屏氧酶与冠心病
作者：李毅夫 赵水平
单位：湖南医科大学附属第二医院心血管内科，长沙，410011
关键词：屏氧酶；基因；多态性；冠心病
中国动脉硬化杂志000122[摘 要] 定位于染色体7q21.3的屏氧酶，其cDNA 1 346 bp，含9个外显子和8个内含子,由355个氨基酸组成，在192位和55位存在基因多态性。屏氧酶基因多态性及其酶活性在高密度脂蛋白保护低密度脂蛋白免受氧化修饰和抗动脉粥样硬化/抗炎症作用中具有重要意义，与冠心病的发生发展密切相关。
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0075-04
屏氧酶(paraoxonase， PON)是一类与高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)结合的芳香酯酶，因最初检测该酶活性所用的底物为对氧磷(paraoxon)，亦称对氧磷酯酶。屏氧酶在有机磷酸代谢中具有重要作用，它能催化磷酸酯键的水解，降解有机磷酸、芳香羧基酸酯和氨基甲酸酯，对有机磷杀虫剂和神经毒气具有解毒作用。屏氧酶尚能部分水解脂质过氧化物，保护低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)免受氧化修饰，减少氧化型脂质积聚[1]。自90年代初发现PON1 活性与动脉粥样硬化发生密切相关后，对PON的研究日趋深入，特别是其与冠心病的相关研究更是众多研究者关注的热点领域。
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1 屏氧酶基因多态性
PON1是PON基因家族中一员，定位于染色体7q21.3[2]，最近已在同一位点克隆了另外两个PON样基因，称为PON2、PON3，它们与PON1基因有较高的同源性,目前尚未鉴定PON2、PON3的蛋白质产物，但证实PON2 mRNA的组织分布要较PON1广[1]。人类PON1基因的cDNA全长约25.9 kb, cDNA为1 346 bp，含9个外显子和8个内含子,由355个氨基酸组成。色氨酸(Trp)和天冬氨酸(Asp)/谷氨酸(Glu)残基是PON1活性中心成分和钙结合位点[3]，第280位氨基酸残基的芳香/疏水性非常重要，其突变可显著影响酶的活性。组成PON1二硫键(C41和C352)的半胱氨酸以及存在于组氨酸(His)和Asp/Glu残基间的12个氨基酸(H114、H133、H154、H242、H284、D53、D168、D182、D268、D278、E52和 E194)对于PON1芳基酯酶和有机磷酸酶活性[1]是必需的,但联结Asn252和323的聚糖链对于PON分泌和活性并不十分重要。
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PON1在两个位点具有多态性，即192位谷氨酸(Glu)/精氨酸(Arg)多态性，其等位基因为Q/R，Q同工酶在192位为谷氨酸，R同工酶在该位点为精氨酸。另一种多态性是55位的蛋氨酸(Met)/亮氨酸(Leu)ATG/TTG颠换，等位基因为M/L(当丙氨酸被定义为N-末端残基时，上述位点即为191和54位)[1]。
PON1等位基因的频率分布存在种族和个体差异，在欧洲白种人,等位基因Q/R的频率为0.71/0.29[1]，在土耳其人群，基因型分布为QQ0.49、QR0.40、RR0.11和LL0.52、LM0.39、MM0.09；高活性等位基因R和L分别为0.31和0.72，其频率稍高于其他白种人而明显低于东方人群[4]。亚洲印第安人中L等位基因频率明显高于华人(0.202比0.036，P<0.0001)[5]；而健康华人R等位基因频率则明显高于印第安人(0.58比0.33，P<0.001)[6]，日本人R和L等位基因频率也明显高于白种人[7]。Singh 等[8]报道在166例健康的印度西北旁遮普人基因型频率为Q0.845、R0.155，其纯合子QQ或杂合子QR的酶活性均低于欧洲人。
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2 屏氧酶基因多态性与屏氧酶活性
