醇水平明显高于雌性(P<0.01)。这些结果提示，已成功建立 了鼠tie-1启动子 驱动人清道夫受体AI在血管内皮细胞特异性表达的转基因鼠。外源基因能在子代鼠中稳定遗 传。转 基因鼠血管出现内膜水样变性及中膜粘液样变性等动脉粥样硬化的早期病理改变，表明人 清道夫受体AI转基因鼠可能易感动脉粥样硬化，成为新的动脉粥样硬化模型。
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[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0005-08
Genetics Stability and Expression Specificity of Human Scavenger Receptor -A I o n Endothelial Cells in Transgenic Mice
WU Meng-Jin WAN Zai-Yang WAN La-Xiang YANG Yong-Zong
(Researching Center of Molecular Biology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001, China)
Sookja Kim CHUNG Stephen S.M.CHUNG
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(Institute Of Molecular Biology, University of Hong Kong, Hon g Kong, China)
CAO De-Liang
(Department of Pharmacology, School of Medicine, New Haven, Con necticut 06510,USA)
CHEN Xiu
(Department of Pharmacology, Hunan Medical University, Changsha 410078, China)
ABSRACT Aim To establish a new transgenic mice model for determi ning the function and roles of human scavenger receptor A in atherosclerosis in vivo. Methods Human scavenger receptor A-I minige ne-driven tie-1 promoter was constr ucted by endonuclease digestion and confirmed by sequence analysis. Transgenic m ice were produced via microinjection method. PCR, Southern blot were used to s creen the positive transgenic mice. Transgenic mice line established by mating with C57BL/6 mice and offspring were identified by P CR so as to research transgenic mice transmission. Northern blot, RT-PCR, immun oh istochemical analysis, light and transmission electron microscopy were used to i nvestigate the expression location of human SR-A and lesions of arteries and vas cular endothelial cells in transgenic mice. Results The fragment sequence of mousetie-1 promoter and human SR-AI cDNA are similar to their sequences in Genebank and no ATG before the translation initia tion sites of human SR-A by sequence analysis. About 3.4 kb tie-1-promoter-hS R- AI-cDNA-BGH polyA fragment were obtained by AatⅡand XhoⅠdigests. 561 survival embryos injected with purified human SR-A minigene were implanted into the ovidu cts of 19 ICR pseudopregnant mice.Among the 54 survived pups from 13 foster m ot hers, 7 founders were identified with PCR and Southern blot analysis. Integrat io n rate of exogenous was 13%. PCR positive rates were 47.8%, 71.3%, 75.0% and 10 0% in G1, G2, G3 and homozygous transgenic mice, respectively. The results of RT -PCR and immunohistochemical analysis showed human SR-A I specifically expressed on endothelial cells of aorta, liver and renal artery of transgenic mice. Plasma tr iglyceride level of transgenic mice was significantly higher than the level of n on-transgenic mice (P<0.05 vs control). There was no differenc e in total plasm a cholesterol level between transgenic and non-transgenic mice. But in transge ni c mice, total plasma cholesterol level was significantly higher of males than of females (P<0.01). SEM of the luminal surface of aorta reveal ed an irregular, elevated bumpy and swelling surface. There was disruption of the endothelial la yer and some blood cell was observed adhering to the surface of them in transgen ic mice. TEM of aorta of transgenic mice showed that vesicles, multivesicle bo di es and swelling mitochondria filled in plasma of endothelial cells. Vacuolar a nd mucoid degeneration were observed in the media of aortic ardh sections in trans genic mice with HE staining. Conclusions A transgenic mice model with overexpressed human SR-A on ECs were s uccessfully established in this study. The transgene stable inherited across g en eration after generation. The high level of plasma lipid, hydropic and mucoid d eg eneration of arterial wall in transgenic mice may accelerate the development of atherosclerosis. Our studies provide a new transgenic model for investigation of the function and roles of SR-A in atherosclerosis.
