低强度He-Ne激光血管内照射对饲脂家兔主动脉内膜超微结构的影响
作者：陈长英1 刘瑞云1 黄振文1
单位：1 河南医科大学第一附属医院心内科，郑州，450052
关键词：
低强度He 脂质过氧化能损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的形成和发展〔1〕。低强度氦-氖激光血管内照射(intravascular low-level laser irradiation on blood，ILLLI) 具有抗脂质过氧化损伤，加速自由基清除的功能〔2〕。本研究拟观察ILLLI对饲脂家兔血浆LPO、SOD浓度及主动脉内膜超微结构的影响，探讨ILLLI预防动脉粥样硬化的效果及作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型及实验设计
, 百拇医药
健康雄性日本大耳白兔40只，体重2.4～3.0kg，3～4月龄。随机分为4组：正常对照组(N)、高脂对照组(H)、激光治疗组(I)、舒降之治疗组(S)，每组10只，分笼喂养。N组喂普通颗粒饲料，其余各组喂1%胆固醇颗粒饲粒。 每只进食量控制在100g/d，饮水量不限，实验时间共10周。
1.2 实验方法
实验开始后，Ⅰ组即行ILLLI治疗。激光的波长为632nm，输出功率1.5～2.0mW，工作电流8mA。家兔置于特制的兔盒中，选择兔耳缘静脉，常规消毒做静脉穿刺，再经静脉穿刺针导入激光针。当露出红色光斑(直径约10～15mm)时，用胶布固定激光针，使其与血管壁走向保持平行。每日照射1次，每次60min，10次为1疗程，间隔10天，共3个疗程。其余各组同样做耳缘静脉穿刺， 但无激光输出。 S组加舒降之2.5mg/kg*D溶于蒸馏水10ml中灌胃。其余3组每天也用蒸馏水10ml灌胃1次。
, 百拇医药 1.3 样本处理
实验开始前及实验第10周由兔耳中央动脉抽血。全血置于肝素钠抗凝管中混均抗凝，低速离心分离血浆，-20℃冰箱保存备测LPO、SOD,采用氧化脂质TAB不除蛋白快速测定LPO。采用羟胺发色法测定SOD。实验第10周末棒杀动物后， 立即在新鲜主动脉弓病变部位或病变好发部位取材，剥去外膜，切成1mm×1mm×1mm大小，依次用2. 5%戊二醛，1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，再用环氧树脂812包埋， 经超薄切片和醋酸铀，枸橼酸铅双染色后，用日立H-600A型透射电镜观察分析，加速电压15kV。
1.4 统计学处理
结果参数以均数±标准差(
)表示。各组前后比较用配对t 检验。4组间比较用F检验，继以q检验。以P<0.05为有显著性差异。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 家兔血浆SOD，LPO的变化
见附表。
附表 各组家兔血浆LPO、SOD结果比较()
分组
LPO(mmol/L)
SOD(μ/mg)
实验前
实验后
实验前
, 百拇医药
实验后
N组
7.69±2.11⑤
8.25±2.25
2.41±2.05⑤
22.71±4.33
H组
18.33±3.66②⑦
8.21±1.44
13.45±2.93②⑦
21.97±2.73
, 百拇医药
I组
13.38±3.45②③⑦
9.87±2.77
18.01±3.63②③⑦
20.04±4.51
S组
12.94±2.39②③⑦
8.34±0.94
21.42±3.51①③⑤
19.98±3.67
注：与N组比①P<0.05, ②P<0.01;与H组比③P<0.01。与S组比④P<0.05。同组实验前后比较⑤P>0.05，⑥P<0.05，⑦P<0.001。
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2.2 透射电镜观察
N组：内皮细胞呈扁平状，细胞质中有吞饮小泡和少量微丝。 内皮下层和内弹性膜完整，中膜平滑肌细胞内有较多线粒体，形态规则，排列整齐。未见脂肪空泡。