通过基因型研究和酶法检测个体PON表型显示，个体间PON1活性可相差10～40倍，即使在同一个体，也可相差至少13倍[1，9]，这种差异是由基因多态性所致。PON基因192位多态性是PON1活性的主要决定因素，等位基因Q与低PON1活性有关，而R等位基因则与高PON1活性相关。55位多态性也可调节PON1活性，在校正192位基因对PON1活性的影响后，MM纯合子与LL和LM比较，对氧磷酯酶活性减低超过50%，多因素回归分析提示192位多态性、55位多态性和血清PON1浓度对PON1活性的影响分别占46%、16%和13%。PON基因多态性影响对氧磷水解，QQ/MM纯合子的血清水解对氧磷的活性最低，RR/LL纯合子血清活性最高[1]，因此QQ/MM和QR/MM个体对有机磷杀虫剂较敏感[10], 为有机磷酸化合物中毒的高危者。
屏氧酶基因多态性对不同效应的PON活性影响也存在差异，研究表明无论192位点为Gln或Arg，55位点L等位基因都与高PON活性有关，但经蛋白质因素校正后，ANOVA分析显示55位点的三种基因型MM、ML和LL间PON活性无显著差异；而且各种基因型的纯化酶具有相同的抗LDL氧化作用。尽管来自QQ和RR基因型的HDL的PON活性相差达6倍，但两者降低过氧化产物的程度相似。加热使PON1失活并不影响其保护作用，该PON蛋白和芳基脂酶活性具有的热稳定性与PON水解活性密切相关，并不受PON遗传变异性的影响[11]，这种差异可能与PON1底物活性多态性有关。研究显示，R异构酶对一些底物更具效力，如Paraoxon、Methyl paraoxon、Chlorthion oxon、EPN oxon和Armine 等[1]，Q异构酶则能更快地水解Diazoxon、Sarin和Soman等底物，而对于Phenyl acetate、Chlopyrifos oxon和2-naphthyl acetate等底物两者活性相当。PON的生理性底物目前仍不清楚。
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3 屏氧酶相关的高密度脂蛋白抗氧化作用
PON是一类钙离子依赖性HDL相关脂酶，具有过氧化酶样活性和抗脂蛋白氧化作用[12]。纯化的人类HDL相关性PON1通过防止脂质过氧化物的生成，抑制LDL氧化，并清除存在于氧化型低密度脂蛋白中的致炎症性氧化型脂质，水解氧化型磷脂和胆固醇酯氢过氧化物。PON1基因及基因多态性对HDL保护LDL免受氧化修饰具有重要意义[1]，Shin等[13]通过基因打靶制备PON1敲除鼠，从中分离的HDL不能防止LDL氧化，其HDL、LDL较野生型的脂蛋白更易氧化，当饲以高脂肪、高胆固醇饮食时，PON1缺乏鼠较野生型更易于发生动脉粥样硬化。Mackness[14]等研究也提示，PON1敲除鼠的HDL对减少脂质过氧化物积聚无效。研究显示，PON1 MM/QQ纯合子HDL抑制LDL脂质过氧化物生成的保护作用最大，LL/RR和QQ/LL纯合子HDL的作用最小[15，16]。将HDL和LDL与Cu2+共同孵育6 h后，PON1-QQ HDL仍有57.5%±5.3%的基本能力保护LDL不被氧化修饰，而PON1-QR HDL保留较少，为25.1%±4.5%(P<0.01)，PON1-RR HDL仅为0.75%±0.40%。LL和LM基因型HDL 保留21.8%±7.5%和29.5%±6.6%(P=NS)，而PON1-MM HDL 保留49.5%±5.3%(P<0.01)[1]。同时研究表明，纯化的PON1与血管细胞共皿孵育时抑制氧化型LDL的促炎症作用，可能与LDL磷脂的sn-2位置氧化型花生四烯酸衍生物代谢有关。另外两种HDL相关酶，血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和卵磷脂-胆固醇乙酰转换酶也表现有同样的功能。而Cao等[11]研究表明各种基因型纯化酶具有相同的抗LDL氧化作用，来自QQ和RR基因型的HDL，尽管PON活性相差达6倍，但两者降低过氧化产物的程度相当，提示HDL可能含有不同的PON1同工酶来保护LDL不被氧化修饰。研究表明，当氧化过程启动时，Q同工酶抑制LDL氧化最有效，而当氧化开始后1 h加入R同工酶却更有效，这些资料提示，2种同工酶可能作用于不同的底物。此外2种同工酶还能减少磷脂和胆固醇酯氧化，LDL氧化4 h后，Q芳香脂酶活性降低仅28%，而R芳香脂酶活性降低达55%，用金属络合剂EDTA或钙离子清除剂Chelex Column可使钙依赖性PON芳香脂酶失活。