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MeSH Receptor， Scavenger； Mice, Transgenic； Genetics； Ge ne Expression; Endothelium,Vascular； Atherosclerosis
清道夫受体A(scavenger receptor A,SR-A)是一类三聚体糖蛋白，其配体非常广泛，能结合和内化多种多聚阴离子化合物如修饰脂蛋白、马来酰牛血清白蛋白、多聚次黄苷酸、多糖、某些磷脂等生物大分子，可能参与机体的防御、细胞粘附和信号转导等多种生理及病理过程[1-3]。由于清道夫受体不受细胞内游离胆固醇的反馈调节，巨噬细胞能不断摄取修饰脂蛋白，致使胆固醇酯在细胞内聚集，形成泡沫细胞。研究发现，在人类动脉粥样硬化不同阶段的斑块中，尤其是早期斑块的巨噬细胞上SR-A活性增强[4]，提示SR-A在动脉粥样硬化(ath erosclerosis, As)斑块中泡沫细胞形成过程中可能起着重要作用。
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清道夫受体(SR-A)有Ⅰ和Ⅱ型两种异构体，二者由同一基因编码，但剪切方式不同。牛、鼠、兔、人的Ⅰ、Ⅱ型SR的cDNA序列已被克隆，两型SR-A的氨基酸序列及蛋白质结构均已基本查清[5]，两型之间的主要区别在于Ⅱ型缺乏富含半胱氨酸的Ⅵ区，而被6～17个C-末端氨基酸残基所取代，但二者有相似的配体结合活性。目前，对SR-A功能的了解多为体外研究结果，或源于对小鼠和牛SR-A的研究[6，7]，为了进一步探讨人SR-A在体内的功能及在AS斑块形成中的作用，本研究利用tie-1基因启动子的血管内皮细胞组织特异性，成功地建立了能在血管内皮细胞特异表达人SR-AI的转基因鼠，高表达人SR-AI的血管内皮细胞吞饮作用增强，形态结构也发生明显改变。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 AatⅡ、XhoⅠ、NruⅠ、ApaⅠ、AflⅡ、BglⅡ、SmaⅠ等限制性内切酶及1kb和100bp DNA标准分子质量等购自New England Biolabs Inc.; SDS 和Tri s碱购自Serva 公司；蛋白酶K、琼脂糖、dNTP、随机引物标记试剂盒、逆转录试剂盒等购自Promega公司；RNA抽提试剂盒购自Qiagene公司；测序试剂盒购自PE公司；α-32P-CTP购自北京亚辉生物医学工程公司。引物均由上海生工合成。抗人SR-A的单克隆抗体由日本T.Kodama教授制备并赠送.
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1.1.2 质粒 含有人SR-AcDNA全长的pXhSR1质粒由日本T.Kodama教授制备并赠送。含小鼠tie-1启动子DNA的pTie/Sma质粒由荷兰K.Alitalo教授构建、香港大学分子生物学研究所保存。
1.1.3 实验动物 F1(来源于C57BL/6×DBA)、ICR假孕母鼠由香港大学实验动物部提供，C57BL/6小鼠由香港大学实验动物部和协和医科大学实验动物繁育场提供。所有动物均喂饲常规颗粒饲料，自由饮水。超排卵F1与C57BL/6小鼠交配提供显微注射用受精卵。
1.2 Tie/hSR-AI表达载体的构建及鉴定
pTie/Sma质粒DNA分别用ApaⅠ、AflⅡ完全酶切，1.5%琼脂糖电泳及Geneclean sample Ⅱ试剂盒分离和纯化为788bp的鼠tie-1启动子片段。pXhSR1质粒DNA分别用NruⅠ和HindⅢ切去载体上的CMV启动子，再将鼠tie-1启动子连接到pXhSR1上，即用鼠tie-1启动子代替pXhSR1上的CMV启动子。
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将构建好的新载体转化DH5α宿主菌，涂抹于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，再挑选6个转化子扩增培养后提取质粒，分别用SmaⅠ和BglⅡ酶切鉴定。同时对鼠tie-1启动子、人SR-AIcDNA及二者间的序列通过自动测序仪测序，确定从鼠tie-1启动子至人SR-AIcDNA序列是否正确。
1.3 显微注射用人清道夫受体AI基因的制备
显微注射用的人SR-AI基因包括从鼠tie-1启动子、人SR-AcDNA及polyA信号序列(tie-1-hSR-AI-BGHpolyA)，约3.4kb长(图1，Figure1)。新构建的质粒用AtaⅡ和XhoⅠ联合酶切即可获得tie-1-hSR-AI-BGHpolyA片段，经电泳分离后按改良的琼脂糖凝胶电洗脱法纯化该片段，然后溶于0.1TE缓冲液中。通过紫外分光光度计及电泳两种方法测定DNA的浓度及质量，再稀释成5mg/L，每20μL一份，于-20℃保存，用于显微注射。
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图1. 人清道夫受体AⅠ的基因结构
Figure 1. The construct of the human SR-A minigene.