H组：内皮细胞胞质中含有大量大小不等的脂滴，吞饮小泡和微丝明显减少。 内皮细胞下间隙明显扩张，可见平滑肌细胞、胶原纤维及絮状物。内皮下层平滑肌细胞含有数量不等的脂肪空泡，内弹力膜多不完整。中膜平滑肌细胞数量明显减少，排列紊乱，细胞内出现脂质堆积，胞浆内有较多脂滴及吞噬颗粒(图1)。
I组：内皮细胞，内皮下层及内弹性膜损伤轻微，脂质中含有少量脂滴；平滑肌细胞膜损伤轻微，胞质含有少量脂滴，平滑肌细胞及成纤维损伤减轻，胞浆脂肪空泡较高脂组明显减少，细胞间质胶原纤维成份轻度增多(图2)。
S组：主动脉超微结构变化与I组相似。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 ILLLI对兔血浆SOD、LPO的影响
生物膜上的不饱和脂肪酸与活性氧发生连锁反应，产生LPO。在产生自由基的局部激发 脂质过氧化，即可扩展到整个膜， 增加损伤范围。这种不可控制的生物膜的过氧化，能极大损伤膜结构和功能，导致内皮细胞死亡。在人和动物的动脉粥样斑块中均发现了LPO的终产物丙二酰二醛， 斑块内的丙二酰二醛明显高于非斑块区。主动脉壁内的超氧化物歧化酶活性下降。在冠心病患者中还发现，血浆中SOD下降，LPO明显升高，LPO与SOD呈负相关，表明自由基清除剂活性下降是导致LPO升高的重要病因〔3〕。LPO的大量产生可通过几条途径影响动脉粥样硬化的形成〔4〕：①膜流动性减低；②丙二酰二醛能与膜蛋白发生交联反应，膜结构和功能受到极大破坏；③LPO 能修饰LDL和HDL，促进单核细胞，平滑肌细胞等对LDL的吞噬，减少胆固醇的清除， 加速泡沫细胞形成；④LPO能直接损伤内皮细胞和平滑肌细胞，活化血小板，释放5-羟色胺等生物活性物质，导致血管痉挛和血栓形成，并促发动脉粥样硬化。大量研究表明〔5,6〕，ILLLI治疗后可使血浆LPO降低，SOD升高。ILLLI抗LPO、自由基作用机制可能在于使血脂、膜脂代谢正常化，激活SOD，提高血浆铜蓝蛋白及内源性维生素E水平，降低丙二醛毒性等，由此解除了脂质过氧化对生物膜系统的破坏，使内皮细胞恢复正常功能。
, 百拇医药
图1 内皮细胞胞质中含有大小不等的
脂滴及吞噬颗粒(×5000)
图2 内皮细胞胞质中含有少量脂滴(×5000)
本研究发现，高脂饲料可使家兔血浆LPO浓度显著升高，而SOD浓度明显降低(P<0.05～0.01)。ILLLI和舒降之治疗后，均可有效地减少LPO生成，升高SOD浓度(P<0.01)。这表明ILLLI具有减少脂质过氧化反应，对动脉粥样硬化的起始环节进行阻滞，发挥抗动脉粥样硬化作用。
3.2 ILLLI对兔主动脉内膜超微结构的影响
, http://www.100md.com 本研究结果显示，ILLLI 治疗组家兔主动脉超微结构与高脂组比有以下特点：①泡沫细胞明显减少；②平滑肌细胞内无脂滴及胆固醇结晶；③内皮细胞下间隙有明显扩张，但无平滑肌细胞，泡沫细胞和胶原纤维；④内弹力膜完整。ILLLI预防动脉粥样硬化可能与以下因素有关：①降低血脂水平；②防止脂质过氧化；③改善血管内皮功能。本研究结果支持以上推断。具体机制有待于进一步研究。
4 参考文献
1 周玖，陈瑗.内皮细胞脂质过氧化损伤与动脉粥样硬化. 中华心血管杂志，1990,1:248.
2 Feher J. Free Radical Reaction in Medicine. Springer Verlag. 1987.71.
3 周本财. 原发性高血压和冠心病患者血小板内抗氧化活性和过氧化反应的实验观察.中华血液学杂志,1992,9:466.
, 百拇医药
4 王洪武.LPO、PGI2/TXA2与动脉粥样硬化的研究进展.心血管病学进展. 1993,14(5):284～287.
5 Vakhliaev VD， et al. The effect of transvenous laser therapy on lipid peroxidation function in patients with ischemic heart disease. Cardiologia，1992,32(7-8):43.
6 李忠如，宋爽.弱激光照射对人体血清超氧化物歧化酶及丙二醛的影响.中国激光医学杂志,1993.2(1):38～40.