业已证实，PON1保护LDL 免受氧化修饰伴随于该酶的失活，可能有三种机制：①铜离子与PON1结合；②氧自由基作用于PON1和/或PON2、PON3；③对该酶脂蛋白相关的氧化。由于该酶游离巯基和LDL氧化时所形成的氧化型脂质(诸如氧化型磷脂、氧化型胆固醇酯或溶血磷脂胆碱)之间相互作用而使PON失活。LDL氧化时，PON1和抗氧化剂通过防止氧化型脂质诱生的氧化型LDL形成，并加速其清除的双重途径，降低氧化型LDL积聚[17]。然而阻滞PON283位游离的巯基可抑制芳香脂酶活性及保护LDL免受氧化修饰的作用。通过重组使PON1游离巯基由丙氨酸或丝氨酸替代，即使仍保留PON1活性和芳香脂酶活性，但不再有保护LDL不被氧化的作用，提示PON的芳香脂酶/PON活性以及保护LDL免受氧化修饰的作用，与该酶活性位点的关系并不完全相同，PON保护LDL免受氧化修饰的能力需要283位点的胱氨酸[18]。同时，人类HDL的PON1活性与HDL氧化易感性呈负相关(r2=0.77，n=15)，补充纯化的PON1抑制铜诱发的HDL氧化，在HDL中加入PON1可延长氧化反应的滞后期，并降低HDL氧化和醛类形成达95%。HDL相关性PON1以及纯化PON1能持续地水解(达25%)氢过氧化物以及动脉粥样硬化氧化应激时产生的主要反应氧等。
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4 屏氧酶多态性与冠心病
研究表明PON1在HDL抗动脉粥样硬化/抗炎症作用中具重要意义[14]，PON1多态性可影响HDL遏制动脉粥样硬化发展和预防炎症的能力[16]，与冠状动脉粥样硬化易感性有关[9]。近年分子生物学研究表明，L等位基因和R等位基因携带者(特别是LL基因型和RR基因型患者)易患动脉粥样硬化，但其与冠心病间的关系仍有争议。 Mackness等[1]总结了8个实验室报告的PON1 192位基因多态性与冠心病关系的病例对照研究，结果表明，3项研究报告没有相关，4项研究有阳性结果，另一项研究则表明与新加坡印地安人有正相关，而与新加坡华人则无相关性。近年又有5项类似的研究发表，其结果是2项研究有相关性，3项研究无明显相关性。在120例印度冠心病患者中，基因型Q和R频率为75%和25%，R等位基因的频率在冠心病患者(0.45)高于对照组(0.17)，认为PON1基因多态性可能通过一种非脂质氧化的机制与冠心病易感性有关[19]。Pfohl 等[20]在288例Ⅱ型糖尿病中(血管造影证实170例冠心病、118例无冠心病)，发现Q等位基因频率在冠心病患者为0.656，对照组为0.746(卡方值5.36，P<0.05)，与Q/Q基因型比较，携带至少一个R等位基因者，经年龄校正后的冠心病 odd值为1.78，证实PON1基因192位R等位基因是冠心病的危险因素，但不是Ⅱ型糖尿病心肌梗死的危险因素。与此相反，Ko 等[21]在218例经血管造影证实为冠心病的患者以及同样数目年龄、性别匹配的对照组中，对照组基因型QQ、QR、RR的频数为25(11%)、102(47%)和91(42%)，而冠心病组分别为30(14%)、96(44%)和92(42%)(chi2=0.57，P=0.75)，对照组Q等位基因频率为0.36，冠心病组为0.35(P=0.94)，显示台湾华人PON1基因192位多态性与冠心病无明显相关。同样在意大利人群[22]、土耳其人群[23]和芬兰人群[24]，192基因型与冠心病间无明显相关。
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有研究认为PON1基因型与动脉粥样硬化的脂质谱有关[22]，HDL较低而TG较高[23]。Saha等[25]采用多因素回归分析研究PON等位基因对血脂参数的影响发现，高活性等位基因R与高甘油三酯血症和载脂蛋白B相关，PON等位基因对血脂的平均作用为甘油三酯22%、LDL胆固醇11%、载脂蛋白 A-II 14%、载脂蛋白B 19%；提示其在血清脂质和脂蛋白代谢中有一定作用。而既往的ECTIM(Etude Cas-Temoins de l'Infarctus du Myocarde)研究比较了三种基因型的几种血浆脂质、脂蛋白和载脂蛋白水平，认为 192基因多态性与心肌梗死、冠状动脉粥样硬化的严重性和血脂水平无相关性[26]。