The sequence s and location of polymerase reaction (PCR)
primers S (upstream primer) and R (downstream prim er)
are indicated together with the sizes of the amplified fragments.
The regio n between the 3′ end of tie-1 promoter and 5′
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end of human SR-A cDNA was ident ified not to contain ATG
with sequencing analysis. Translation of human SR-A wa s initiated from its ATG.
1.4 转基因小鼠的制备
按文献[8]的方法将已纯化好的线状tie-1- hSR-AI-BGHpolyA显微注射到F1小鼠受精卵的雄原核中，挑选注射后仍然存活的受精卵，移植到ICR假孕母鼠的输卵管壶腹部，缝合伤口，待其孕娠，分娩，产下的仔鼠即为转基因小鼠G0代。经PCR和Southern blot筛选出的G0代阳性转基因鼠作为首建鼠(Founder)分别与C57BL/6小鼠交配产生的后代即为G1小鼠，G1与G1交配产生的后代为G2，……。每代子鼠用PCR进行整合检测。
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1.5 鼠尾组织基因组DNA的抽提
取4周龄转基因鼠尾2.0cm，用蛋白酶K消化后，加入1/4体积饱和氯化钠，混匀，12000g离心15min，转上清液至另一个1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，倒转混匀，即有DNA絮状物，钩取DNA絮状物至1mL75%乙醇中，洗两次，离心1min，去掉上清液，空气干燥沉淀，再加入200μLTE缓冲液，待DNA完全溶解后，用紫外分光光度计测DNA浓度，-20℃保存备用。
1.6 鼠尾组织DNA的PCR检测
根据小鼠tie-1启动子和人SR-AIcDNA序列分别设计PCR上、下游引物，扩增产物为350bpDNA。因此，只有tie-1-hSR-A-BGHpolyA片段完整整合时才能扩增出该PCR产物，仅有tie-1启动子或SR-AI均无扩增产物。同时用质粒DNA和正常C57BL/6鼠尾基因组DNA分别作阳性和阴性对照；用一对肌蛋白基因的特异性引物作内对照。PCR反应产物用2%琼脂糖电泳，全自动凝胶分析系统照相、分析。
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1.7 鼠尾组织DNA的Southern blot检测
分别取25μg小鼠基因组DNA用PstI酶切后电泳，再转膜固定，按文献[9]方法与α-32P-dCTP标记的探针杂交过夜，然后洗膜，-70℃放射自显影。
1.8 鼠组织RNA的逆转录聚合酶链反应检测
用断头法处死动物，分别取阳性转基因鼠及正常C57BL/6小鼠的小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织，按RNA试剂盒说明提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，并通过电泳确定组织RNA无降解后，用人SR-AI的特异性引物，以肌蛋白基因的特异性引物作内对照，按逆转录试剂盒说明书进行RT-PCR。RT-PCR扩增产物为447bpDNA片段。
1.9 鼠组织切片免疫组织化学染色
, 百拇医药 取阳性转基因鼠及正常C57BL/6小鼠的小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织分别作石蜡切片，利用ABC试剂盒提供的试剂按文献[10]做免疫组织化学染色，一抗为抗人SR-A特异性抗体，二抗为鼠抗人IgG。
1.10 鼠组织切片HE染色
分别取小鼠小肠、肝脏、肾、主动脉、心脏和脑等组织，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察这些组织有无病理改变，重点观察主动脉及各组织中血管。
1.11 鼠组织冰冻切片油红O染色
小鼠主动脉弓、肾、肝等组织的冰冻切片附贴于载玻片上，60%异丙醇浸30s～1min后，浸入油红O工作液10～15min；用60%异丙醇洗后，再以蒸馏水冲洗，苏木精染色3～5min，蒸馏水冲洗二次，然后10%聚乙烯吡咯酮封片。光学显微镜下，脂滴将染成桔黄色，胞核为蓝色。