*本课题受河南省教委资助
收稿日期：1997-11-11, http://www.100md.com(陈长英1 刘瑞云1 黄振文1)
单位：1 河南医科大学第一附属医院心内科，郑州，450052
关键词：
低强度He 脂质过氧化能损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的形成和发展〔1〕。低强度氦-氖激光血管内照射(intravascular low-level laser irradiation on blood，ILLLI) 具有抗脂质过氧化损伤，加速自由基清除的功能〔2〕。本研究拟观察ILLLI对饲脂家兔血浆LPO、SOD浓度及主动脉内膜超微结构的影响，探讨ILLLI预防动脉粥样硬化的效果及作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型及实验设计
, 百拇医药
健康雄性日本大耳白兔40只，体重2.4～3.0kg，3～4月龄。随机分为4组：正常对照组(N)、高脂对照组(H)、激光治疗组(I)、舒降之治疗组(S)，每组10只，分笼喂养。N组喂普通颗粒饲料，其余各组喂1%胆固醇颗粒饲粒。 每只进食量控制在100g/d，饮水量不限，实验时间共10周。
1.2 实验方法
实验开始后，Ⅰ组即行ILLLI治疗。激光的波长为632nm，输出功率1.5～2.0mW，工作电流8mA。家兔置于特制的兔盒中，选择兔耳缘静脉，常规消毒做静脉穿刺，再经静脉穿刺针导入激光针。当露出红色光斑(直径约10～15mm)时，用胶布固定激光针，使其与血管壁走向保持平行。每日照射1次，每次60min，10次为1疗程，间隔10天，共3个疗程。其余各组同样做耳缘静脉穿刺， 但无激光输出。 S组加舒降之2.5mg/kg*D溶于蒸馏水10ml中灌胃。其余3组每天也用蒸馏水10ml灌胃1次。
, 百拇医药 1.3 样本处理
实验开始前及实验第10周由兔耳中央动脉抽血。全血置于肝素钠抗凝管中混均抗凝，低速离心分离血浆，-20℃冰箱保存备测LPO、SOD,采用氧化脂质TAB不除蛋白快速测定LPO。采用羟胺发色法测定SOD。实验第10周末棒杀动物后， 立即在新鲜主动脉弓病变部位或病变好发部位取材，剥去外膜，切成1mm×1mm×1mm大小，依次用2. 5%戊二醛，1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，再用环氧树脂812包埋， 经超薄切片和醋酸铀，枸橼酸铅双染色后，用日立H-600A型透射电镜观察分析，加速电压15kV。
1.4 统计学处理
结果参数以均数±标准差(
)表示。各组前后比较用配对t 检验。4组间比较用F检验，继以q检验。以P<0.05为有显著性差异。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 家兔血浆SOD，LPO的变化
见附表。
附表 各组家兔血浆LPO、SOD结果比较(
)分组
LPO(mmol/L)
SOD(μ/mg)
实验前
实验后
实验前
, 百拇医药
实验后
N组
7.69±2.11⑤
8.25±2.25
2.41±2.05⑤
22.71±4.33
H组
18.33±3.66②⑦
8.21±1.44
13.45±2.93②⑦
21.97±2.73
, 百拇医药
I组
13.38±3.45②③⑦
9.87±2.77
18.01±3.63②③⑦
20.04±4.51
S组
12.94±2.39②③⑦
8.34±0.94
21.42±3.51①③⑤
19.98±3.67
注：与N组比①P<0.05, ②P<0.01;与H组比③P<0.01。与S组比④P<0.05。同组实验前后比较⑤P>0.05，⑥P<0.05，⑦P<0.001。
, http://www.100md.com
2.2 透射电镜观察
N组：内皮细胞呈扁平状，细胞质中有吞饮小泡和少量微丝。 内皮下层和内弹性膜完整，中膜平滑肌细胞内有较多线粒体，形态规则，排列整齐。未见脂肪空泡。
H组：内皮细胞胞质中含有大量大小不等的脂滴，吞饮小泡和微丝明显减少。 内皮细胞下间隙明显扩张，可见平滑肌细胞、胶原纤维及絮状物。内皮下层平滑肌细胞含有数量不等的脂肪空泡，内弹力膜多不完整。中膜平滑肌细胞数量明显减少，排列紊乱，细胞内出现脂质堆积，胞浆内有较多脂滴及吞噬颗粒(图1)。