PON1-55多态性与冠心病的观察报告较少，纯合子 L等位基因为冠心病的独立危险因子，而在亚洲印地安人和华人中，其与冠心病无相关[1]。Schmidt等[27]研究提示LL基因型与颈动脉疾病明显相关，而192位多态性对其无影响，提示LL基因型可能是颈动脉粥样硬化的危险因素。除载脂蛋白A-Ⅰ在MM纯合子患者中较低外，其余血脂浓度在三种基因型组中均无差异。
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血清PON与冠心病患者血清PON1是钙依赖性的45 kDa的糖蛋白，192位多态性是PON1活性多态性的决定因素，55位多态性也调节其活性，血清PON1可能通过水解磷脂氢氧化物，从而保护脂蛋白免受氧化修饰，发挥抗动脉粥样硬化作用[28]，提示正常血清PON1活性可能与HDL的抗氧化能力和抑制动脉粥样硬化形成有关。研究表明，HDL浓度与基因型分布可能并不完全是血清PON1活性的决定因素，尚有其他未知的因素参与，在尿毒症患者和高脂蛋白血症患者PON活性均明显降低，尿毒症患者降低尤为明显，而其基因型分布无明显差异[29]。进食脂肪餐后，血清PON活性也明显降低(-17%，P=0.005)，直至8 h后PON1活性仍较基础水平要低，并且在食用无脂肪饮食后明显增加(14%, P=0. 005)，提示在食用脂肪餐的餐后期，该酶保护LDL抗过氧化物积聚和动脉粥样硬化性氧化修饰的作用降低，但作者认为这可能是由于载脂蛋白A1相关因素的影响,而并未显著影响LDL对体外氧化的真正抵抗[30]；雌激素替代治疗对HDL的影响也反映在血清PON活性升高[1]。
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大量的流行病学研究提示，急性期反应与动脉粥样硬化相关，PON1降低可能是急性期反应和动脉粥样硬化发生之间的一种重要影响因素[31]。而免疫组化定位研究表明PON1存在于正常动脉壁，当动脉粥样硬化进展时，动脉壁PON1浓度显著增加，也可能是对氧化应激增加的一种反映[1]。在载脂蛋白E缺乏的动脉粥样硬化鼠，随年龄、血清脂质过氧化和病灶范围的增加，血清PON1活性降低[12]。Ayub等[32]发现心肌梗死组较对照组血清PON1活性和浓度明显降低，而PON1特异性活性在心肌梗死组则明显升高。由于PON浓度低，在42天时PON1活性明显升高，但仍低于对照组，直至6周后才无明显差别。血清屏氧酶在血清脂质和脂蛋白代谢中有一定作用，Saha等[25]应用Spearman's等级相关评估血清屏氧酶对血脂的影响，发现血清屏氧酶活性与甘油三酯水平呈正相关，而女性的血清屏氧酶活性与总胆固醇和LDL呈负相关，与HDL和载脂蛋白 A-II、 载脂蛋白B水平呈正相关。血清PON活性正常的HDL能有效地阻止LDL诱导的单核细胞迁徙，在PON1活性低的冠心病患者，其HDL不能抑制LDL诱导的单核细胞迁徙，因此，HDL水平和动脉粥样硬化事件危险间的负相关关系可能是由于保护LDL免受氧化型HDL相关酶以及HDL在胆固醇逆转运和脂质再分布中的公认作用，而且这种酶仅与HDL小颗粒分子相关，这可以部分解释为什么总HDL水平低的部分患者无临床动脉粥样硬化，而部分HDL水平相对正常者可早发动脉粥样硬化[1]。
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综上所述，屏氧酶基因多态性及其酶活性在高密度脂蛋白保护低密度脂蛋白免受氧化修饰和抗动脉粥样硬化/抗炎症作用中具有重要意义，与冠心病的发生发展密切相关，但其相关联的机制仍未彻底阐明。正如 Laplaud等[33]所作的假说，在PON1和/或PON2、PON3甚至该基因簇的其他区域，基因多态性的影响是以一种复杂的方式发挥效应。一系列相关的因素，包括高密度脂蛋白颗粒结合的PONs的异质性，相关载脂蛋白诸如载脂蛋白J/簇集素(clusterin)的代谢，PONs和其他HDL相关酶诸如血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和卵磷脂-胆固醇乙酰转化酶的各自作用，HDL组分和急性期条件下活性的改变；饮食和环境对PONs的调节作用以及PON在动脉粥样硬化动脉壁的实际效应均可能影响其作用的表达。这些相互作用的环节将是今后研究的主要方向；而更为关键的是需要明确PON的生理性底物，才能准确判定PON的活性，进而探索其与冠心病等心血管疾病的关联及发生机制，为临床提供新的诊疗方法。
[作者简介] 李毅夫, 男, 1965年出生, 湖南医科大学博士研究生