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1.12 扫描电镜和透射电镜标本制备
取主动脉弓部组织分别按常规方法用于制备扫描电镜和透射电镜标本，观察血管内皮细胞超微结构及血管壁形态改变。
1.13 血浆总胆固醇和甘油三酯水平的测定
用消毒刀片割破小鼠尾静脉，让血自然流出，用肝素化试管收集约150μL全血，用酶法分别测定血浆胆固醇和甘油三酯浓度，具体步骤按试剂盒说明书操作，浓度均用mg/L表示。
1.14 统计学处理
实验数据以
±s表示,用SSPS统计软件包进行统计分析。2 结果
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2.1 Tie/人清道夫受体A表达载体的构建
用小鼠tie-1启动子代替pXhSR1上的CMV启动子，构建好的新载体命名为Tie/hSR-A质粒。经酶切及测序鉴定，鼠tie-1启动子与人SR-AIcDNA序列正确，它们之间的载体序列中无ATG密码子，提示转基因不会从人SR-AIcDNA之前的任何部位开始翻译，而是利用其cDNA上的ATG位点开始翻译(图1,Figure1)。因此，不会引起人SR-A基因密码子的摆动，保证了人SR-A蛋白质翻译的准确性。用XhoⅠ和AatⅡ联合酶切Tie-1/hSR-AI质粒，收获3.4kb的电泳带，纯化后再电泳，显示为单一的3.4kb带，且无拖尾降解现象，表明纯化后的片段符合显微注射的要求。
2.2 转人清道夫受体A基因鼠(G0)的制备
共显微注射了872枚受精卵，注射后存活561枚，显微注射后受精卵的存活率为64%.将存活的受精卵分别移入19只假孕ICR母鼠的双侧输卵管中，每只约30枚，每侧15枚。结果共有13只母鼠受孕，受孕率为68.4%(13/19)，共产下56只仔鼠，胚胎存活率为10%(56/561)，出生后死亡2只，仔鼠存活率为96%。
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2.3 阳性鼠的筛选及鉴定
对G0小鼠尾组织DNA进行PCR扩增，在54只存活的G0小鼠中检出阳性鼠7只(图2,Figure2)，阳性整合率为13%(7/54)。并通过基因组Southernblot分析进一步得到证实。这7只阳性鼠即为首建鼠，其中5只为雄性,2只为雌性。
图2. 用PCR方法筛选转基因鼠
Figure 2. Screening transgenic mice by PCR.
Lane 1: 100 bp DNA ladder; lane 2-8: Transgenic mice of
F1 generation; lane 9-11 : No Transgenic mice in F1 generation;
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lane 12: Positive control with plasmid as template; lane 13: negative control (C57BL/6 mice).
对PCR阳性G1鼠的各种组织RNA进行RT-PCR，电泳结果显示(图3,Figure3)，5只雄性首建鼠的G1鼠的主动脉、肾、肝等组织均有447bp特异性扩增带，而小肠、脑、心脏等组织RNA未检出特异性扩增带。提示，人SR-AI能在小鼠主动脉组织或血管丰富的组织中表达。小鼠组织切片免疫组织化学结果发现，主动脉内皮表面有棕褐色弧线形或月伢状颗粒，内皮细胞脱落处不着色，其它部位未见阳性颗粒(图4,Figure4)。肾内血管也见到同样的改变。提示人SR-AI基因表达有血管内皮细胞特异性。
图3. 用RT-PCR方法检测人SR-AI基因在转基因小鼠组织中的表达
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Figure 3. Expression of human SR-A mRNA extracted from
tissues of mice by Reve rse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Lane 1: PCR marker (1 543 bp, 994 bp, 697 bp, 515 bp, 377 bp, 237 bp); lane 2,3:
Aorta and liver tissue of C57BL/6 mice lane 4-8:Tissue of brain, heart
,liver, kidney and aorta from transgenic mice, r espectively.