I组：内皮细胞，内皮下层及内弹性膜损伤轻微，脂质中含有少量脂滴；平滑肌细胞膜损伤轻微，胞质含有少量脂滴，平滑肌细胞及成纤维损伤减轻，胞浆脂肪空泡较高脂组明显减少，细胞间质胶原纤维成份轻度增多(图2)。
S组：主动脉超微结构变化与I组相似。
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3 讨论
3.1 ILLLI对兔血浆SOD、LPO的影响
生物膜上的不饱和脂肪酸与活性氧发生连锁反应，产生LPO。在产生自由基的局部激发 脂质过氧化，即可扩展到整个膜， 增加损伤范围。这种不可控制的生物膜的过氧化，能极大损伤膜结构和功能，导致内皮细胞死亡。在人和动物的动脉粥样斑块中均发现了LPO的终产物丙二酰二醛， 斑块内的丙二酰二醛明显高于非斑块区。主动脉壁内的超氧化物歧化酶活性下降。在冠心病患者中还发现，血浆中SOD下降，LPO明显升高，LPO与SOD呈负相关，表明自由基清除剂活性下降是导致LPO升高的重要病因〔3〕。LPO的大量产生可通过几条途径影响动脉粥样硬化的形成〔4〕：①膜流动性减低；②丙二酰二醛能与膜蛋白发生交联反应，膜结构和功能受到极大破坏；③LPO 能修饰LDL和HDL，促进单核细胞，平滑肌细胞等对LDL的吞噬，减少胆固醇的清除， 加速泡沫细胞形成；④LPO能直接损伤内皮细胞和平滑肌细胞，活化血小板，释放5-羟色胺等生物活性物质，导致血管痉挛和血栓形成，并促发动脉粥样硬化。大量研究表明〔5,6〕，ILLLI治疗后可使血浆LPO降低，SOD升高。ILLLI抗LPO、自由基作用机制可能在于使血脂、膜脂代谢正常化，激活SOD，提高血浆铜蓝蛋白及内源性维生素E水平，降低丙二醛毒性等，由此解除了脂质过氧化对生物膜系统的破坏，使内皮细胞恢复正常功能。
, 百拇医药
图1 内皮细胞胞质中含有大小不等的
脂滴及吞噬颗粒(×5000)
图2 内皮细胞胞质中含有少量脂滴(×5000)
本研究发现，高脂饲料可使家兔血浆LPO浓度显著升高，而SOD浓度明显降低(P<0.05～0.01)。ILLLI和舒降之治疗后，均可有效地减少LPO生成，升高SOD浓度(P<0.01)。这表明ILLLI具有减少脂质过氧化反应，对动脉粥样硬化的起始环节进行阻滞，发挥抗动脉粥样硬化作用。
3.2 ILLLI对兔主动脉内膜超微结构的影响
, http://www.100md.com 本研究结果显示，ILLLI 治疗组家兔主动脉超微结构与高脂组比有以下特点：①泡沫细胞明显减少；②平滑肌细胞内无脂滴及胆固醇结晶；③内皮细胞下间隙有明显扩张，但无平滑肌细胞，泡沫细胞和胶原纤维；④内弹力膜完整。ILLLI预防动脉粥样硬化可能与以下因素有关：①降低血脂水平；②防止脂质过氧化；③改善血管内皮功能。本研究结果支持以上推断。具体机制有待于进一步研究。
4 参考文献
1 周玖，陈瑗.内皮细胞脂质过氧化损伤与动脉粥样硬化. 中华心血管杂志，1990,1:248.
2 Feher J. Free Radical Reaction in Medicine. Springer Verlag. 1987.71.
3 周本财. 原发性高血压和冠心病患者血小板内抗氧化活性和过氧化反应的实验观察.中华血液学杂志,1992,9:466.
, 百拇医药
4 王洪武.LPO、PGI2/TXA2与动脉粥样硬化的研究进展.心血管病学进展. 1993,14(5):284～287.
5 Vakhliaev VD， et al. The effect of transvenous laser therapy on lipid peroxidation function in patients with ischemic heart disease. Cardiologia，1992,32(7-8):43.
6 李忠如，宋爽.弱激光照射对人体血清超氧化物歧化酶及丙二醛的影响.中国激光医学杂志,1993.2(1):38～40.
*本课题受河南省教委资助
收稿日期：1997-11-11, http://www.100md.com(陈长英1 刘瑞云1 黄振文1)