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(1999-08-01收到， 2000-01-08修回), 百拇医药
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关键词：屏氧酶；基因；多态性；冠心病
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屏氧酶(paraoxonase， PON)是一类与高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)结合的芳香酯酶，因最初检测该酶活性所用的底物为对氧磷(paraoxon)，亦称对氧磷酯酶。屏氧酶在有机磷酸代谢中具有重要作用，它能催化磷酸酯键的水解，降解有机磷酸、芳香羧基酸酯和氨基甲酸酯，对有机磷杀虫剂和神经毒气具有解毒作用。屏氧酶尚能部分水解脂质过氧化物，保护低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)免受氧化修饰，减少氧化型脂质积聚[1]。自90年代初发现PON1 活性与动脉粥样硬化发生密切相关后，对PON的研究日趋深入，特别是其与冠心病的相关研究更是众多研究者关注的热点领域。
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1 屏氧酶基因多态性
PON1是PON基因家族中一员，定位于染色体7q21.3[2]，最近已在同一位点克隆了另外两个PON样基因，称为PON2、PON3，它们与PON1基因有较高的同源性,目前尚未鉴定PON2、PON3的蛋白质产物，但证实PON2 mRNA的组织分布要较PON1广[1]。人类PON1基因的cDNA全长约25.9 kb, cDNA为1 346 bp，含9个外显子和8个内含子,由355个氨基酸组成。色氨酸(Trp)和天冬氨酸(Asp)/谷氨酸(Glu)残基是PON1活性中心成分和钙结合位点[3]，第280位氨基酸残基的芳香/疏水性非常重要，其突变可显著影响酶的活性。组成PON1二硫键(C41和C352)的半胱氨酸以及存在于组氨酸(His)和Asp/Glu残基间的12个氨基酸(H114、H133、H154、H242、H284、D53、D168、D182、D268、D278、E52和 E194)对于PON1芳基酯酶和有机磷酸酶活性[1]是必需的,但联结Asn252和323的聚糖链对于PON分泌和活性并不十分重要。
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PON1在两个位点具有多态性，即192位谷氨酸(Glu)/精氨酸(Arg)多态性，其等位基因为Q/R，Q同工酶在192位为谷氨酸，R同工酶在该位点为精氨酸。另一种多态性是55位的蛋氨酸(Met)/亮氨酸(Leu)ATG/TTG颠换，等位基因为M/L(当丙氨酸被定义为N-末端残基时，上述位点即为191和54位)[1]。
PON1等位基因的频率分布存在种族和个体差异，在欧洲白种人,等位基因Q/R的频率为0.71/0.29[1]，在土耳其人群，基因型分布为QQ0.49、QR0.40、RR0.11和LL0.52、LM0.39、MM0.09；高活性等位基因R和L分别为0.31和0.72，其频率稍高于其他白种人而明显低于东方人群[4]。亚洲印第安人中L等位基因频率明显高于华人(0.202比0.036，P<0.0001)[5]；而健康华人R等位基因频率则明显高于印第安人(0.58比0.33，P<0.001)[6]，日本人R和L等位基因频率也明显高于白种人[7]。Singh 等[8]报道在166例健康的印度西北旁遮普人基因型频率为Q0.845、R0.155，其纯合子QQ或杂合子QR的酶活性均低于欧洲人。
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2 屏氧酶基因多态性与屏氧酶活性