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图4. 转基因鼠主动脉免疫组织化学染色照片
Figure 4.Photomicrograph of immunohistochemical
staining of aorta in transgen ic mice using
monoclonal antibody to human SR-A. ×400
2.4 转基因鼠的繁殖与建系
5个雄性转基因鼠的繁殖较快，每窝3～8个鼠崽，目前已繁殖至第3或4代，各代小鼠均进行PCR筛选，G1、G2、G3的PCR阳性率分别为47.8%、71.3%和75.0%。纯合子鼠生长发育正常，其子代PCR阳性率为100%。提示，人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传。
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2.5 转基因鼠血管组织形态改变
光镜下，转基因鼠主动脉组织经HE染色后发现，血管壁三层结构完整，除主动脉瓣尖处内膜有增生外，其它处内膜无明显增厚，内皮细胞有脱落，保留下来的内皮细胞多为细胞核。中膜有空泡样变形，多呈灶性改变，病灶内弹力纤维断裂，HE染色呈淡兰色(图5,Figure5)，而油红O染色不着色，说明为粘液样变性。主动脉中膜平滑肌细胞及肾脏内血管中膜平滑肌细胞均有空泡样变形。而肝、小肠、心脏和脑等组织或其内血管均未发现明显的病理改变。
图5. 转基因鼠主动脉HE染色照片
Figure 5. Photomicrograph of aorta section
of transgenic mice with HE staining . ×400
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2.6 转基因鼠血管内皮细胞超微结构的改变
扫描电镜下，正常C57BL/6小鼠血管内皮细胞呈卵石样镶嵌排列，方向与血流方向一致，表面光滑(图6A,Figure6A)。而转基因鼠内皮细胞排列较乱，细胞核较扁平，细胞核间距离明显增宽，表明内皮细胞有明显肿胀增厚。其表面有许多囊状突起，也有许多虫蚀样改变，似为囊状物破裂后留下的破口或袋状改变(图6B,Figure6B),内皮细胞表面有较多 血细胞粘附，包括变形的红细胞及单核细胞、淋巴细胞等。
图6. 扫描电镜下小鼠主动脉内皮.
A.C57BL/6小鼠， B.转基因小鼠.
Figure 6. Photography of luminal surface
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of aorta of mice under SEM.
A.C57BL/6J mice ×1500， B. transgenic mice ×1000
透射电镜下，C57BL/6小鼠血管内皮形态正常(图7A，Figure7A)。而转基因鼠内皮细胞体积增大，内有多个透亮的水泡，水泡破裂处留下不完整的胞膜，胞质中线粒体肿胀，细胞核被挤向一侧，染色质边聚。中膜平滑肌细胞中亦可见小而圆的空泡样改变(图7B,Figure7B)。
图7. 小鼠主动脉内皮细胞超微结构
A.C57BL/6小鼠，B.转基因小鼠
Figure 7. Ultrastructure of aortic endothelial
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cell from mice under TEM.
A. normal C57BL/6 mice ×4000， B. transgenic mouse ×8000
2.7 转基因鼠血浆总胆固醇及甘油三酯水平的变化
喂正常颗粒饲料下，与C57BL/6小鼠相比，转基因鼠血浆总胆固醇浓度差异无显著性，而甘油三酯浓度明显高于C57BL/6小鼠(P<0.05)。转基因鼠系中雄性鼠总胆固醇浓度明显高于雌性(P<0.01),而甘油三酯浓度的差异无显著性(表1,Table1)。C57BL/6小鼠甘油三酯及胆固醇水平改变亦无性别差异。
表1. 小鼠血浆总胆固醇和甘油三酯浓度 (mg/L)
Table 1. Concentration of plasma total cholesterol and triglyceride Mouseline
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n
TC
TG
C57 M
8
770±150c
550±190c
F
5
760±90
600±130
Total
, http://www.100md.com 13
770±130
570±170
TglineM
17
810±150de
740±200
F
14
670±150e
810±190
Total
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31
750±160a
770±230b
C57:C57BL/6 mice; Tg line: transgenic mice line Plasma lipid levels in C57BL/6 and heterozygous transgenic human SR-AI mice unde r regular chow. Data represent mean ± SD. Plasma lipid levels of transgenic mic e were compared to them of C57BL/6 a: P>0.05, b:P<0.05. Males were compared to fem ale of C57BL/6 and transgenic mice, c:P>0.05， d：P<0.01, respectively. Mal es of transgenic mice were compared males of C57BL/6, female of transgenic mice to females of C57BL/6, e: P>0.05, f: P<0.05.
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3 讨论
3.1 转基因小鼠的整合效率及遗传稳定性
显微注射是目前最常用的制备转基因动物的方法，注射的DNA片段可以是环状也可以是线状，一般线状DNA比环状DNA整合效率高[11，12]，本实验中亦用线状DNA进行显微注射。实验中共注射872枚受精卵，移植到19只ICR假孕母鼠，有13只受孕，共产生56只仔鼠，经检测有7只已整合有人SR-AI转基因，整合效率为13%，仍偏低。
转基因的整合是随机的，由于生物体在长期进化过程中形成的本身独特的体系，具有一定的排它性，在遗传过程中基因组有可能丢失一部分，所以基因整合效率可能不稳定。在转基因鼠的筛选和鉴定中，我们设计了分别与鼠tie-1启动子和人SR-AIcDNA序列相对应的一对特异性引物，只有tie-1启动子和人SR-AIcDNA完整整合在一起时才有PCR扩增产物，否则，将不被扩增。实验证实，PCR结果与Southernblot分析结果完全吻合。因此，PCR阳性鼠即表示tie-1启动子与人SR-AIcDNA完整整合在其基因组DNA中，在转基因鼠的传代中，用PCR方法即能确定外源人SR-A基因是否完整有效地传给了子代鼠，从而简化了后续的筛选工作。从本研究结果看，G1、G2、G3小鼠PCR阳性率分别为47.8%、71.3%和75%，纯合子小鼠则能100%的将外源基因传给子代，提示：(1)外源基因经显微注射导入受精卵后，可以整合到染色体上，并且可以经有性生殖遗传给后代；(2)第二代到第三代的阳性率仍为70%以上，外源人SR-A基因可能“永久”地在转基因小鼠中保留，并能稳定地遗传。
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3.2 外源基因在转基因小鼠内皮细胞上表达的特异性