通过基因型研究和酶法检测个体PON表型显示，个体间PON1活性可相差10～40倍，即使在同一个体，也可相差至少13倍[1，9]，这种差异是由基因多态性所致。PON基因192位多态性是PON1活性的主要决定因素，等位基因Q与低PON1活性有关，而R等位基因则与高PON1活性相关。55位多态性也可调节PON1活性，在校正192位基因对PON1活性的影响后，MM纯合子与LL和LM比较，对氧磷酯酶活性减低超过50%，多因素回归分析提示192位多态性、55位多态性和血清PON1浓度对PON1活性的影响分别占46%、16%和13%。PON基因多态性影响对氧磷水解，QQ/MM纯合子的血清水解对氧磷的活性最低，RR/LL纯合子血清活性最高[1]，因此QQ/MM和QR/MM个体对有机磷杀虫剂较敏感[10], 为有机磷酸化合物中毒的高危者。
屏氧酶基因多态性对不同效应的PON活性影响也存在差异，研究表明无论192位点为Gln或Arg，55位点L等位基因都与高PON活性有关，但经蛋白质因素校正后，ANOVA分析显示55位点的三种基因型MM、ML和LL间PON活性无显著差异；而且各种基因型的纯化酶具有相同的抗LDL氧化作用。尽管来自QQ和RR基因型的HDL的PON活性相差达6倍，但两者降低过氧化产物的程度相似。加热使PON1失活并不影响其保护作用，该PON蛋白和芳基脂酶活性具有的热稳定性与PON水解活性密切相关，并不受PON遗传变异性的影响[11]，这种差异可能与PON1底物活性多态性有关。研究显示，R异构酶对一些底物更具效力，如Paraoxon、Methyl paraoxon、Chlorthion oxon、EPN oxon和Armine 等[1]，Q异构酶则能更快地水解Diazoxon、Sarin和Soman等底物，而对于Phenyl acetate、Chlopyrifos oxon和2-naphthyl acetate等底物两者活性相当。PON的生理性底物目前仍不清楚。
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3 屏氧酶相关的高密度脂蛋白抗氧化作用
PON是一类钙离子依赖性HDL相关脂酶，具有过氧化酶样活性和抗脂蛋白氧化作用[12]。纯化的人类HDL相关性PON1通过防止脂质过氧化物的生成，抑制LDL氧化，并清除存在于氧化型低密度脂蛋白中的致炎症性氧化型脂质，水解氧化型磷脂和胆固醇酯氢过氧化物。PON1基因及基因多态性对HDL保护LDL免受氧化修饰具有重要意义[1]，Shin等[13]通过基因打靶制备PON1敲除鼠，从中分离的HDL不能防止LDL氧化，其HDL、LDL较野生型的脂蛋白更易氧化，当饲以高脂肪、高胆固醇饮食时，PON1缺乏鼠较野生型更易于发生动脉粥样硬化。Mackness[14]等研究也提示，PON1敲除鼠的HDL对减少脂质过氧化物积聚无效。研究显示，PON1 MM/QQ纯合子HDL抑制LDL脂质过氧化物生成的保护作用最大，LL/RR和QQ/LL纯合子HDL的作用最小[15，16]。将HDL和LDL与Cu2+共同孵育6 h后，PON1-QQ HDL仍有57.5%±5.3%的基本能力保护LDL不被氧化修饰，而PON1-QR HDL保留较少，为25.1%±4.5%(P<0.01)，PON1-RR HDL仅为0.75%±0.40%。LL和LM基因型HDL 保留21.8%±7.5%和29.5%±6.6%(P=NS)，而PON1-MM HDL 保留49.5%±5.3%(P<0.01)[1]。同时研究表明，纯化的PON1与血管细胞共皿孵育时抑制氧化型LDL的促炎症作用，可能与LDL磷脂的sn-2位置氧化型花生四烯酸衍生物代谢有关。另外两种HDL相关酶，血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和卵磷脂-胆固醇乙酰转换酶也表现有同样的功能。而Cao等[11]研究表明各种基因型纯化酶具有相同的抗LDL氧化作用，来自QQ和RR基因型的HDL，尽管PON活性相差达6倍，但两者降低过氧化产物的程度相当，提示HDL可能含有不同的PON1同工酶来保护LDL不被氧化修饰。研究表明，当氧化过程启动时，Q同工酶抑制LDL氧化最有效，而当氧化开始后1 h加入R同工酶却更有效，这些资料提示，2种同工酶可能作用于不同的底物。此外2种同工酶还能减少磷脂和胆固醇酯氧化，LDL氧化4 h后，Q芳香脂酶活性降低仅28%，而R芳香脂酶活性降低达55%，用金属络合剂EDTA或钙离子清除剂Chelex Column可使钙依赖性PON芳香脂酶失活。业已证实，PON1保护LDL 免受氧化修饰伴随于该酶的失活，可能有三种机制：①铜离子与PON1结合；②氧自由基作用于PON1和/或PON2、PON3；③对该酶脂蛋白相关的氧化。