所用外源基因一般由两个区域构成，即启动/调节区和蛋白质编码区，启动子的组织特异性将决定转基因的表达特异性。Tie-1基因编码一种内皮细胞酪氨酸激酶受体，该受体在内皮细胞的正常生长发育中起着重要的作用[13，14]。Korhonen等[13]用连接于tie-1基因启动子的LacZ报告基因进行的转基因研究结果表明，在成年小鼠，tie-1启动子的活性主要在冠状动脉、瓣膜、主动脉内皮细胞及肺和肾脏的血管内皮细胞上，而在脑和肝组织中活性很低，提示tie-1启动子具有血管内皮细胞表达特异性。本研究首次将人SR-AIcDNA与小鼠tie-1启动子组成的融合基因用于制备转基因鼠，RT-PCR结果显示，人SR-AI基因能在小鼠主动脉及肝、肾等组织中表达，而在脑、小肠、心脏等组织中不表达。进一步通过免疫组织化学检测证实，人SR-AI的表达主要集中在大血管的内皮细胞上，与tie-1启动子的活性基本一致，表明鼠tie-1启动子驱动人SR-AI基因在血管内皮细胞上特异性表达。
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3.3 外源基因对转基因鼠血管内皮细胞的影响
清道夫受体(SR)-A主要存在于不同组织和器官的巨噬细胞上，尤其是枯否细胞和脾淋巴结的巨噬细胞，肝窦内皮细胞、成纤维细胞和AS斑块内平滑肌细胞亦有表达[15，16]。研究表明原代培养的兔静脉和牛主动脉内皮细胞无SR-A受体mRNA表达，用佛波酯诱导亦不能增加SR-A的表达和乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)的摄入，表明血管内皮细胞缺乏SR-A活性[17]。内皮细胞是血管壁组织和血液之间的屏障，直接与血液脂蛋白接触，对脂蛋白在血管壁中的转运、修饰及代谢起着关键性作用。因此，改变血管内皮细胞的SR-A活性，观察脂代谢和血管壁功能与结构的变化，可能有利于了解人SR-AI功能。
正常血管内皮细胞通过内吞、透胞作用或细胞表面特异性受体摄取血液中的脂蛋白等大分子物质。内皮细胞通透性增高时，血液成分特别是血浆蛋白等大分子物质经内皮运输即可增加[18，19]，若超过了生理限度，这些物质就可能在血管壁、组织间隙堆积，促进动脉硬化形成。光镜及电镜观察到，转人SR-AI基因鼠主动脉内膜明显肿胀，内皮细胞胞质中出现许多吞饮小泡，提示内皮细胞高表达人SR-AI导致内皮细胞吞饮作用增强，吞饮许多阴离子化合物包括血浆脂蛋白和糖蛋白等，并转运到内膜下，导致中膜弹性纤维的破坏及粘液样变性和平滑肌细胞的损害。内皮表面的囊状或虫蚀样改变可能与内皮细胞过多摄取，致吞饮小泡破裂有关。在喂饲正常颗粒饲料的情况下，转人SR-AI基因鼠血管壁未见典型的动脉粥样硬化斑块形成，可能因血液中修饰脂蛋白的含量较低有关。但血管壁的这些病理改变与人类As的早期病理改变极为相似[20]。当血脂浓度增高时，内皮细胞高表达人SR-AI可能有利于As的形成。
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在喂正常颗粒饲料情况下，转人SR-AI基因鼠的血脂有较大的改变，与正常C57BL/6小鼠相比，其甘油三酯水平明显升高，而血清总胆固醇变化不明显；但在转基因鼠系内，血清总胆固醇水平高低与性别有关，雄性鼠胆固醇水平明显高于雌性，也高于C57BL/6小鼠，而甘油三酯的变化却无性别差异；同时发现雄性转基因鼠内皮细胞的损害及血管壁病变也较雌性鼠严重。转hSR-AI小鼠这些代谢变化机理不清，可能与人SR-AI对脂蛋白的识别和吞噬与血脂成分不同有关。转人SR-AI基因鼠血脂的性别差异也可能为我们研究激素与As的关系提供很好的动物模型，因为人As发病时间及病变程度与性别差异密切相关，有证据表明，男性的血脂通常高于绝经期前同年龄组的女性[21]。
SR-A的配体非常广泛，除了能结合和内化多种多聚阴离子化合物，同时也能识别和介导吞噬体内受损害的蛋白质、细胞以及炎症或组织损伤部位的细胞碎片，清除体内异物。本研究建立的人SR-AI转基因鼠将有助于人类SR-A在体内的功能和与As关系的研究。
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致谢 该转基因小鼠是研究者在香港大学分子生物学研究所学习期间完成的，在此，作者特别感谢该所各位老师和同事给予的指导和帮助。
(此文编辑 胡必利)
[基金项目] 国家自然科学资金资助项目(项目编号39900061)
[作者简介] 万腊香，女，1964年出生，湖南省慈利县人，在读博士生。杨永宗，男，1937年11月出生，福建仙游县人，病理生理学教授，博士研究生导师。陈 修，男，1928年出生，药理学教授，博士研究生导师。
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(此文1999-12-24收到， 2000-03-10修回), http://www.100md.com