由于该酶游离巯基和LDL氧化时所形成的氧化型脂质(诸如氧化型磷脂、氧化型胆固醇酯或溶血磷脂胆碱)之间相互作用而使PON失活。LDL氧化时，PON1和抗氧化剂通过防止氧化型脂质诱生的氧化型LDL形成，并加速其清除的双重途径，降低氧化型LDL积聚[17]。然而阻滞PON283位游离的巯基可抑制芳香脂酶活性及保护LDL免受氧化修饰的作用。通过重组使PON1游离巯基由丙氨酸或丝氨酸替代，即使仍保留PON1活性和芳香脂酶活性，但不再有保护LDL不被氧化的作用，提示PON的芳香脂酶/PON活性以及保护LDL免受氧化修饰的作用，与该酶活性位点的关系并不完全相同，PON保护LDL免受氧化修饰的能力需要283位点的胱氨酸[18]。同时，人类HDL的PON1活性与HDL氧化易感性呈负相关(r2=0.77，n=15)，补充纯化的PON1抑制铜诱发的HDL氧化，在HDL中加入PON1可延长氧化反应的滞后期，并降低HDL氧化和醛类形成达95%。HDL相关性PON1以及纯化PON1能持续地水解(达25%)氢过氧化物以及动脉粥样硬化氧化应激时产生的主要反应氧等。
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4 屏氧酶多态性与冠心病
研究表明PON1在HDL抗动脉粥样硬化/抗炎症作用中具重要意义[14]，PON1多态性可影响HDL遏制动脉粥样硬化发展和预防炎症的能力[16]，与冠状动脉粥样硬化易感性有关[9]。近年分子生物学研究表明，L等位基因和R等位基因携带者(特别是LL基因型和RR基因型患者)易患动脉粥样硬化，但其与冠心病间的关系仍有争议。 Mackness等[1]总结了8个实验室报告的PON1 192位基因多态性与冠心病关系的病例对照研究，结果表明，3项研究报告没有相关，4项研究有阳性结果，另一项研究则表明与新加坡印地安人有正相关，而与新加坡华人则无相关性。近年又有5项类似的研究发表，其结果是2项研究有相关性，3项研究无明显相关性。在120例印度冠心病患者中，基因型Q和R频率为75%和25%，R等位基因的频率在冠心病患者(0.45)高于对照组(0.17)，认为PON1基因多态性可能通过一种非脂质氧化的机制与冠心病易感性有关[19]。Pfohl 等[20]在288例Ⅱ型糖尿病中(血管造影证实170例冠心病、118例无冠心病)，发现Q等位基因频率在冠心病患者为0.656，对照组为0.746(卡方值5.36，P<0.05)，与Q/Q基因型比较，携带至少一个R等位基因者，经年龄校正后的冠心病 odd值为1.78，证实PON1基因192位R等位基因是冠心病的危险因素，但不是Ⅱ型糖尿病心肌梗死的危险因素。与此相反，Ko 等[21]在218例经血管造影证实为冠心病的患者以及同样数目年龄、性别匹配的对照组中，对照组基因型QQ、QR、RR的频数为25(11%)、102(47%)和91(42%)，而冠心病组分别为30(14%)、96(44%)和92(42%)(chi2=0.57，P=0.75)，对照组Q等位基因频率为0.36，冠心病组为0.35(P=0.94)，显示台湾华人PON1基因192位多态性与冠心病无明显相关。同样在意大利人群[22]、土耳其人群[23]和芬兰人群[24]，192基因型与冠心病间无明显相关。
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有研究认为PON1基因型与动脉粥样硬化的脂质谱有关[22]，HDL较低而TG较高[23]。Saha等[25]采用多因素回归分析研究PON等位基因对血脂参数的影响发现，高活性等位基因R与高甘油三酯血症和载脂蛋白B相关，PON等位基因对血脂的平均作用为甘油三酯22%、LDL胆固醇11%、载脂蛋白 A-II 14%、载脂蛋白B 19%；提示其在血清脂质和脂蛋白代谢中有一定作用。而既往的ECTIM(Etude Cas-Temoins de l'Infarctus du Myocarde)研究比较了三种基因型的几种血浆脂质、脂蛋白和载脂蛋白水平，认为 192基因多态性与心肌梗死、冠状动脉粥样硬化的严重性和血脂水平无相关性[26]。
PON1-55多态性与冠心病的观察报告较少，纯合子 L等位基因为冠心病的独立危险因子，而在亚洲印地安人和华人中，其与冠心病无相关[1]。Schmidt等[27]研究提示LL基因型与颈动脉疾病明显相关，而192位多态性对其无影响，提示LL基因型可能是颈动脉粥样硬化的危险因素。除载脂蛋白A-Ⅰ在MM纯合子患者中较低外，其余血脂浓度在三种基因型组中均无差异。
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血清PON与冠心病患者血清PON1是钙依赖性的45 kDa的糖蛋白，192位多态性是PON1活性多态性的决定因素，55位多态性也调节其活性，血清PON1可能通过水解磷脂氢氧化物，从而保护脂蛋白免受氧化修饰，发挥抗动脉粥样硬化作用[28]，提示正常血清PON1活性可能与HDL的抗氧化能力和抑制动脉粥样硬化形成有关。研究表明，HDL浓度与基因型分布可能并不完全是血清PON1活性的决定因素，尚有其他未知的因素参与，在尿毒症患者和高脂蛋白血症患者PON活性均明显降低，尿毒症患者降低尤为明显，而其基因型分布无明显差异[29]。进食脂肪餐后，血清PON活性也明显降低(-17%，P=0.005)，直至8 h后PON1活性仍较基础水平要低，并且在食用无脂肪饮食后明显增加(14%, P=0. 005)，提示在食用脂肪餐的餐后期，该酶保护LDL抗过氧化物积聚和动脉粥样硬化性氧化修饰的作用降低，但作者认为这可能是由于载脂蛋白A1相关因素的影响,而并未显著影响LDL对体外氧化的真正抵抗[30]；雌激素替代治疗对HDL的影响也反映在血清PON活性升高[1]。
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大量的流行病学研究提示，急性期反应与动脉粥样硬化相关，PON1降低可能是急性期反应和动脉粥样硬化发生之间的一种重要影响因素[31]。而免疫组化定位研究表明PON1存在于正常动脉壁，当动脉粥样硬化进展时，动脉壁PON1浓度显著增加，也可能是对氧化应激增加的一种反映[1]。在载脂蛋白E缺乏的动脉粥样硬化鼠，随年龄、血清脂质过氧化和病灶范围的增加，血清PON1活性降低[12]。Ayub等[32]发现心肌梗死组较对照组血清PON1活性和浓度明显降低，而PON1特异性活性在心肌梗死组则明显升高。由于PON浓度低，在42天时PON1活性明显升高，但仍低于对照组，直至6周后才无明显差别。血清屏氧酶在血清脂质和脂蛋白代谢中有一定作用，Saha等[25]应用Spearman's等级相关评估血清屏氧酶对血脂的影响，发现血清屏氧酶活性与甘油三酯水平呈正相关，而女性的血清屏氧酶活性与总胆固醇和LDL呈负相关，与HDL和载脂蛋白 A-II、 载脂蛋白B水平呈正相关。血清PON活性正常的HDL能有效地阻止LDL诱导的单核细胞迁徙，在PON1活性低的冠心病患者，其HDL不能抑制LDL诱导的单核细胞迁徙，因此，HDL水平和动脉粥样硬化事件危险间的负相关关系可能是由于保护LDL免受氧化型HDL相关酶以及HDL在胆固醇逆转运和脂质再分布中的公认作用，而且这种酶仅与HDL小颗粒分子相关，这可以部分解释为什么总HDL水平低的部分患者无临床动脉粥样硬化，而部分HDL水平相对正常者可早发动脉粥样硬化[1]。
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综上所述，屏氧酶基因多态性及其酶活性在高密度脂蛋白保护低密度脂蛋白免受氧化修饰和抗动脉粥样硬化/抗炎症作用中具有重要意义，与冠心病的发生发展密切相关，但其相关联的机制仍未彻底阐明。正如 Laplaud等[33]所作的假说，在PON1和/或PON2、PON3甚至该基因簇的其他区域，基因多态性的影响是以一种复杂的方式发挥效应。一系列相关的因素，包括高密度脂蛋白颗粒结合的PONs的异质性，相关载脂蛋白诸如载脂蛋白J/簇集素(clusterin)的代谢，PONs和其他HDL相关酶诸如血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和卵磷脂-胆固醇乙酰转化酶的各自作用，HDL组分和急性期条件下活性的改变；饮食和环境对PONs的调节作用以及PON在动脉粥样硬化动脉壁的实际效应均可能影响其作用的表达。这些相互作用的环节将是今后研究的主要方向；而更为关键的是需要明确PON的生理性底物，才能准确判定PON的活性，进而探索其与冠心病等心血管疾病的关联及发生机制，为临床提供新的诊疗方法。
[作者简介] 李毅夫, 男, 1965年出生, 湖南医科大学博士研究生
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(1999-08-01收到， 2000-01-08修回), 百拇医药